幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)人牙齦組織細(xì)胞凋亡的影響

黃 珊， 賴仁發(fā)， 鐘麗珍

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510632)

幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)人牙齦組織細(xì)胞凋亡的影響

黃 珊， 賴仁發(fā)△， 鐘麗珍

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察正常牙齦組織中幽門(mén)螺桿菌(Hp)的感染情況及其對(duì)人牙齦組織細(xì)胞凋亡的影響。方法: 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)30例健康牙齦組織中Hp感染情況，應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)牙齦組織中的細(xì)胞凋亡指數(shù)，分析Hp對(duì)牙齦組織的毒性作用。結(jié)果: PCR檢測(cè)的30名患者，Hp陽(yáng)性率為40%。在TUNEL結(jié)果中，可見(jiàn)Hp陽(yáng)性組有大量棕色凋亡細(xì)胞，部分細(xì)胞核固縮成團(tuán)或核膜周圍邊集成環(huán)狀。而正常對(duì)照組中陽(yáng)性凋亡細(xì)胞較Hp感染組明顯偏低，2組細(xì)胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論: Hp感染可能是引起牙齦組織細(xì)胞凋亡的因素之一。

牙齦組織； 幽門(mén)螺桿菌； 細(xì)胞凋亡

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致口腔異味、牙松動(dòng)移位、甚至牙脫落等并發(fā)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為牙菌斑是引發(fā)該疾病的始動(dòng)因子，通過(guò)毒力因子或介導(dǎo)不同介質(zhì)引起牙周組織細(xì)胞凋亡、壞死等形態(tài)與性質(zhì)的異常。由于口腔與胃腸道同屬消化系統(tǒng)，其黏膜性狀多有相似之處，而幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃腸道的重要致病菌，近些年在口腔牙周袋內(nèi)也多次分離檢測(cè)到。因此，不少文獻(xiàn)推測(cè)口腔幽門(mén)螺桿菌與牙周組織致病相關(guān)。Sudhakar等[1]研究顯示口腔衛(wèi)生差的患者，牙菌斑內(nèi)Hp的陽(yáng)性率顯著增高。2010年，Song等[2]檢測(cè)42名消化系統(tǒng)不適的患者口腔多部位Hp，發(fā)現(xiàn)牙菌斑中Hp 陽(yáng)性率可達(dá)97%。然而，由于口腔Hp相對(duì)濃度較低，僅在齦溝液、唾液或牙菌斑中取樣檢測(cè)有一定難度，且隨著取樣位點(diǎn)的不同，其陽(yáng)性率也多有不同。因此，常有與以上研究矛盾的結(jié)果出現(xiàn)。甚至有學(xué)者認(rèn)為，幽門(mén)螺桿菌是口腔的正常菌群之一，并無(wú)治療的意義[3]。幽門(mén)螺桿菌的口腔致病性還在爭(zhēng)議中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較Hp感染情況及Hp陽(yáng)性與陰性兩組牙齦組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)，推測(cè)Hp的存在是否對(duì)牙周組織產(chǎn)生影響。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司)；組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；烤箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)儀器有限公司)；水浴鍋(天力醫(yī)療器械有限公司)；脫色搖床(北京市六一儀器廠)；渦旋混合器(天悅電子)；倒置熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)(Nikon)；ABI9700 PCR擴(kuò)增儀(ABI)；TUNEL試劑盒(Roche)

其它：無(wú)水乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、破膜液、雙氧水、甲醇、蘇木素染液、鹽酸、氨水、中性樹(shù)膠、DAB顯色劑等均為國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。

2 標(biāo)本來(lái)源

選擇2016年9月～2017年2月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科因牙折須行冠延長(zhǎng)手術(shù)的患者30例，男12例，女18例，年齡25～40歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)牙周探診深度<3 mm，無(wú)附著喪失和明顯炎癥存在；(2)X線片示無(wú)牙槽骨吸收。排除標(biāo)準(zhǔn):3個(gè)月內(nèi)服用抗生素及鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑等胃藥者及患有其它全身性系統(tǒng)疾病者。

進(jìn)行冠延長(zhǎng)的患者局麻下切除頸圈2 mm以上牙齦組織送檢。每個(gè)樣本切斷成2份。1份直接放入高溫消毒過(guò)的無(wú)菌Eppendorf管中，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)；1份經(jīng)中性甲醛液常溫下固定，用于TUNEL檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 PCR技術(shù)檢測(cè)牙齦組織Hp (1)DNA 提?。簩?shí)驗(yàn)樣品和10 μL PK Solution、200 μL Lysis Buffer于離心管混合，振蕩5～10 s；56 ℃溫浴10 min；加入200 μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻5～10 s；將混勻的液體轉(zhuǎn)移至一只套有收集管的Spin column上。8 000×g離心1 min，棄去套管內(nèi)的液體；加入500 μL WB Buffer，10 000×g離心60秒；加入700 μL Wash Buffer上，10 000×g離心60 s，棄廢液；再將Spin column放回接液管上，13 000×g離心2 min；將Spin column轉(zhuǎn)移到一只干凈的1.5 mL離心管，向離心柱內(nèi)加100 μL Elution Buffer，靜置1 min，13 000×g離心1 min，離心管內(nèi)液體即為基因組DNA，-20 ℃保存。(2)PCR檢測(cè)：在0.2 mL PCR反應(yīng)管中配制PCR反應(yīng)體系(引物序列：27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R:5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)；取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳25 min；高分辨率質(zhì)譜分析儀下觀察，若在300 bp處出現(xiàn)熒光條帶，可診斷Hp陽(yáng)性。

3.2 TUNEL技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-無(wú)水乙醇Ⅰ5 min-無(wú)水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-蒸餾水洗。切片組織修復(fù)：滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1∶9稀釋)，37 ℃溫箱中放置30 min，將玻片置于PBS (pH 7.4)中晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。滴加破膜工作液，常溫20 min，玻片置于PBS中清洗。按片子數(shù)量和組織大小取TUNEL試劑盒內(nèi)適量試劑覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫孵育2 h。清洗TUNEL試劑后，用甲醇配制的3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育組織15 min，切片稍甩干后，加適量試劑3(converter-POD)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃溫箱中孵育30 min。將玻片晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。Harris蘇木素復(fù)染3 min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

結(jié)果判斷：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯色出來(lái)的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為棕黃色。采用雙盲觀察計(jì)數(shù), 每張切片隨機(jī)選取3個(gè)陽(yáng)性染色最明顯的高倍視野(×400),計(jì)數(shù)300個(gè)以上細(xì)胞中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率, 取其平均值，即為凋亡指數(shù)(apoptotic index， AI)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PCR技術(shù)檢測(cè)牙齦組織Hp感染

本次研究采用PCR技術(shù)檢測(cè)牙齦組織，共送檢30例樣本，其中12例可呈現(xiàn)熒光條帶，即Hp檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性感染，另外18例則為Hp陰性，陽(yáng)性率為40%，見(jiàn)圖1。該結(jié)果與以往國(guó)內(nèi)外對(duì)正常牙周組織Hp陽(yáng)性率的測(cè)試結(jié)果無(wú)明顯差異，可進(jìn)行下一步分析。

2 Hp感染組和正常對(duì)照組牙齦組織中的細(xì)胞凋亡指數(shù)

將送檢樣本按Hp感染與否分為2組，經(jīng)兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)(經(jīng)方差齊性檢驗(yàn), 各組間總體方差齊性相同)，Hp感染組牙齦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕褐色, 輪廓清楚, 在Hp感染組牙齦組織中見(jiàn)多量凋亡細(xì)胞，而正常對(duì)照組牙齦組織中凋亡細(xì)胞相對(duì)較少，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The fluorescent bands of Hp (+) detected by PCR.

圖1 Hp感染PCR熒光帶

表1 Hp感染組和陰性對(duì)照組牙齦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較

Table 1.Comparison of apoptotic index (AI) in Hp positive group and Hp negative group (mean±SD)

GroupnAIHp(+)120.498±0.092Hp(-)180.207±0.053*

*P<0.05vsHp(+) group.

Figure 2.TUNEL staining in gingival tissues (×200).

圖2 牙齦組織細(xì)胞凋亡圖

討 論

1 Hp與牙周炎

口腔中的Hp是“過(guò)路菌”還是可長(zhǎng)期在口腔定植? 它是口腔疾病的致病菌，還是口腔中的正常菌群? 這些相關(guān)性問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。大多數(shù)研究認(rèn)為，Hp可能是一種條件致病菌，當(dāng)口腔環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，Hp可在其中定植，并引起各種相關(guān)性疾病。Everhart等[3]對(duì)血清Hp抗體的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)血清Hp與牙周病相關(guān)參數(shù)之間呈正相關(guān)，牙周袋內(nèi)牙菌斑為Hp的生存提供有利的為微需氧環(huán)境。在波蘭，Bielahski 等[4]通過(guò)大樣本量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)胃Hp感染率與牙周病發(fā)病率密切相關(guān)。

PCR技術(shù)作為一種分子生物學(xué)工具，其陽(yáng)性誤診率低，用于牙菌斑、唾液的檢測(cè)，可以選擇性體外擴(kuò)增，不受標(biāo)本菌量條件的影響。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，更在敏感性上得到較大提高，降低漏檢率。熒光定量PCR利用對(duì)DNA的高效擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)反映整個(gè)檢測(cè)進(jìn)程，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)標(biāo)記物濃度進(jìn)行定量分析，除此以外，相比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，熒光定量PCR操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、污染小。它已廣泛應(yīng)用于多種微生物感染的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外亦有用該方法檢測(cè)Hp的報(bào)道。Silva等[5]采用PCR方法檢測(cè)115例受試者的口腔中的Hp，根據(jù)有無(wú)胃腸道疾病和牙周疾病分為4 組，證明疾病組的Hp陽(yáng)性率顯著高于其它組，說(shuō)明Hp陽(yáng)性者更易發(fā)生牙周炎，并認(rèn)為在治療Hp相關(guān)胃腸道疾病的同時(shí)須重視清除牙菌斑。Suzuki等[6]通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)326例無(wú)消化不良癥狀患者進(jìn)行Hp檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Hp感染可能間接與牙周病導(dǎo)致的口臭有關(guān)。高靜等[7]用PCR方法檢測(cè)37例牙周炎患者口腔菌斑和含漱液中的Hp，結(jié)果顯示：尿素酶C基因和CagA基因陽(yáng)性率在牙周炎組明顯高于健康組，該實(shí)驗(yàn)亦支持Hp參與或加強(qiáng)了慢性牙周炎的致病過(guò)程。

然而，也有不少學(xué)者認(rèn)為，Hp只是過(guò)路菌，并不在口腔中長(zhǎng)期定植，其存在可能是偶居的結(jié)果。Namiot等[8]發(fā)現(xiàn)胃Hp患者天然牙菌斑的Hp檢出率為89%，但與口腔衛(wèi)生或牙菌斑的控制均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。Mravak-Stipetif 等[9]也得出了類似的結(jié)論。他們通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)各種口腔病變組織中的Hp進(jìn)行了檢測(cè)。他們從口腔內(nèi)7個(gè)不同的部位抽取標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)161例病人中僅有21例(13.04%)為陽(yáng)性，并且Hp的存在與否及狀態(tài)與診斷結(jié)果間也沒(méi)有必然的聯(lián)系。在以上反對(duì)者的研究里，口腔環(huán)境中既沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Hp聚集的優(yōu)勢(shì)區(qū)，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的存在與疾病間的必然聯(lián)系。

隨著逐步深入的幽門(mén)螺桿菌致病性研究，人們發(fā)現(xiàn)每種 Hp所表達(dá)和分泌的毒性因子都有其特殊的致病機(jī)制。Hp感染口腔后，其毒力因子是否對(duì)牙周組織具有致病作用，尚未得到證實(shí)。

2 牙周炎與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，它并不是病理?xiàng)l件下的自體損傷，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)死亡，是一種進(jìn)化保護(hù)的過(guò)程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是由一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease，caspase)家族參與進(jìn)行[11-12]。該蛋白酶分別通過(guò)外在途徑(死亡受體凋亡途徑)和內(nèi)在途徑(線粒體凋亡途徑)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞與周圍細(xì)胞群脫離，表面原有的微絨毛、細(xì)胞間連接消失，核糖體逐漸從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔擴(kuò)脹，其DNA被特征性降解為片段。在電鏡下觀察，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞可發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)上的變化，如：染色質(zhì)濃縮、核碎裂、細(xì)胞皺縮等，進(jìn)而分裂成凋亡小體被免疫細(xì)胞吞噬[13]。在口腔領(lǐng)域中，細(xì)胞凋亡紊亂被認(rèn)為是牙周炎、腫瘤、扁平苔蘚等疾病的重要發(fā)病機(jī)制[14]。

Jarnbring等[15]認(rèn)為慢性牙周炎牙周袋頂角質(zhì)細(xì)胞較少，容易在炎癥作用下發(fā)生細(xì)胞凋亡增加。牙周炎致病菌也可導(dǎo)致相關(guān)靶細(xì)胞凋亡而影響牙周炎的進(jìn)展過(guò)程。馮利等[16]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒素誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化并促進(jìn)細(xì)胞凋亡是侵襲性牙周炎的發(fā)病機(jī)制之一。Ekuni等[17]采用TUNEL法給牙周炎大鼠齦溝上皮細(xì)胞染色，發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞發(fā)生大量細(xì)胞凋亡。Gamonal等[18]在人慢性牙周炎牙齦組織中同樣檢測(cè)出降解DNA片段、及caspase-3等的表達(dá)。有體外細(xì)胞培養(yǎng)和病理組織切片發(fā)現(xiàn)，牙周組織損傷過(guò)程伴隨細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制尚不清楚[18-20]。這些結(jié)果均表明，牙周組織的細(xì)胞凋亡與牙周炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

3 Hp與細(xì)胞凋亡

Hp可分泌多種毒力因子，每種毒力因子的毒性都不相同。有學(xué)者通過(guò)胃黏膜組織Hp的研究發(fā)現(xiàn)，Hp特有的IV型分泌系統(tǒng)將CagA注入宿主細(xì)胞，從而激活各種信號(hào)酶，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響細(xì)胞的信息通路傳導(dǎo)，引起病理性細(xì)胞應(yīng)答，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等變化。幾乎所有的Hp菌株都有VacA基因，其可作為單一致病因子使哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞發(fā)生多種明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)[21]。Galmiche 等[22]研究發(fā)現(xiàn)HPVacA通過(guò)作用于線粒體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。編碼HpVacA的基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)后，能遷移到線粒體基質(zhì)。據(jù)此推斷，表達(dá)VacA基因的HP入侵哺乳動(dòng)物后，可通過(guò)毒素活性調(diào)節(jié)線粒體膜通透性[23]，從而促進(jìn)細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞漿，并活化相關(guān)因子，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。

有學(xué)者研究Hp感染與整合素β1之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Hp促進(jìn)細(xì)胞凋亡有2種途徑，一種是毒力因子直接作用于宿主細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一種是引起可抑制細(xì)胞凋亡的整合素β1的表達(dá)下降。研究證明，整合素β1亞基可與含Arg-Gly-Asp(RGD)序列的Hp的IV型分泌系統(tǒng)蛋白組分特異性結(jié)合，通過(guò)介導(dǎo)毒性蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡、增殖等生物學(xué)功能[25]。在以往胃炎的研究中，證實(shí)Hp感染產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)、活性氧等可損傷細(xì)胞DNA，引發(fā)內(nèi)環(huán)境失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Hp感染早期因細(xì)胞周期調(diào)控蛋白異常，發(fā)生細(xì)胞凋亡水平增加，隨后Hp感染誘導(dǎo)COX-2表達(dá)促進(jìn)PGE2合成，后者誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并通過(guò)刺激Bc1-2表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，此時(shí)凋亡逐漸降低直至無(wú)凋亡，增殖活躍加速，最終突變的細(xì)胞生長(zhǎng)不受限產(chǎn)生癌變。

在近十年的文獻(xiàn)中，有不少學(xué)者采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞或牙齦上皮細(xì)胞進(jìn)行Hp相關(guān)的體外細(xì)胞凋亡研究，共同證實(shí)了Hp作為單一因素與牙周組織細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，Hp可以抑制hPDLFs的生長(zhǎng)、分裂和增殖。HpCagA和VacA進(jìn)入細(xì)胞后，均可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生廣泛的rab7依賴的融合及晚期包裹小泡腔隙的滲透性腫脹，誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化和細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變，從而引起哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞凋亡[26-27]。Galmiche 等[22]和Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)Hp VacA在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)后可將N端34 kD亞單位(p34)遷移到線粒體基質(zhì)，而C端58 kD 亞單位(P58)則保留下來(lái)。Willhite等[28]的研究也證明了此觀點(diǎn)。Chiozzi等[29]推斷，Hp可通過(guò)毒素活性調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,從而活化凋亡相關(guān)因子半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3酶原[30]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。馬玲等[31]將Hp VacA與人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hPDLFs生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。hPDLFs是牙周膜中最多，在功能上也是最主要的細(xì)胞。一旦hPDLFs發(fā)生結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的改變，都可能會(huì)引起牙周病損，進(jìn)而導(dǎo)致或加重牙周組織疾病的發(fā)生。然而，目前并沒(méi)有口腔Hp與細(xì)胞凋亡的體內(nèi)研究。

過(guò)往研究表明，性別對(duì)Hp感染及牙周炎癥意義不大[32]。因此，本實(shí)驗(yàn)并未將該因素納入分組。實(shí)驗(yàn)選取健康牙齦組織進(jìn)行分析，排除導(dǎo)致牙周疾病的常見(jiàn)紅色致病菌的毒力協(xié)作，便于獨(dú)立分析Hp感染對(duì)牙齦組織細(xì)胞凋亡的影響。在TUNEL法顯色結(jié)果中，可見(jiàn)Hp感染組棕色凋亡細(xì)胞密集分布于上皮全層, 少數(shù)散在于固有層內(nèi)。而正常對(duì)照牙齦組織中凋亡細(xì)胞相對(duì)較少, 兩者AI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)Hp可導(dǎo)致牙齦組織細(xì)胞凋亡。但本次實(shí)驗(yàn)Hp陰性組結(jié)果仍高于以往國(guó)內(nèi)對(duì)健康牙齦上皮細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)結(jié)果。可能因?yàn)闃颖緦?duì)應(yīng)牙齒均為牙折導(dǎo)致的殘冠，其長(zhǎng)期受到不平衡咬合力，而牙周組織是最容易因?yàn)槭艿綁毫Χa(chǎn)生適應(yīng)性改建的組織。有文獻(xiàn)證實(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的壓力可導(dǎo)致牙齦成纖維細(xì)胞凋亡。或許因?yàn)槿绱?，本?shí)驗(yàn)2組細(xì)胞的AI值都較高。另外，因本實(shí)驗(yàn)樣本為活檢組織，其壞死細(xì)胞和細(xì)胞代謝的反應(yīng)亦呈陽(yáng)性，使得凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)也會(huì)偏高。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Correlation betweenHelicobacterpyloriinfection and apoptosis in gingival tissues

HUANG Shan, LAI Ren-fa, ZHONG Li-zhen

(DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China. E-mail： 13318818388@163.com)

AIM: To observe the effects ofHelicobacterpylori(Hp) on the apoptosis of human gingival tissue. METHODS: Gingival tissue samples were taken from 30 patients without chronic periodontitis, and Hp was detected by conventional PCR. The apoptosis of the gingivival cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) to analyze the correlation between Hp infection and apoptosis of the gingival tissues. RESULTS: The Hp positive detections were 12 in the 30 patients without periodontitis, so the positive rate of Hp in the gingival tissue samples was 40%. The gingival tissue showed a large number of apoptotic cells in Hp positive group, and less apoptotic cells in Hp negative group. The apoptotic index in Hp positive group (0.498±0.092) was significantly higher than that in normal group (0.207±0.053) (P<0.05). CONCLUSION: Hp might play a role in the apoptosis of gingival tissues.

Gingival tissue;Helicobacterpylori; Apoptosis

1000- 4718(2017)07- 1323- 06

2017- 02- 27

2017- 04- 20

R781.4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.028

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△通訊作者 Tel: 13318818388; E-mail: 13318818388@163.com