蜂膠黃酮PB3A作用下結(jié)腸癌細(xì)胞株中miRNA-198和miRNA-296-5p的表達(dá)及功能預(yù)測(cè)*

胡尼其古麗·阿巴克， 瑪依努爾·達(dá)吾提， 依米提·熱合曼， 阿依努爾·玉蘇普， 吾熱婭提古麗·克維爾， 買(mǎi)日江古麗·阿布力提甫

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

·短篇論著·

蜂膠黃酮PB3A作用下結(jié)腸癌細(xì)胞株中miRNA-198和miRNA-296-5p的表達(dá)及功能預(yù)測(cè)*

胡尼其古麗·阿巴克， 瑪依努爾·達(dá)吾提， 依米提·熱合曼△， 阿依努爾·玉蘇普， 吾熱婭提古麗·克維爾， 買(mǎi)日江古麗·阿布力提甫

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

目的： 探討蜂膠黃酮短葉松素-3-乙酸酯(pinobanksin-3-acetate，PB3A)對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞微小RNA(microRNA, miRNA)表達(dá)譜的影響，為結(jié)腸癌的治療及靶向藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。方法: 使用miRNA芯片技術(shù)分析檢測(cè)蜂膠黃酮PB3A處理人類(lèi)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜的變化。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA-198和miRNA-296-5p的表達(dá)水平，以此來(lái)驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。利用miRWalk、MicroT、miRanda等12個(gè)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這2條miRNAs的靶基因并進(jìn)行靶基因功能富集分析。結(jié)果: miRNA芯片分析結(jié)果顯示，蜂膠黃酮PB3A干預(yù)24 h后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中差異表達(dá)倍數(shù)在2倍及以上的miRNA有267條，其中差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)10倍及以上的miRNA有30條，28條為上調(diào)表達(dá)，2條下調(diào)表達(dá)；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-198和miRNA-296-5p的表達(dá)量趨勢(shì)跟miRNA芯片結(jié)果一致，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miRNA-198有859個(gè)靶基因，miRNA-296-5p有906個(gè)靶基因；對(duì)這些可能被調(diào)控的靶基因進(jìn)行Gene Class分析，結(jié)果顯示miRNA-198和miRNA-296-5p的靶基因功能主要為轉(zhuǎn)錄因子、拷貝數(shù)變異、細(xì)胞分化、癌基因、蛋白激酶、組蛋白、轉(zhuǎn)移癌基因、腫瘤抑制基因等(P<0.05)。信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，miRNA-198靶基因顯著富集于腫瘤通路、Wnt信號(hào)通路、胞吞通路、ErbB信號(hào)通路、黏著斑通路、黑素生成通路等信號(hào)通路，而miRNA-296-5p靶基因在MAPK信號(hào)通路、胞吞通路、軸突導(dǎo)向通路、Wnt信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等信號(hào)通路中出現(xiàn)聚集(P<0.05)。結(jié)論: 蜂膠黃酮PB3A 影響結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。PB3A作用下miRNA-198和miRNA-296-5p的異常表達(dá)可能參與PB3A抗結(jié)腸癌的過(guò)程。

短葉松素-3-乙酸脂； 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞； 微小RNA-198； 微小RNA-296-5p

結(jié)腸直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全球癌癥的10%，在男性中排第3位，女性中排第2位[1]。目前，結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率越來(lái)越高，對(duì)人們身體健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，其在我國(guó)胃腸道腫瘤中的致死率排第4位，發(fā)病率排第3位，城市地區(qū)的發(fā)病率比農(nóng)村地區(qū)高[2]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)廣泛存在于多種生物體內(nèi)的長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA[3]。microRNA突變、缺失或表達(dá)水平的異常與人類(lèi)腫瘤密切相關(guān)，它具有癌基因樣或抑癌基樣作用，因此促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。據(jù)報(bào)道，已有100多種 miRNA在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中特異性表達(dá)[5]，在結(jié)腸癌上最初被發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA是miR-145和miR-143[6]。

蜂膠黃酮短葉松素-3-乙酸脂(pinobanksin-3-acetate，PB3A)是一種黃色，溶于二甲亞砜的，從蜂膠、蜂蜜及某些植物花苞等分離純化獲得的一種二氫黃酮化合物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PB3A通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用，它對(duì)大腸癌HCT116細(xì)胞[7]及SW480細(xì)胞[8]、胃癌SGC-7901細(xì)胞[9]和人肝癌HepG-2細(xì)胞[10]有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。然而miRNA在蜂膠黃酮PB3A抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡中的調(diào)控作用及其相關(guān)分子機(jī)制，國(guó)內(nèi)外向未報(bào)到。本研究通過(guò)觀察PB3A對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響，有望豐富PB3A的抗癌作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為有效治療結(jié)腸癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為以miRNA為靶點(diǎn)的新型抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供新的策略和思路。

材 料 和 方 法

1 材料

PB3A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，由Yasuyuki T教授(日本千葉工業(yè)大學(xué))和依米提·熱合曼博士提供。SW480細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

2 主要試劑

MTT試劑和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma； RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自Gibco；TRIzol總RNA提取試劑，miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；miRNA表達(dá)譜芯片由上?？党缮锕こ逃邢薰緳z測(cè)。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞給含有10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔2～3 d當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)換新的培養(yǎng)基，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后可用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔3×107個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，24 h后吸除原培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示蜂膠黃酮PB3A對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡的作用，根據(jù)前期研究結(jié)果，我們選擇濃度為100 mg/L PB3A干預(yù)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24 h作為miRNA芯片處理?xiàng)l件：設(shè)每孔加入2 mL含有濃度為100 mg/L PB3A(母液是用DMSO稀釋的)的RPMI-1640培養(yǎng)液混合培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)液中不加藥物(加相同濃度的DMSO，DMSO濃度≤0.5%)為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

3.2 細(xì)胞總RNA的提取及質(zhì)量鑒定 SW480細(xì)胞用PB3A處理24 h后采用Trizol試劑提取總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度,并以1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

3.3 miRNA芯片 將達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成熒光分子Hy3標(biāo)記的cDNA探針，與miRCURY LNATMArray (Exiqon)芯片雜交，利用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner進(jìn)行掃描，利用GenePix Pro 6.0軟件讀取圖片原始強(qiáng)度并進(jìn)行分析。差異表達(dá)的miRNA通過(guò)倍數(shù)變化篩選鑒定，差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組信號(hào)差異比值≥2和≤0.5。

3.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取100 ng總RNA，使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)miRNA 3’末端進(jìn)行加poly(A)處理，然后用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 合成miRNA對(duì)應(yīng)cDNA第一鏈。下一步使用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。20 μL體系，PCR反應(yīng)條件： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 20 s， 60 ℃ 34 s，共40循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，所有樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。以2-ΔΔCt法分析miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.5 差異表達(dá)miRNA生物信息學(xué)分析 利用miRWalk、MicroT、miRanda、miRBridge、miRDB、miRmap、miRNAMap、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid以及TargetScan等12個(gè)算法或數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA芯片結(jié)果中差異表達(dá)倍數(shù)≥10的miR-198和miR-296-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，至少要在7個(gè)算法或數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)到才算有效靶基因。然后應(yīng)用Fisher Exact檢驗(yàn)對(duì)這些可能被調(diào)控的靶基因進(jìn)行Gene Class、GO分析及KEGG信號(hào)通路分析/富集分析，從多個(gè)功能角度探索microRNA-靶基因-功能間的關(guān)系并統(tǒng)計(jì)富集結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。藥物干預(yù)和非干預(yù)組之間miRNA的ΔCt值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞總RNA純度及濃度測(cè)定

用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)100 mg/L PB3A 干預(yù)24 h候后提取的細(xì)胞總RNA濃度和純度，結(jié)果顯示其A260/A280值>1.8；經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA，結(jié)果28S和18S兩條電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1。此結(jié)果說(shuō)明提取的總RNA完整性好，質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 PB3A對(duì)miRNA表達(dá)譜的影響

對(duì)所得的miRNA表達(dá)芯片掃描圖像進(jìn)行數(shù)字化處理和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PB3A 作用24 h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中267條miRNA表達(dá)有顯著性差異，其中218條miRNA上調(diào)表達(dá)，49條miRNA下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)(fold change)≥2和≤0.5；差異倍數(shù)≥10的上調(diào)表達(dá)的miRNA 有28條，差異倍數(shù)≤0.1的下調(diào)表達(dá)的miRNA 有2條，見(jiàn)表1。

表1 PB3A處理組及對(duì)照組SW480細(xì)胞中差異表達(dá)倍數(shù)10倍及以上的miRNA

3 通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-198和miRNA-296-5p在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株中的表達(dá)情況，對(duì)miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

用100 mg/L PB3A處理結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株24 h后，藥物處理組miRNA296-5p和miRNA-198表達(dá)上調(diào)，與藥物未干預(yù)組相比有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)圖1；本實(shí)驗(yàn)中miRNA296-5p的相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)2-ΔΔCt值為4.47，miRNA-198的相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)2-ΔΔCt值為2.74，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2，該表達(dá)情況與miRNA 芯片的檢測(cè)結(jié)果一致。

Figure 1.Differential expression levels of miRNAs in drug-treated and untreated SW480 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖1 藥物處理與未處理SW480細(xì)胞中miRNA的差異表達(dá)水平

Figure 2.Validating the results of microarray miRNA expression by RT-qPCR.

圖2 RT-qPCR驗(yàn)證miRNA表達(dá)量并與miRNA芯片結(jié)果對(duì)比

4 miRNA-198和miRNA-296-5p靶基因的預(yù)測(cè)及生物學(xué)功能分析

采用miRWalk、MicroT、miRanda、miRBridge以及TargetScan等12個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這2條miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇7個(gè)或以上數(shù)據(jù)庫(kù)出現(xiàn)的靶基因，結(jié)果顯示miRNA-198有859個(gè)靶基因，miRNA-296-5p有906個(gè)靶基因。下一步通過(guò)Fisher Exact檢驗(yàn)對(duì)這些可能被調(diào)控的靶基因進(jìn)行Gene Class、GO分析及KEGG信號(hào)通路分析/富集分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-198和miRNA-296-5p的靶基因基因功能主要涉及轉(zhuǎn)錄因子、拷貝數(shù)變異、細(xì)胞分化、癌基因、蛋白激酶、組蛋白、轉(zhuǎn)移癌基因、腫瘤抑制基因等(P<0.05)。隨后將這些基因分別投射至GO分析的細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程三大應(yīng)用功能上，miR-198分別得到90條、 94條及213條相關(guān)注釋描述, 主要參與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、高爾基體、細(xì)胞連接、核仁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜組成部分、高爾基膜等細(xì)胞組分形成；與蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶結(jié)合、GTP酶激活活性、Rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及金屬離子結(jié)合等分子功能密切相關(guān)；主要與小G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、軸突導(dǎo)向、轉(zhuǎn)錄依賴性DNA的正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄DNA依賴性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、神經(jīng)系發(fā)展等生物過(guò)程有關(guān)。miR-296-5p分別得到106條、115條及248條相關(guān)注釋描述, 主要參與細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞核、高爾基體、細(xì)胞連接、核仁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜組成部分、高爾基膜、胞核周區(qū)、突觸、細(xì)胞質(zhì)囊泡膜等組分形成；主要分子功能與蛋白結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合、蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶活性、β-連環(huán)蛋白結(jié)合等有關(guān)；與神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄DNA依賴、正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄DNA依賴、蛋白磷酸化、從RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)小腸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄DNA依賴表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等密切相關(guān)。在GO分析注釋分類(lèi)的基礎(chǔ)上，采用已有生物通路數(shù)據(jù)，對(duì)這2條miRNA的靶基因進(jìn)行生物通路富集分析。結(jié)果顯示，在通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中miRNA-198富集于腫瘤通路(35)、Wnt信號(hào)通路(27)、胞吞通路(23)、ErbB信號(hào)通路(17)、黏著斑通路(23)和黑素生成通路(17)等重要的信號(hào)通路中； 而miRNA-296-5p在MAPK信號(hào)通路(41)、胞吞通路(24)、軸突導(dǎo)向通路(17)、Wnt信號(hào)通路(17)、胰島素信號(hào)通路(15)、鈣離子信號(hào)通路(21)、黑素生成通路(17)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(11)、黏著斑通路(18)和ErbB信號(hào)通路(13)等信號(hào)通路出現(xiàn)聚集。

討 論

結(jié)腸癌是一種早期階段診斷較難，預(yù)后較差的，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道2015年結(jié)腸癌在我國(guó)發(fā)病率和致死率在所有腫瘤中排第5位[11]。目前治療該癌最多應(yīng)用的是化療，但因?yàn)榛熕幬锏母弊饔?、癌?xì)胞對(duì)藥物的耐藥性等原因，治療結(jié)果不太理想。雖然最近在結(jié)腸癌診斷及治療方面獲得了不少成就，但為了提高治療效率和診斷的精確性發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)仍然是一個(gè)研究重點(diǎn)。miRNA是一種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，它的異常表達(dá)會(huì)影響靶基因發(fā)揮正常功能，從而引起其靶基表達(dá)的改變，參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)[12]。據(jù)報(bào)道超過(guò)50%的 miRNAs 位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或脆性位點(diǎn)，其異常表達(dá)有關(guān)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展[13]。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展，miRNA-381在結(jié)腸癌中下調(diào)表達(dá)，其下調(diào)表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌增殖和侵襲[14]。下調(diào)表達(dá)的miRNA-132也能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展,可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)[15]。研究還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miRNA-128[16]和miRNA-34a[17]可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。上調(diào)表達(dá)的miRNA-139-5p能抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并且靶向致癌基因NOTCH1促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯而在結(jié)腸癌中起關(guān)鍵作用[18]。蜂膠黃酮PB3A對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[8]，本研究中我們通過(guò)miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)蜂膠黃酮PB3A處理前后SW480細(xì)胞中miRNA表達(dá)量變化，探討miRNA在蜂膠黃銅PB3A抗癌作用中起的作用。

根據(jù)前期研究結(jié)果[8]我們選擇了PB3A濃度100 mg/L、處理時(shí)間 24 h 為miRNA芯片分析的處理?xiàng)l件， 觀察PB3A處理前后SW480細(xì)胞中miRNA 表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)藥物處理后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)267條miRNA表達(dá)量發(fā)生顯著差異。這些PB3A相關(guān)差異表達(dá)的 miRNAs 中上調(diào)表達(dá)的miRNA-198(差異倍數(shù)69.59223)和miRNA-296-5p(差異倍數(shù)33.35)通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)情況時(shí)，結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果一致，表明PB3A對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞miRNA表達(dá)量有影響。

研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中miRNA-296-5p通過(guò)直接靶向Pin1抑制細(xì)胞增殖和非依賴性生長(zhǎng)[19]。在非小細(xì)胞肺癌中miRNA-296-5p通過(guò)直接靶向 PLK1，調(diào)節(jié)其表達(dá)起腫瘤抑制作用[20]。Elfimova等[21]研究結(jié)果顯示miRNA-198充當(dāng)腫瘤抑制基因通過(guò)鎮(zhèn)壓有絲分裂和無(wú)絲分裂通路遞減肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。在大腸癌中miRNA-198表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)顯著與大腸癌嚴(yán)重程度有關(guān)。它通過(guò)以FUT8為靶點(diǎn)抑制大腸癌增殖和侵襲[22]。又有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-198在體內(nèi)和體外以SHMT1為靶點(diǎn)抑制肺癌細(xì)胞增殖[23]。

miRNA是通過(guò)調(diào)控其靶基因表達(dá)而發(fā)揮作用的，因此我們首先預(yù)測(cè)了這2條miRNAs的靶基因，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miRNA-198有859個(gè)，miRNA-296-5p有906個(gè)靶基因。所以下一步為了探究miRNA-296-5p和miRNA-198在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)起的作用對(duì)它們的靶基因進(jìn)行功能富集分析。Gene Class分析發(fā)現(xiàn)，這2條miRNA靶基因的主要功能聚集轉(zhuǎn)錄因子，拷貝數(shù)變異，細(xì)胞分化，癌基因，蛋白激酶，組蛋白，轉(zhuǎn)移癌基因，腫瘤抑制基因等方面。進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)miRNA-198在腫瘤通路、Wnt信號(hào)通路、胞吞通路、ErbB信號(hào)通路、黏著斑通路、黑素生成通路等信號(hào)通路中，miRNA-296-5p在MAPK信號(hào)通路、胞吞通路、軸突導(dǎo)向通路、Wnt信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等信號(hào)通路中出現(xiàn)聚集。這2條miRNAs靶基因的轉(zhuǎn)錄因子、拷貝數(shù)變異、細(xì)胞分化等基因功能在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起重用，并且這些靶基因參與腫瘤通路、Wnt信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、胞吞通路、ErbB信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，提示miRNA-296-5p和miRNA-198通過(guò)靶向調(diào)控其靶基因在PB3A抗腫瘤作用中起重要的作用。

本研究確認(rèn)了結(jié)腸癌細(xì)胞中蜂膠黃酮PB3A作用下miRNA-198和miRNA-296-5p會(huì)差異表達(dá)，并預(yù)測(cè)了這2個(gè)miRNA靶基因和相應(yīng)靶基因在結(jié)腸癌中可能的作用。這為今后的通過(guò)miRNA診斷和治療結(jié)腸癌提供更豐富的資料。但這些應(yīng)用生物信息學(xué)分析而獲得的結(jié)果還需要通過(guò)進(jìn)一步靶基因功能驗(yàn)證來(lái)確認(rèn)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of miRNA-198 and miRNA-296-5P in PB3A-treated colon cancer cell line and its function prediction

Ghunichigul ABAQ, Maynur DAWUT, Yimit RAHMAN, Aynur YUSUP, Wureyatiguli KEWEIER, Marjangul ABLITIP

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China.E-mail: 3081599679@qq.com)

AIM: To explore the effect of pinobanksin-3-acetate (PB3A) on microRNA (miRNA) expression profile of human colon cancer cells for providing new methods of treatment of colon cancer and development of targeted drug. METHODS: The method of miRNA expression profiling was used to observe the miRNA differential expression in human colon cancer SW480 cells after treated with PB3A. The expression of miRNA-198 and miRNA-296-5p in the SW480 cells was detected by RT-qPCR. The network databases of miRWalk， MicroT, miRanda and so on were used to predict the target genes regulated by these miRNAs， and pathway significant enrichment analysis was performed. RESULTS: miRNA microarray analysis showed that after treated with propolis flavonoid PB3A for 24 h, 267 miRNAs with differential expression twice or more in the SW480 cells were observed. Among them, there were 30 miRNAs with 10-fold or more differential expression, in which 28 were up-regulated and 2 were down-regulated. The results of RT-qPCR showed that the expression levels of miRNA-198 and miRNA-296-5p were consistent with the results of miRNA microarray analysis, and the difference was statistically significant (P<0.05). Bioinformatic analysis revealed that miRNA-198 has 859 target genes, and miRNA-296-5p has 906 target genes. The target genes of miRNA-198 were clustered in pathways in cancer, axon guidance, Wnt signaling pathway, regulation of actin cytoskeleton, insulin signaling pathway and MAPK signaling pathway, while the target genes of miRNA-296-5p were clustered in axon guidance, Wnt signaling pathway, MAPK signaling pathway, endocytosis， melanogenesis, insulin signaling pathway and calcium signaling pathway. CONCLUSION: Propolis flavonoid PB3A affects the expression of miRNA in colon cancer SW480 cells. The abnormal expression of miRNA-198 and miRNA-296-5p may be involved in the inhibitory effect of PB3A on colon cancer.

Pinobanksin-3-acetate; Colon cancer SW480 cells; MicroRNA-198; MicroRNA-296-5p

1000- 4718(2017)07- 1317- 06

2016- 12- 05

2017- 03- 31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31660333)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.027

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