不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻的生長和油脂、花生四烯酸積累的影響

吳曼曼，雷學(xué)青，高保燕，王飛飛，黃羅冬，李愛芬，張成武

(暨南大學(xué) 水生生物研究中心，生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

油脂化學(xué)

不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻的生長和油脂、花生四烯酸積累的影響

吳曼曼，雷學(xué)青，高保燕，王飛飛，黃羅冬，李愛芬，張成武

(暨南大學(xué) 水生生物研究中心，生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

為了提高缺刻葉球藻的花生四烯酸(AA)產(chǎn)量，分別研究了不同光強(qiáng)、初始氮濃度及更換培養(yǎng)基的方式對缺刻葉球藻的生長和油脂、AA積累的影響。結(jié)果表明：同等光強(qiáng)下，高氮條件更有利于生物量的積累，但總脂含量和AA含量較低。在雙側(cè)高光的基礎(chǔ)上更換培養(yǎng)基后，最高生物量增至7.36 g/L(高氮換高氮)，最高總脂含量和AA含量分別達(dá)到47.74%和6.18%(低氮換無氮)。對比發(fā)現(xiàn)，高氮換高氮最有利于缺刻葉球藻的生長，但AA產(chǎn)率相對低，僅為7.0 mg/(L·d)，而高氮換無氮、低氮換低氮、低氮換無氮3種更換方式均能提高AA產(chǎn)率，產(chǎn)率分別為14.0、15.3、17.0 mg/(L·d)。研究表明，缺刻葉球藻是生產(chǎn)AA的潛力藻株。

缺刻葉球藻; 生物量; 油脂; 花生四烯酸

花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，屬于ω-6系列脂肪酸。AA是人體生長發(fā)育必需的多不飽和脂肪酸，對視神經(jīng)和腦功能的發(fā)育至關(guān)重要，一旦缺乏會造成不可逆轉(zhuǎn)的功能性損害[1-4]。Piomelli等[5]在研究AA活性時發(fā)現(xiàn)，AA及其代謝物對cAMP和cGMP等第二信使的功能有促進(jìn)和放大作用，例如前列腺素可使腺苷酸環(huán)化酶活化，從而提高cAMP的含量[6]。陳丁丁[7]在研究海綿的神經(jīng)傳導(dǎo)時也發(fā)現(xiàn)AA的代謝產(chǎn)物具有第二信使的作用。此外，AA在疾病控制、免疫和肝膽器官代謝等領(lǐng)域也具有顯著功能[8]。

缺刻葉球藻(Lobosphaeraincisa)屬于綠藻門、共球藻綱，前期研究發(fā)現(xiàn)該藻能夠積累AA，但目前對缺刻葉球藻的生長以及藻細(xì)胞內(nèi)油脂和AA的合成與積累的相關(guān)研究尚不多見。本研究在Φ6 cm×60 cm玻璃柱狀光生物反應(yīng)器中進(jìn)行，采用改良的BG-11培養(yǎng)基，以NaNO3為氮源，探究不同光強(qiáng)、初始氮濃度及更換培養(yǎng)基的方式對缺刻葉球藻的生長和油脂、AA積累規(guī)律的影響，并利用光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)過程中藻細(xì)胞的形態(tài)、分裂方式以及不同培養(yǎng)時間下細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)積累變化的規(guī)律，以期為AA來源提供新的植物性資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

缺刻葉球藻：來自暨南大學(xué)水生生物研究中心微藻生物資源與生物技術(shù)實驗室。改良后的BG-11培養(yǎng)基：K2HPO40.04 g/L, MgSO4·7H2O 0.075 g/L, CaCl2·2H2O 0.036 g/L，Na2CO30.02 g/L, 微量元素(H3BO42.86×10-3g/L; MnCl2·4H2O 1.81×10-3g/L; ZnSO4·7H2O 2.22×10-4g/L; NaMoO4·2H2O 3.9×10-4g/L; CuSO4·5H2O 7.9×10-5g/L; Co(NO3)2·6H2O 4.94×10-5g/L), Fe-EDTA溶液(FeCl3·6H2O 3.15×10-3g/L；Na2EDTA·2H2O 4.36×10-3g/L；檸檬酸6.0×10-3g/L)。硝酸鈉、硫酸、甲醇、乙醇、正己烷、乙醚、氯仿、二甲基亞砜等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋，高速冷凍離心機(jī)，紫外分光光度計，光學(xué)顯微鏡(Olympus CX41)，冷凍干燥機(jī)，Agilent 6890N氣相色譜儀，恒溫磁力攪拌器，電子天平，恒溫干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將對數(shù)生長期的藻液低速離心后，以O(shè)D750為0.70±0.01的初始濃度接種于Φ6 cm×60 cm的玻璃柱狀光生物反應(yīng)器中，采用改良的BG-11培養(yǎng)基，以NaNO3為氮源，通入CO2體積分?jǐn)?shù)為1%的壓縮空氣進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，24 h持續(xù)光照，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，每個實驗組設(shè)置3個平行。實驗采用批量培養(yǎng)模式，光照條件分別為單側(cè)低光(100 μmol/(m2·s))、單側(cè)高光(300 μmol/(m2·s))、雙側(cè)高光(300 μmol/(m2·s))，初始氮濃度分別為高氮(17.8 mmol/L)和低氮(3.6 mmol/L)，培養(yǎng)周期15 d。為了進(jìn)一步提高缺刻葉球藻的生物量和AA產(chǎn)量，在雙側(cè)高光條件下對兩個實驗組(高氮組、低氮組)進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。在培養(yǎng)周期9 d時，分別收集高氮組(6個平行)和低氮組(6個平行)的藻液，經(jīng)低速離心濃縮后棄上清液，藻細(xì)胞用無菌水洗滌后，重新接種到新鮮培養(yǎng)基中，并保持接種濃度與更換前的藻液濃度一致。更換培養(yǎng)基的方式分別為高氮換高氮、高氮換無氮、低氮換低氮、低氮換無氮，更換后每個實驗組為3個平行并繼續(xù)培養(yǎng)12 d，整個培養(yǎng)周期為21 d。

1.2.2 藻細(xì)胞形態(tài)觀察

取新鮮藻液，制作玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并利用光學(xué)顯微鏡顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 生物量的測定

每隔24 h取10 mL藻液，用預(yù)先烘干并冷卻至恒重的混合纖維濾膜(0.45 μm)抽濾，之后置于105℃的烘箱中烘干至恒重。用單位體積藻液的干重表示生物量。

1.2.4 藻粉的制備

每隔3 d取一定量的藻液在4 000 r/min下離心5 min，收集藻泥于小塑料瓶中并置于-20℃下冷凍，冷凍干燥后貯存于4℃冰箱中。

1.2.5 總脂含量測定

參照文獻(xiàn)[9]的方法并加以改進(jìn)。稱取80～100 mg干藻粉(m0)置于放有磁性轉(zhuǎn)子的玻璃離心管中，加入2 mL二甲基亞砜-甲醇(體積比1∶9)混合溶液，50℃水浴磁力攪拌3 h后在3 000 r/min下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至烘干的玻璃小瓶中。藻渣中加入4 mL乙醚-正己烷(體積比1∶1)混合液冰浴抽提1.5 h，離心后轉(zhuǎn)移上清液至上述小瓶中。重復(fù)以上過程直至藻渣變?yōu)榛野咨?。合并的上清液中加? mL蒸餾水靜置分層。收集上清液并用氮氣吹至較小體積，轉(zhuǎn)移濃縮液至預(yù)先稱重的2 mL EP管(m1)中，用氮吹儀吹至恒重(m2)并于-20℃保存。每個樣品設(shè)置2個平行。按下式計算總脂含量和總脂產(chǎn)率：總脂含量=(m2-m1)/m0×100%，總脂產(chǎn)率=總脂含量×生物量/培養(yǎng)時間。

1.2.6 總脂組分分析

[10]的方法并加以改進(jìn)。以1.2.5提取的總脂為樣品，采用硅膠柱層析法(Ageal Technologies，Cleanert silica-SPE, 500 mg)進(jìn)行組分分離。用三氯甲烷活化層析柱后，以三氯甲烷溶解總脂樣品并上樣，分別用三氯甲烷、丙酮-甲醇混合液(體積比9∶1)和甲醇依次洗脫樣品中的中性脂(NL)、糖脂(GL)和磷脂(PL)，并分別用EP管收集，利用差重法計算中性脂、糖脂和磷脂的含量以及占總脂和干藻粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.7 脂肪酸組成分析

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取25 mg干藻粉于玻璃離心管中，加入2 mL含2% H2SO4的無水甲醇-甲苯(體積比1∶1)混合溶液和50 μL 0.5%的十七烷酸標(biāo)樣，充氬氣后80℃恒溫水浴磁力攪拌1.5 h，冷卻后加入1 mL純水和1 mL正己烷振蕩搖勻并離心，轉(zhuǎn)移上清有機(jī)相至玻璃小瓶中并氮氣吹干，再用200 μL正己烷轉(zhuǎn)移至氣相色譜樣品瓶中，利用氣相色譜儀分析樣品中脂肪酸組成，并根據(jù)面積歸一化法計算脂肪酸相對含量。按下式計算藻粉中某脂肪酸含量(干基)：某脂肪酸含量=某脂肪酸相對含量×250×10-3/(C17∶0相對含量×25)×100%。總脂肪酸(總脂或AA)產(chǎn)率以單位培養(yǎng)時間內(nèi)單位體積藻液中總脂肪酸(總脂或AA)的干重表示，計算公式為：總脂肪酸(總脂或AA)產(chǎn)率=收獲時藻液的生物量×收獲時總脂肪酸(總脂或AA)含量/培養(yǎng)時間。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 和Origin 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺刻葉球藻的細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式和油體形成

用光學(xué)顯微鏡對缺刻葉球藻進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示：缺刻葉球藻細(xì)胞大小一般在4～15 μm之間，有時可達(dá)25 μm，形態(tài)近球形，細(xì)胞表面光滑，胞內(nèi)葉綠體呈周生裂葉狀。細(xì)胞分裂時形成2、4、8、16個甚至32個似親孢子，但以4個和8個為多。此外,缺刻葉球藻還可產(chǎn)生大量游動孢子進(jìn)行繁殖，游動孢子呈梨形，具有等長雙鞭毛。在培養(yǎng)前期，缺刻葉球藻胞內(nèi)物質(zhì)分布均勻，到達(dá)培養(yǎng)中期時胞內(nèi)逐漸聚集形成數(shù)量較多的小油體，在培養(yǎng)后期小油體逐漸增大并互相融合從而占據(jù)胞內(nèi)大部分空間。

2.2 不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻生長的影響(見圖1)

由圖1可見，同等光強(qiáng)下，高氮組的生長速率和最終生物量均大于低氮組；隨著光強(qiáng)增加，高氮組和低氮組的生長速率均明顯增大，在雙側(cè)高光、高氮的條件下生物量可達(dá)到5.1 g/L。更換培養(yǎng)基可以明顯提高缺刻葉球藻的生物量，生物量分別達(dá)到7.36 g/L(高氮換高氮)、7.29 g/L(高氮換無氮)、6.47 g/L(低氮換低氮)、5.19 g/L(低氮換無氮)。結(jié)果表明，同一氮濃度下缺刻葉球藻的生物量與光強(qiáng)呈正向相關(guān)，在一定范圍內(nèi)生物量可隨光強(qiáng)的增大而增加。高光強(qiáng)和高氮濃度有利于缺刻葉球藻生物量的積累，更換培養(yǎng)基能夠明顯促進(jìn)缺刻葉球藻的生長。嚴(yán)美姣等[12]研究光強(qiáng)對小球藻和斜生柵藻生長的影響時，也得出了類似的結(jié)論。

2.3 不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻油脂積累的影響(見圖2)

由圖2可見，隨著培養(yǎng)時間的延長，總脂含量均呈上升趨勢，在最后一天達(dá)到最大，且因光強(qiáng)和初始氮濃度的不同而有差異。同等光強(qiáng)下，低氮條件更有利于油脂積累；而相同氮濃度下，增加光強(qiáng)，油脂積累量增大。在雙側(cè)高光、低氮條件下，總脂含量可達(dá)到42.43%。4種培養(yǎng)基更換方式中，低氮換無氮總脂含量最高，為47.74%。高氮換高氮總脂含量最低，為29.59%。結(jié)果表明，光強(qiáng)和氮濃度是影響缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)油脂積累的重要因素，在一定范圍內(nèi)提高光強(qiáng)、降低氮濃度有利于缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累，而低氮換無氮的培養(yǎng)方式可以有效提高藻細(xì)胞的油脂積累量。馬若欣等[13]的研究結(jié)果也表明，在一定范圍內(nèi)提高光強(qiáng)可以促進(jìn)微藻細(xì)胞積累油脂，但是當(dāng)光強(qiáng)過高時則不利于油脂積累，這可能是因為過高的光強(qiáng)限制了微藻的生長。本研究發(fā)現(xiàn)低氮條件有利于缺刻葉球藻積累油脂，這與程秀頎等[14]對大真眼點藻的研究以及陳小妹[15]對尖狀柵藻的研究結(jié)果是一致的。

2.4 不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻主要脂肪酸組成及含量的影響(見圖3)

注：a. 高氮；b. 低氮；1. 高氮換高氮；2. 高氮換無氮；3. 低氮換低氮；4. 低氮換無氮。

圖3 不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻主要脂肪酸組成及含量的影響

由圖3可見，缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)主要脂肪酸有8種，分別是棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、AA(C20∶4)和二十碳五烯酸(C20∶5)。雙側(cè)高光、低氮條件下總脂肪酸含量較高，可達(dá)30.6%，而更換培養(yǎng)基后總脂肪酸含量分別為19.8%(高氮換高氮)、26.9%(高氮換無氮)、31.4%(低氮換低氮)和36.8%(低氮換無氮)。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)增加光強(qiáng)、降低氮濃度以及低氮換無氮的培養(yǎng)方式均有利于缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)主要脂肪酸的積累。

2.5 不同培養(yǎng)條件對缺刻葉球藻AA積累的影響(見圖4)

由圖4可見，隨著光強(qiáng)增加，所有實驗組中AA含量都增加，但同等光強(qiáng)下低氮條件更有利于AA的積累。在雙側(cè)高光、低氮條件下，AA的含量可達(dá)到6.49%，相比于單側(cè)低光、高氮條件下增加了5.6個百分點。在雙側(cè)高光的條件下更換培養(yǎng)基，最終AA的含量分別為2.00%(高氮換高氮)、4.02%(高氮換無氮)、5.52%(低氮換低氮)和6.18%(低氮換無氮)。因此，在雙側(cè)高光、低氮條件下有利于AA的積累，而在4種更換培養(yǎng)基方式中，低氮換低氮和低氮換無氮較有利于AA的積累。

2.6 AA在缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)各總脂組分中的分布

為了進(jìn)一步了解AA在油脂組分中的分布情況，對總脂含量較高的雙側(cè)高光、低氮實驗組進(jìn)行總脂組分分級，并對各組分進(jìn)行脂肪酸分析，結(jié)果見圖5。

圖5 缺刻葉球藻細(xì)胞中總脂組分含量與各組分中AA含量

由圖5可知，總脂組分分級可得磷脂(PL)、糖脂(GL)和中性脂(NL)，培養(yǎng)前期藻細(xì)胞內(nèi)中性脂和糖脂含量較高，培養(yǎng)過程中中性脂不斷積累，而糖脂和磷脂的含量不斷下降，最終中性脂、糖脂和磷脂占總脂的比例分別為90.0%、6.8%和3.2%。另外隨培養(yǎng)時間延長，AA在中性脂中所占比重逐漸增加，而在糖脂和磷脂中的比重卻逐漸減少，最終AA在各脂組分中的比重分別為99.5%(中性脂中)、0.28%(糖脂中)和0.22%(磷脂中)。上述結(jié)果表明，在雙側(cè)高光、低氮條件下，隨著培養(yǎng)時間延長缺刻葉球藻細(xì)胞內(nèi)中性脂逐漸積累，而幾乎所有的AA都儲存在中性脂中。

2.7 不同培養(yǎng)條件下缺刻葉球藻的總脂、總脂肪酸和AA產(chǎn)率(見圖6)

由圖6可見，在同一氮濃度下，增加光強(qiáng)，總脂、總脂肪酸和AA的產(chǎn)率可提高。對比發(fā)現(xiàn)，高氮換高氮的培養(yǎng)方式AA產(chǎn)率較低，僅為7.0 mg/(L·d)，而高氮換無氮、低氮換低氮、低氮換無氮的培養(yǎng)方式均有利于AA產(chǎn)量的提高，產(chǎn)率均達(dá)到14.0 mg/(L·d)以上，分別為14.0、15.3、17.0 mg/(L·d)。

3 結(jié) 論

本實驗探究了不同光強(qiáng)、初始氮濃度和更換培養(yǎng)基方式對缺刻葉球藻的生長和油脂、花生四烯酸(AA)積累規(guī)律的影響，通過增加光強(qiáng)、降低氮濃度和更換培養(yǎng)基，逐步提高了缺刻葉球藻的生物量和AA含量，使得最終AA產(chǎn)率達(dá)到17.0 mg/(L·d)。因此，缺刻葉球藻是一株可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)花生四烯酸的潛力藻株，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值。

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Effects of different culture conditions on the growth and accumulations of lipid and arachidonic acid ofLoboshpaeraincisa

WUManman,LEIXueqing,GAOBaoyan,WANGFeifei,HUANGLuodong,LIAifen,ZHANGChengwu

(DepartmentofEcology,AquaticResearchCenter,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

In order to increase the yield ofLobosphaeraincisa, the effects of light intensity, initial nitrogen concentration and medium replacement on the growth and accumulations of lipid and arachidonic acid were investigated. The results showed that under the same light intensity,L.incisagot higher biomass under the condition of high nitrogen concentration, while the contents of total lipid and arachidonic acid were lower. Replacing the medium under the bilateral high light condition, the highest biomass reached 7.36 g/L with the medium raplacement from high nitrogen concentration to high nitrogen concentration. In contrast, the highest contents of total lipid and arachidonic acid were 47.74% and 6.18% respectively which got through replacing the low nitrogen concentration medium with the nitrogen free medium. In conclusion, the cultivation partten of changing from high nitrogen concentration to high nitrogen concentration was the most benificial to the growth ofL.incisa, but the productivity of arachidonic acid was only 7.0 mg/(L·d). However, other cultivation parttens (replacing high nitrogen concentration with nitrogen free, replacing low nitrogen concentration with low nitrogen concentration, replacing low nitrogen concentration with nitrogen free) promoted the accumulation of arachidonic acid, and the productivities were 14.0, 15.3, 17.0 mg/(L·d), respectivety. The research indicated thatL.incisawas a potential strain for the production of arachidonic acid .

Lobosphaeraincisa; biomass; lipid; arachidonic acid

2017-01-14；

2017-03-14

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目(2013AA065805)；自然科學(xué)基金(31170337)；廣東省低碳專項(2011-051)；珠海市科技重大項目(PB20041018)；珠海市科技攻關(guān)項目(PC20081008)

吳曼曼(1991)，女，碩士研究生，研究方向為微藻生物技術(shù)(E-mail)603097604@qq.com。

張成武，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)tzhangcw@jnu.edu.cn。

TS222;Q815

A

1003-7969(2017)05-0054-06