藜麥種子黃酮含量的快速檢測(cè)技術(shù)研究

董艷輝于宇鳳李亞莉趙興華王亦學(xué)任 元王 鑫賀文洋任永康劉 江曹秋芬秦永軍

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；2農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；3山西省投資咨詢與發(fā)展規(guī)劃院，太原 030013；4山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801；5左權(quán)縣園林局，左權(quán) 032600；6山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031）

藜麥種子黃酮含量的快速檢測(cè)技術(shù)研究

董艷輝1，2于宇鳳1李亞莉1趙興華1王亦學(xué)1任 元2王 鑫3，4賀文洋5任永康6劉 江1曹秋芬1，2秦永軍1，2

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；2農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；3山西省投資咨詢與發(fā)展規(guī)劃院，太原 030013；4山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801；5左權(quán)縣園林局，左權(quán) 032600；6山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031）

為了研究藜麥種子黃酮含量與超微弱發(fā)光之間的關(guān)系，本研究對(duì)篩選的90份藜麥材料進(jìn)行了超微弱發(fā)光研究和黃酮含量測(cè)定，通過(guò)二者的相關(guān)性分析得出藜麥種子的黃酮含量與超微弱發(fā)光值之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.965，P＜0.01），因此利用超微弱發(fā)光值來(lái)反映藜麥種子黃酮含量高低的方法是可行的，利用該技術(shù)可以快速、無(wú)損傷地對(duì)藜麥種子黃酮含量的高低進(jìn)行初期篩選，為藜麥育種工作節(jié)省大量的人力、物力，加速育種進(jìn)程。

藜麥；超微弱發(fā)光；黃酮

超微弱發(fā)光（UWL）是生命體在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)的一種表現(xiàn)形式，與生物系統(tǒng)的氧化代謝、細(xì)胞分裂和死亡、病變以及生長(zhǎng)調(diào)控等許多的基本過(guò)程有著內(nèi)在的聯(lián)系，特別是與生物機(jī)體內(nèi)的生化生理和病理狀態(tài)密切相關(guān)，能夠靈敏地反映生物有機(jī)體的生理生化反應(yīng)狀態(tài)，近年來(lái)生物超弱發(fā)光的研究已成為生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和生物物理學(xué)等學(xué)科交叉領(lǐng)域的新生長(zhǎng)點(diǎn)。在種子品質(zhì)檢測(cè)各種方法中，物理方法快速簡(jiǎn)便，對(duì)種子無(wú)損且用種量少[1]。它不僅對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域有重大的科學(xué)意義，同時(shí)也在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有很廣泛的應(yīng)用前景[2-4]。

作為生命過(guò)程的一個(gè)極其靈敏的指示器，UWL在植物種子活力檢測(cè)、 植物抗逆性鑒定、果實(shí)品質(zhì)無(wú)損檢測(cè)等方面成為一種新的檢測(cè)方法[5]。但是，有關(guān)UWL與植物種子品質(zhì)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。藜麥具有獨(dú)特的、豐富全面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在國(guó)際市場(chǎng)上有著良好的知名度，國(guó)內(nèi)發(fā)展也非常迅速[6]，其富含黃酮，而黃酮可有效清除體內(nèi)的氧自由基，降低膽固醇；傳統(tǒng)方法對(duì)藜麥黃酮含量的測(cè)定耗時(shí)耗力，給育種工作帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)，而采用UWL方法進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定快速、簡(jiǎn)單，且對(duì)種子無(wú)損。本研究以山西省農(nóng)科院生物中心本土化種植3年、農(nóng)藝性狀較好的的藜麥材料為研究對(duì)象，在進(jìn)行超微弱發(fā)光研究的基礎(chǔ)上測(cè)定其黃酮含量，通過(guò)研究二者之間的相關(guān)性，以期摸索出一條快速檢測(cè)藜麥黃酮含量（或者綜合品質(zhì)）且不損傷樣品的方法，為藜麥育種者初期進(jìn)行藜麥優(yōu)良材料的篩選提供一種快速、簡(jiǎn)便的方法，節(jié)省人力、物力，加速藜麥育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料 選取山西省農(nóng)科院生物中心本土化種植3年、農(nóng)藝性狀較好的3個(gè)藜麥品種（晉灰藜-1、晉紅藜-1、晉黑藜-1）為供試材料，2015年在本中心實(shí)驗(yàn)室盆栽種植，每個(gè)品種30株，共90份材料，編號(hào)1～90。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本試驗(yàn)以蘆丁作為藜麥總黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品。準(zhǔn)確稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用70%的乙醇溶解并定容至100mL，使其濃度為100μ g/mL。將蘆丁溶液用70%的乙醇稀釋成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μ g/mL，各取1mL于試管中，加70%的乙醇1mL和0.3mL 5%的NaNO2，混勻后放置6min，然后加入0.3mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6min。最后再加入2mL 4%NaOH，搖勻，放置10min。在510nm處測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以濃度（C，mg/mL）為縱坐標(biāo)，吸光值（A，510nm）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得到回歸方程：C=0.1207A+0.0008，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9998（圖1）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.2 黃酮提取方法 藜麥種子黃酮的提取參考孫雪婷等[7]的方法。每份材料稱取藜麥種子2g，用粉碎機(jī)充分粉碎后過(guò)0.5mm 孔篩篩選，裝入干燥器皿中備用，分別精確稱取藜麥面粉各1g于平底錐形瓶中（回流裝置），錐形瓶中加入30mL 80%的乙醇，將錐形瓶放置于60℃的水浴鍋中，浸泡提取60min。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 取1mL提取液于25mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法處理后用90%的乙醇定容至刻度。然后吸取適量黃酮提取液于石英比色杯中，510nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)，計(jì)算總黃酮含量。

其中，W為藜麥粉重量（g），C為蘆丁濃度（mg/g）。

1.2.4 藜麥種子的超微弱發(fā)光研究 各單株取子粒飽滿的種子300粒，按隨機(jī)取樣的方法進(jìn)行順序測(cè)定，然后用超微弱發(fā)光儀測(cè)量其超微弱發(fā)光，所得數(shù)據(jù)以單株為單位求平均值。

測(cè)量?jī)x器采用中國(guó)科學(xué)院生物物理所的BPCL-K超微弱發(fā)光分析儀。試驗(yàn)前將儀器預(yù)熱1h，使本底穩(wěn)定，靈敏度（高壓）調(diào)至-1kV，溫度控制在20±0.3℃，控制周圍噪音，然后將樣品置于樣品室中暗適應(yīng)200s后開(kāi)始測(cè)量其自身發(fā)光強(qiáng)度。每次測(cè)量100s，間隔5s計(jì)數(shù)一次，記錄光子總數(shù)，單個(gè)樣品連續(xù)測(cè)量10次。每個(gè)樣品測(cè)量前先測(cè)1次本底，用10次測(cè)量值的平均值減本底值作為自身發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)量值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析 數(shù)據(jù)處理采用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18以及數(shù)據(jù)處理繪圖工程軟件Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥種子黃酮含量和超微弱發(fā)光綜合對(duì)比 種子發(fā)出的光子數(shù)多少與種子內(nèi)部的自由基濃度有關(guān)，自由基濃度越高，種子發(fā)出的光子數(shù)量也越多，而黃酮具有抗氧化的功能，能夠清除自由基，藜麥種子內(nèi)生物類黃酮含量的多少與自由基的濃度有著直接的關(guān)系，進(jìn)而與藜麥種子發(fā)出的光子數(shù)量有關(guān)，由圖2可以直觀地看出：2組折線的同一組X（同一序號(hào)）值所對(duì)應(yīng)的2組Y（黃酮含量、光子數(shù)）值，基本上都是波峰對(duì)應(yīng)波谷，即黃酮含量較高的樣品其超微弱發(fā)光值低，黃酮含量低的樣品超微弱發(fā)光值較大。

圖 2 藜麥種子黃酮含量與超微弱發(fā)光雙坐標(biāo)圖

2.2 藜麥黃酮含量和超微弱發(fā)光的相關(guān)和顯著性分析 生物類黃酮具有抗氧化功能，能夠有效清除體內(nèi)的自由基（Free Reaical）及毒素，而自由基復(fù)合反應(yīng)是超微弱發(fā)光的主要來(lái)源之一，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，對(duì)藜麥種子內(nèi)生物類黃酮的含量和藜麥種子的超微弱發(fā)光（與自由基濃度正相關(guān)）進(jìn)行量化分析，對(duì)所得數(shù)據(jù)（黃酮含量、超微弱發(fā)光）進(jìn)行Pearson（皮爾生）乘積矩相關(guān)系數(shù)分析，這是一個(gè)范圍在-1.0～1.0 之間（包括-1.0 和1.0 在內(nèi)）的無(wú)量綱指數(shù)，能夠反映兩個(gè)數(shù)據(jù)集合之間的線性相關(guān)程度。如果乘積矩相關(guān)系數(shù)r為正數(shù)，則說(shuō)明這兩組數(shù)據(jù)集合之間是正相關(guān)，如果乘積矩相關(guān)系數(shù)r為負(fù)數(shù)，則說(shuō)明這兩組數(shù)據(jù)集合之間是負(fù)相關(guān)。

Pearson（皮爾生）乘積矩相關(guān)系數(shù)r的公式為：

其中，x和y是樣本平均值 AVERAGE（array1）和 AVERAGE（array2）。

對(duì)2組數(shù)據(jù)集合進(jìn)行Pearson（皮爾生）乘積矩相關(guān)性分析可知，二者表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)性（P=0.01，相關(guān)系數(shù)r=-0.956**），即藜麥黃酮含量越高，超微弱發(fā)光值越低；超微弱發(fā)光值越低，藜麥黃酮含量越高，該結(jié)果與圖2直觀結(jié)果基本一致。由此可以得出超微弱發(fā)光值可以作為反映藜麥種子黃酮含量（綜合品質(zhì)）的有效指標(biāo)。

3 結(jié)論與討論

黃酮能夠阻斷自由基鏈反應(yīng)，因此種子黃酮類化合物的含量理論上與自由基的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，而自由基的數(shù)量與發(fā)出的光子數(shù)呈正相關(guān)，因此黃酮含量應(yīng)該與發(fā)出的光子數(shù)呈負(fù)相關(guān)，本研究表明：藜麥種子的黃酮含量與其超微弱發(fā)光值呈極顯著負(fù)相關(guān)性，因此通過(guò)超微弱發(fā)光技術(shù)對(duì)藜麥黃酮類化合物含量進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)的方法是可行的。該技術(shù)可以解決藜麥常規(guī)育種過(guò)程中對(duì)藜麥黃酮含量的檢測(cè)步驟繁瑣、樣品量大且比較耗時(shí)等問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外研究者主要集中在利用該技術(shù)對(duì)種子、果實(shí)等的生命活動(dòng)強(qiáng)弱以及種子生長(zhǎng)發(fā)育的檢測(cè)方面開(kāi)展研究，對(duì)種子的品質(zhì)檢測(cè)方面的研究比較少，本研究發(fā)現(xiàn)的超微弱發(fā)光檢測(cè)法可以較為準(zhǔn)確地反映藜麥種子黃酮含量，而且檢測(cè)過(guò)程迅速、簡(jiǎn)單、對(duì)種子無(wú)損，一定程度上滿足了快速無(wú)損檢測(cè)的要求，但由于超微弱發(fā)光檢測(cè)技術(shù)靈敏度較高，對(duì)周圍環(huán)境的要求比較高，導(dǎo)致精確度不高，因此在應(yīng)用的過(guò)程中需要綜合考慮各種因素，以保證檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。今后，通過(guò)進(jìn)一步增加樣品的數(shù)量和樣品的種類對(duì)該技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和完善，同時(shí)運(yùn)用多種物理手段進(jìn)行檢測(cè)，相互補(bǔ)充，以達(dá)到最終結(jié)果的準(zhǔn)確、精確，使該技術(shù)在種子品質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域能夠廣泛的應(yīng)用。

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2017-03-28）

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金（YBSJJ1611）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2016zyzx51）；農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)子項(xiàng)目；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（YGG17065）

秦永軍