Exendin-4可通過(guò)下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)標(biāo)志蛋白表達(dá)改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗*

馬 麗， 官濱斌， 王林曦,， 劉小鶯， 陳 洲， 劉禮斌, 4△

(福建醫(yī)科大學(xué) 1附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建省內(nèi)分泌研究所， 2附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，3藥學(xué)院， 4老年健康科學(xué)研究院，福建 福州 350001)

Exendin-4可通過(guò)下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)標(biāo)志蛋白表達(dá)改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗*

馬 麗1， 官濱斌1， 王林曦1,2， 劉小鶯2， 陳 洲3， 劉禮斌1, 4△

(福建醫(yī)科大學(xué)1附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建省內(nèi)分泌研究所，2附屬協(xié)和醫(yī)院老年病科，3藥學(xué)院，4老年健康科學(xué)研究院，福建 福州 350001)

目的： 探討胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動(dòng)劑exendin-4對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導(dǎo)劑衣霉素(TM)介導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(IR)的影響。方法: 體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，分別用TM、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)及exendin-4進(jìn)行干預(yù)，以MTT法檢測(cè)不同干預(yù)條件下脂肪細(xì)胞的存活情況，以葡萄糖氧化酶法檢測(cè)不同干預(yù)條件下脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量情況，利用Western blot法檢測(cè)不同干預(yù)條件下p-Akt、Akt及ERS關(guān)鍵信號(hào)標(biāo)志蛋白肌醇需求蛋白1(IRE1)、p-IRE1、c-Jun末端激酶(JNK)、p-JNK、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、p-PERK、真核生物翻譯起始因子2的α亞單位(eIF2a)、p-eIF2a和轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)-6的蛋白水平。結(jié)果: 單獨(dú)TUDCA或exendin-4作用，可協(xié)同胰島素作用，增加胰島素刺激的脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。TM(5 mg/L)作用5 h后可減少胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt的蛋白水平(P<0.05)。TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后，均可拮抗TM對(duì)胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt蛋白水平的改變(P<0.05)，二者效價(jià)相當(dāng)。TM(5 mg/L)作用5 h后可顯著提高ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)。而exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后，可降低TM誘導(dǎo)的ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)，其效價(jià)與應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA(1 mmol/L)預(yù)處理24 h相當(dāng)。不同的處理因素對(duì)于總IRE1、JNK、PERK及eIF2a的表達(dá)情況并無(wú)顯著性影響。結(jié)論: Exendin-4可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。

Exendin-4； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 3T3-L1脂肪細(xì)胞； 胰島素抵抗

目前已有大量研究證實(shí)，胰島素(insulin，INS)抵抗(insulin resistance，IR)常常與肥胖、糖尿病、心血管疾病、高脂血癥相伴隨，被認(rèn)為是滋生多種代謝性疾病的“共同土壤”[1-2]。而肥胖常伴有炎癥反應(yīng)和全身代謝絮亂，是引起IR最常規(guī)的原因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[3]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress， ERS)與胰島素抵抗密切相關(guān)，減輕細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將是治療胰島素抵抗的新靶點(diǎn)。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)作為近年來(lái)備受關(guān)注的糖尿病治療藥物，具有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延緩胃排空、保護(hù)胰島β細(xì)胞、促進(jìn)骨骼肌及脂肪組織中胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)、促進(jìn)糖原合成及改善外周組織的胰島素敏感性等諸多優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已有報(bào)道在體外研究中，GLP-1的類(lèi)似物exendin-4(EX-4)可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4-5]。但對(duì)于脂肪細(xì)胞中，GLP-1類(lèi)似物是否可以通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善胰島素抵抗，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究將以3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，并從exendin-4對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答相關(guān)的IRE1-JNK、PERK-eIF2a和ATF-6 這3條通路的作用入手，探討exendin-4改善TM誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制，為更好地理解exendin-4的抗糖尿病作用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

3T3-L1前脂肪細(xì)胞由上海瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所惠贈(zèng)；高糖DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；低糖DMEM(Hyclone)；IBMX、地塞米松和衣霉素(Sigma)；優(yōu)泌林R(Lilly)；?；切苊撗跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA；Calbiochem)；葡萄糖測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；抗p-JNK多克隆抗體、抗JNK多克隆抗體、抗肌醇需求酶1(inositol requirirg enzyme-1，IRE1)多克隆抗體、抗磷酸化的真核生物翻譯起始因子2的α亞單位(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2a)單克隆抗體、抗p-Akt單克隆抗體(CST)；抗p-IRE1多克隆抗體、抗轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcription factor，ATF)-6多克隆抗體和抗p-PERK單克隆抗體(Abcam)；抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)單克隆抗體和抗eIF2a單克隆抗體(Santa Cruz)；抗Akt多克隆抗體(武漢博士德)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物科技公司)；蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO)；酶標(biāo)儀ELX8(Bio-Tek)。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞以含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代接種至6孔培養(yǎng)板上。待細(xì)胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L異丁基-甲基-黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)48 h，換液，以含10 mg/L胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后換單純10%小牛血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯脂滴，可用于實(shí)驗(yàn)[6]。

2.2 油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞 以10%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS 洗去后晾干。加油紅O染液(0.25 g油紅O加入100 mL異丙醇，56 ℃溶解1 h，冷卻后，過(guò)濾作為儲(chǔ)存液；使用時(shí)，取6份上述儲(chǔ)存液，加4份ddH2O混勻，靜置10 min，即為使用液)10 min后棄去，以異丙醇洗細(xì)胞2次，用蘇木精染細(xì)胞核2 min。水洗5～10 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，拍攝照片[5]。細(xì)胞內(nèi)的脂滴被染成紅色，說(shuō)明誘導(dǎo)成功。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為空白對(duì)照(control)組、INS組、TM組、TM+TUDCA組、TUDCA組、TM+EX-4組、EX-4組。(1)空白對(duì)照組：不加任何干預(yù)因素；(2)INS組：僅胰島素處理30 min；(3)TM組：TM(5 mg/L)作用5 h后，胰島素作用30 min；(4)TM+TUDCA組：以TUDCA(1 mmol/L)預(yù)處理24 h后，以TM(5 mg/L)作用5 h，胰島素作用30 min；(5)TUDCA組：TUDCA(1 mmol/L)預(yù)處理24 h后，胰島素作用30 min；(6)TM+EX-4組：exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后,以TM(5 mg/L)作用5 h，胰島素作用30 min；(7)EX-4組：以exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h，胰島素作用30 min。

2.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 于96孔培養(yǎng)板中每孔接種100 μL的細(xì)胞，按 2.1所述方法誘導(dǎo)細(xì)胞為成熟的脂肪細(xì)胞，按照上述分組予以不同的干預(yù)條件，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸凈上清，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩10 min，混勻后置于酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度(A)值，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力。

2.5 測(cè)定3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量 將96孔板中誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞按上述分組中的不同條件予以干預(yù)，用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，與未接種細(xì)胞空白復(fù)孔的糖含量均值相減，算出各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量[7]。

2.6 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白(p-Akt、Akt、p-IRE1、IRE1、p-JNK、JNK、p-PERK、PERK、p-eIF2a、eIF2a和ATF-6)的水平 用細(xì)胞裂解法抽提蛋白，分別配制8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，每孔上樣30 μg，30 V恒壓預(yù)跑10 min，80 V恒壓電泳跑至濃縮膠和分離膠分界線，120 V恒壓電泳90 min。電泳完成采用300 mA恒電流轉(zhuǎn)膜90 min。50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。I 抗孵育過(guò)夜。TBST洗脫10 min、3次；II 抗孵育1 h。TBST洗脫10 min、3次。ECL發(fā)光法顯色，在暗室中曝光，并以β-actin作為內(nèi)參照。蛋白條帶灰度值運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立3次完成，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，其中組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各處理因素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞活性的影響

與未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組比較，各處理因素組細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，表明各處理因素對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，見(jiàn)圖1。

2 TM誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗及exendin-4對(duì)葡萄糖消耗量的影響

與空白對(duì)照組比較，經(jīng)10 nmol/L胰島素處理30 min后，3T3-L1脂肪細(xì)胞萄糖消耗量明顯升高(P<0.05),說(shuō)明誘導(dǎo)分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素敏感，適用于建立IR模型。與INS組相比，TM(5 mg/L)作用5 h后可減少胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞萄糖消耗量，較INS組減少了 63%(P<0.05)。經(jīng)過(guò)TUDCA(1 mmol/L)以及exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后，均可增加胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞萄糖消耗量，較TM組分別增加了62%及63%(P<0.05)，二者效價(jià)相當(dāng)。單獨(dú)TUDCA或exendin-4作用，可協(xié)同胰島素作用，增加胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗，較INS組分別增加了18%及17%(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The cell viability of 3T3-L1 adipocytes in different groups. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.

圖1 不同處理因素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞存活率的影響

Figure 2.Glucose consumption in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

圖2 不同處理因素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

3 Western blot檢測(cè)p-Akt/Akt在各組間的變化情況

INS組較空白組的p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，而TM組較INS組的p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)。而TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后，可升高TM誘導(dǎo)的p-Akt蛋白水平 (P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明，TM組存在胰島素抵抗，exendin-4可能通過(guò)激活p-Akt，減輕TM介導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素抵抗，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The ratio of phosphorylated Akt (p-Akt)/Akt in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

圖3 Western blot顯示各組3T3-L1脂肪細(xì)胞中p-Akt和Akt的蛋白表達(dá)情況

4 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白在各組間的變化情況

TM作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可顯著提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路分子p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6的水平(P<0.05)。而exendin-4(100 nmol/L)預(yù)處理24 h后，可抑制TM誘導(dǎo)的p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6蛋白水平(P<0.05)，其效價(jià)與應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA(1 mmol/L)預(yù)處理24 h相當(dāng)。不同的處理因素對(duì)于總IRE1、JNK、eIF2a和PERK的表達(dá)情況并無(wú)顯著影響。結(jié)果說(shuō)明exendin-4可減輕TM誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，見(jiàn)圖4、5。

討 論

目前研究認(rèn)為，胰島素抵抗與多種疾病相關(guān)，它是糖尿病、高血壓、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝相關(guān)疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)[8]。改善胰島素抵抗或能延緩或逆轉(zhuǎn)相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，研究IR的發(fā)生機(jī)制及治療措施已成為當(dāng)前的重要課題。

目前已有不少研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與IR密切相關(guān)。ERS是指由于某種原因使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種病理狀態(tài)，在血糖和能量改變、蛋白質(zhì)合成增加、中毒、病毒感染及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊障礙和錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而觸發(fā)ERS，在這種情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活一系列復(fù)雜的反應(yīng)來(lái)重新恢復(fù)它的整體功能，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)[9-10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過(guò)以下幾個(gè)途徑阻礙胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)引起胰島素抵抗：(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)時(shí)IRE-1α磷酸化水平升高，通過(guò)募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2及凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-1，這3者形成復(fù)合物共同激活JNK進(jìn)而活化絲氨酸激酶，促進(jìn)胰島素受體底物-1 關(guān)鍵位點(diǎn)的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制磷脂酰肌醇-3-激酶介導(dǎo)的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低靶組織對(duì)胰島素的敏感性[11]；(2)PERK可以直接降解NF-κB的抑制因子IκB蛋白，繼而激活NF-κB通路，從而上調(diào)TNF-α、IL-6和MCP-1等炎癥基因的表達(dá)，導(dǎo)致IR[12]；(3)在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4表達(dá)下降，減少脂肪細(xì)胞中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生胰島素抵抗[13]?？梢?jiàn)，ERS可以影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致IR和代謝異常。在本研究中，首先經(jīng)MTT法檢測(cè)顯示，各分組的不同干預(yù)條件并未引起細(xì)胞凋亡；但經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞，胰島素刺激的葡萄糖攝取量減少， Western blot檢測(cè)p-Akt的分子水平下降，而ERS相關(guān)信號(hào)通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表達(dá)均上調(diào)。TUDCA作為一種能減輕細(xì)胞ERS的化學(xué)分子伴侶，在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)其預(yù)處理后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，TM誘導(dǎo)的上述葡萄糖消耗量增多、p-Akt表達(dá)的升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)下降，此結(jié)果也與Ozcan等[14]的結(jié)果相一致。由此推測(cè)，TM可能通過(guò)介導(dǎo)脂肪細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起下游的胰島素受體信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致IR，而TUDCA能通過(guò)減輕ERS，改善IR。

Figure 4.The ratio of p-IRE1/IRE1 and p-JNK/JNK in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

圖4 Wester blot跡顯示各組3T3-L1脂肪細(xì)胞中p-IRE1、IRE1、p-JNK和JNK的蛋白水平

Figure 5.The ratio of p-eIF2a/eIF2a, p-PERK/PERK and ATF-6/β-actin in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

圖5 各組3T3-L1脂肪細(xì)胞中p-eIF2a、eIF2a、p-PERK、PERK及ATF-6的蛋白水平

GLP-1是一種重要的腸促胰島素，除葡萄糖依賴性的降低血糖，刺激胰島β細(xì)胞分化、增殖以及抑制食欲、延緩胃排空外，亦有部分研究發(fā)生其還參與外周組織包括肝臟、骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖代謝，并增加脂肪合成及分解，改善細(xì)胞的胰島素敏感性[15]。GLP-1在體內(nèi)半衰期極短，分泌入血后1～2 min即被二肽基肽酶IV所降解。而exendin-4 作為GLP-1 類(lèi)似物，具有GLP-1相似的生物學(xué)作用，同時(shí)不易被二肽基肽酶IV降解，血漿半衰期長(zhǎng)，在臨床及科研的應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。目前亦有體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，exendin-4可通過(guò)PI3K-PKB信號(hào)通路或增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)增加其轉(zhuǎn)運(yùn)效率、協(xié)同胰島素作用并提高胰島素刺激的葡萄糖攝取，改善大鼠骨骼肌及肝臟的胰島素抵抗[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，exendin-4可提高TM誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型鼠的葡萄糖攝取量及p-Akt蛋白的表達(dá)水平，提示exendin-4可改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。另外，還有一些體外研究發(fā)現(xiàn)，exendin-4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷起拮抗作用[4]；在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，exendin-4的治療減少胰腺中CHOP、XBP-1及BiP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)[5]。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島素抵抗的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)exendin-4降低TM誘導(dǎo)的p-IRE1、p-JNK、p-PERK、p-eIF2a及ATF-6的蛋白水平，且其效價(jià)與ERS抑制劑TUDCA相當(dāng)，而對(duì)總IRE1、JNK、PERK和eIF2a表達(dá)影響不大。由此推測(cè)exendin-4可能通過(guò)下調(diào)上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路分子來(lái)發(fā)揮其改善外周脂肪組織胰島素抵抗的作用。

總之，exendin-4可能通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗作用。但具體的作用機(jī)制如胰島素受體信號(hào)通路的變化情況以及是否還可以通過(guò)影響炎癥信號(hào)通路NF-κB等發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用，仍有待進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Exendin-4 improves insulin resistance by declining expression of endoplasmic reticulum stress markers in 3T3-L1 adipocytes

MA Li1, GUAN Bin-bin1, WANG Lin-xi1, 2, LIU Xiao-ying2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1, 4

(1DepartmentofEndocrinology,FujianInstituteofEndocrinology,2DepartmentofGeriatrics,FujianMedicalUniversityUnionHospital,3CollegeofPharmacy,4InstituteoftheElderlyHealthSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail：libin.liu@hotmail.com)

AIM: To explore the effects of exendin-4 (EX-4) on endoplasmic reticulum stress (ERS)-mediated insulin resistance in the 3T3-L1 adipocytes. METHODS:Invitro3T3-L1 pre-adipocytes were differentiated into adipocytes, and the cells were treated with tunicamycin (TM), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) or EX-4， respectively. The cell viability was measured by MTT assay. The glucose consumption was determined by glucose oxidase assay to evaluate insulin sensitivity of the 3T3-L1 adipocytes with different interventions. The protein levels of p-Akt, Akt and endoplasmic reticulum stress markers, including inositol requiring enzyme-1 (IRE1)， p-IRE1, JNK, p-JNK, protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), p-PERK, eukaryotic initation factor 2 alpha (eIF2a)， p-eIF2a, activating transcription factor-6(ATF-6) were detected by Western blot. RESULTS: The insulin-stimulated glucose consumption and the protein level of p-Akt were inhibited by TM at 5 mg/L for 5 h (P<0.05), while they were increased when the cells were treated with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The effects above induced by TM (5 mg/L for 5 h) were also blunted by pretreating with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The protein levels of ERS markers such as p-IRE1, p-JNK, p-PERK, p-eIF2a and ATF-6 were significantly increased by treating with TM at 5 mg/L for 5 h, whereas 24 h pre-treatment with TUDCA or Ex-4 alleviated the ERS of the 3T3-L1 adipocytes induced by TM. The expression of total IRE1, JNK, PERK and eIF2a was not changed in different groups. CONCLUSION: Exendin-4 improves endoplasmic reticulum stress mediated insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes.

Exendin-4; Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 adipocytes; Insulin resistance

1000- 4718(2017)07- 1258- 06

2016- 06- 23

2017- 05- 22

福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2013Y0041)； 福建省衛(wèi)生廳青年課題(No. 2009-2-24)； 國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科老年醫(yī)學(xué)項(xiàng)目資助(No. 2015-GJLN-2-04)； 福建省衛(wèi)計(jì)委青年項(xiàng)目(No. 2014-1-43； No. 2015-1-38)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.017

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