Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重構(gòu)中的作用

張躍華， 李樹仁， 鄧文浩， 郝 瀟， 李 沙， 馬玉龍， 楊玲玲

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科， 河北 石家莊 050051)

Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重構(gòu)中的作用

張躍華， 李樹仁△， 鄧文浩， 郝 瀟， 李 沙， 馬玉龍， 楊玲玲

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科， 河北 石家莊 050051)

目的： 探討半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)與心肌纖維化的關(guān)系，明確Gal-3在缺血性心功能不全家兔心室重構(gòu)中的作用。方法: 采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制作缺血性心功能障礙家兔模型。利用隨機(jī)數(shù)字表法將20 只家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組和心功能不全組。造模成功4周后采用心臟超聲測定心功能；real-time PCR和Western blot方法分別檢測心肌中Gal-3、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的 mRNA 表達(dá)和蛋白含量；ELISA法檢測家兔血清中Gal-3水平；采用HE染色和Masson染色法檢測家兔梗死區(qū)心肌組織的纖維化程度。結(jié)果: 與假手術(shù)組相比，心功能不全組梗死區(qū)心肌組織Gal-3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，與此同時Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯增加；血清Gal-3水平明顯上升；病理學(xué)觀察可見心功能不全組的心肌細(xì)胞形態(tài)不一、排列紊亂，纖維組織明顯增生。結(jié)論: Gal-3加重了缺血性心功能不全家兔的心肌纖維化，促進(jìn)了心室重構(gòu)和心衰的發(fā)生。

半乳糖凝集素3； 心力衰竭； 心肌梗死； 心室重構(gòu)； 心功能不全

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥候群，是各種心血管疾病的嚴(yán)重階段。心室重構(gòu)被認(rèn)為是心衰發(fā)展的基礎(chǔ)，已有在眾多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)在心衰的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)包括心室的大小、形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的改變，心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變往往早于患者出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀[1]。近年來，減慢或延緩心室重構(gòu)的進(jìn)展成為治療心衰的主要方向，然而心衰的心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)分子機(jī)制尚未明確。半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)是巨噬細(xì)胞分泌的一種β-半乳糖苷激素，是一種強(qiáng)大的炎癥信號分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、活化和趨化，參與免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及凋亡等過程[2]。近期已有眾多研究表明Gal-3在眾多心血管疾病中也起著重要作用[3-5]，它參與心室重構(gòu)和心衰的病理過程并且對心衰的預(yù)后有預(yù)測作用。目前國內(nèi)對Gal-3與心衰和心室重構(gòu)的關(guān)系尚不完全明確。本研究通過檢測Gal-3在缺血性心功能不全家兔中的表達(dá)，探討Gal-3與心肌纖維化的關(guān)系，明確Gal-3在缺血心功能不全心室重構(gòu)中的作用，為心衰的臨床治療提供基礎(chǔ)支持。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)選用健康 3 月齡新西蘭雄性家兔(合格證號為1606173)共 20只，體重約2.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

心臟超聲儀(TOSHIBA)；低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；QL-902渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)；LineGene 9600 Plus熒光定量PCR儀(Bioer Technology)；兔血清Gal-3 ELISA試劑盒(上海藍(lán)基科技公司)；HiFiMMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture (With ROX)和5×RNA loading buffer(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；載玻片(海門市世態(tài)實(shí)驗(yàn)器材制造公司)；分析純二甲苯(兆京化工廠)；蘇木素和0.5%伊紅(Sigma)。

3 方法

3.1 動物的分組及處理 按照隨機(jī)數(shù)字表法將20只家兔分為心功能不全組和假手術(shù)組各10只，采用開胸結(jié)扎冠狀動脈法制備心功能不全模型。

3.2 實(shí)驗(yàn)動物模型制備 心功能不全組采用結(jié)扎前降支的方法制作心功能障礙模型。記錄術(shù)前心電圖后開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支，模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為心尖部及左室前壁由紅色變?yōu)榘底仙植啃募∵\(yùn)動異常，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián) ST 段持續(xù)弓背向上抬高[6]。假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎冠狀動脈前降支，模型制備后心尖部及左室前壁沒有顏色變化，心肌運(yùn)動無異常，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián) ST 段未抬高。2組術(shù)后每天肌注青霉素8×105U，共3 d。

3.3 超聲心動圖檢測心功能 術(shù)前、術(shù)后2 周及術(shù)后4周由同一?？漆t(yī)生行超聲心動圖檢查，測量2組左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。所有測量值均取3 次測量的平均值。

3.4 Real-time PCR 法檢測梗死區(qū)心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA表達(dá) 造模后4 周，取50 mg 心肌梗死區(qū)域心肌組織進(jìn)行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測其完整性; 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為： 42 ℃ 50 min， 95 ℃ 5 min。β-actin 的上游引物為5’-AGATCGTGCGGGACATCAAG-3’，下游引物為5’-CAGGAAGGAGGGCTGGAAGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為182 bp；Ⅰ型膠原的上游引物為5’-TGAGCCAGCAGATTGAGAACAT-3’，下游引物為5’-TGTCGCAGAAG ACCTTGATGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為165 bp；Ⅲ型膠原的上游引物為5’-GTACAACTAGCATTCCTCCGACTG-3’，下游引物為5’-TTAGAGCAGCCATCCTCCAGAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為203 bp; Gal-3的上游引物為5’-CTGTGCCTTATGACCTGCCTCT-3’，下游引物為5’-TCATTGACCGCAACCTTGAAGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為301 bp。將獲得的cDNA 按照實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒操作說明書方法擴(kuò)增目的基因，PCR 熱循環(huán)參數(shù)為： 96 ℃ 4 min； 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 45 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，將目的基因表達(dá)的相對定量值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Real-time PCR 采用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果[7]。將所得的Gal-3的mRNA表達(dá)量與LVEF 進(jìn)行相關(guān)分析。

3.5 Western blot法檢測梗死區(qū)心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的蛋白含量 將梗死區(qū)的心肌組織稱重后研磨提取組織中的蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分離膠和5%濃縮膠，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，然后濕轉(zhuǎn)膜，孵育相應(yīng)Ⅰ、Ⅱ抗，ECL發(fā)光反應(yīng)檢測并分析目的蛋白含量。將所得的Gal-3蛋白量與LVEF 進(jìn)行相關(guān)性分析。

3.6 ELISA法檢測血清中Gal-3的含量 分別在術(shù)前、術(shù)后2周和術(shù)后4周，經(jīng)家兔耳中動脈取血，離心15 min 后取上清，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作；依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其吸光度(A)計(jì)算相應(yīng)公式，依據(jù)公式和樣品A值計(jì)算樣品Gal-3 的濃度，然后將所得的血清Gal-3 的濃度與LVEF 進(jìn)行相關(guān)分析。

3.7 組織病理觀察 采用HE染色和Masson染色法觀察家兔梗死區(qū)心肌組織纖維化程度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 21.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)變量間采用直線相關(guān)分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌梗死后心功能障礙模型結(jié)果

20只新西蘭雄性家兔在造模后共有16 只存活，其中心功能不全組存活 8只，死亡2只，因結(jié)扎前降支的過程中誘發(fā)室顫而死亡；假手術(shù)組存活8只，死亡2只，其中1只于手術(shù)過程中大出血死亡，另1只開胸過程中發(fā)生氣胸而死亡。

2 超聲心動圖檢查結(jié)果

對造模前心功能不全組和假手術(shù)組的超聲結(jié)果行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示LVEF和LVEDD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明2組家兔在造模前的心功能是一致的。

對造模后2周和4周的心功能不全組和假手術(shù)組的超聲結(jié)果行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示LVEF和LVEDD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，心功能不全組LVEF明顯下降，LVEDD明顯增大，見表1。

表1 2組造模后4周LVEF和LVEDD的比較

Table 1.Comparison of LVEF and LVEDD in the 2 groups 4 weeks after modeling (Mean±SD.n=8)

GroupLVEF(%)LVEDD(mm)Shamoperation61.36±5.4511.81±0.31Cardiacinsufficiency40.22±0.87*16.59±0.54*

*P<0.05vssham operation group.

3 梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA表達(dá)

與假手術(shù)組相比，心功能不全組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA表達(dá)明顯增加。Gal-3的mRNA水平與LVEF存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.923，P<0.05)，見表2。

表2 2組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Gal-3的mRNA表達(dá)及Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原mRNA比值的比較

Table 2.The mRNA expression of type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen and Gal-3， and the ratio of type Ⅰ collagen/type Ⅲ collagen mRNA (ratio) in the 2 groups (Mean±SD.n=8)

GroupTypeIcollagenTypeIIIcollagenGal-3RatioShamoperation1.15±0.920.93±0.591.20±0.151.26±0.16Cardiacinsufficiency4.71±0.51*2.43±0.48*7.23±0.88*2.02±0.51*

*P<0.05vssham operation group.

4 梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的蛋白含量

Western blot的檢測結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，心功能不全組梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白含量顯著增加。Gal-3的蛋白含量與LVEF存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.909，P<0.05)，見圖1、表3。

5 血清Gal-3的含量

對心功能不全組和假手術(shù)組術(shù)前血清中Gal-3的濃度進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。分別對2組術(shù)后2周和4周血清中Gal-3的濃度進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，術(shù)后2周到4周血清Gal-3的含量逐漸增加。血清Gal-3的濃度與LVEF存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.89，P<0.05)，見表4。

Figure 1.The representative images of Western blot for determining the protein levels of Gal-3, type I collagen and type Ⅲ collagen in the 2 groups.

圖1 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的Wes-tern blot檢測結(jié)果

表3 2組梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白含量比較

*P<0.05vssham operation group.

表4 2組術(shù)前、術(shù)后2周和術(shù)后4周后血清Gal-3含量的比較

Table 4.The levels of serum Gal-3 in the 2 groups before operation (0 week)， and 2 and 4 weeks after operation (μg/L. Mean±SD.n=8)

Group0week2weeks4weeksShamoperation5.50±0.175.63±0.125.49±0.16Cardiacinsufficiency5.48±0.295.80±0.25*7.68±0.34*

*P<0.05vssham operation group.

6 病理組織結(jié)果

假手術(shù)組和心功能不全組心梗區(qū)心肌組織，經(jīng)石蠟包埋切片、Masson染色和HE染色。HE染色后于光鏡下觀察，可見假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)均一、排列整齊。細(xì)胞質(zhì)染色均勻，呈淡紅色，胞核大小一致，呈橢圓形或圓形，居胞質(zhì)中央；心功能不全組心肌細(xì)胞形態(tài)大小不一、排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色不均勻呈散點(diǎn)狀，細(xì)胞核消失或呈梭型。Masson染色鏡下可見假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)均一，紅色心肌細(xì)胞染色均勻，藍(lán)色纖維組織較少，心功能不全組梗死區(qū)心肌細(xì)胞形態(tài)消失，取而代之的是成纖維細(xì)胞及粗大的膠原纖維束，排列疏松，見圖2。

Figure 2.Masson and HE stained images of sham operation group and cardiac insufficiency group (×10).

圖2 假手術(shù)組與心功能不全組HE染色和Masson染色的圖片

討 論

近代人們通過對心衰的心臟結(jié)構(gòu)與功能改變長期研究，Baumbach等[8]于1989年首次提出心室重構(gòu)這個概念。心室重構(gòu)一直被認(rèn)為是心衰發(fā)展的基礎(chǔ)，是心衰患者發(fā)病率和死亡率的決定因素，所以減慢或延緩心室重構(gòu)的進(jìn)展也成為治療心衰的主要方向，然而心室重構(gòu)分子機(jī)制還尚未明確?？v觀近幾年研究發(fā)現(xiàn)Gal-3與心室重構(gòu)的關(guān)系備受關(guān)注，目前已有眾多文章表明Gal-3很可能是參與心室重構(gòu)的一個分子機(jī)制。Kortekaas等[9]研究了Gal-3與左室重構(gòu)的關(guān)系。研究證明Gal-3高水平與逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)有關(guān)。Lok等[10]的研究顯示，在嚴(yán)重慢性心衰患者中Gal-3和左室重構(gòu)有關(guān)，并能預(yù)測遠(yuǎn)期死亡率。

本研究通過病理圖片可以從組織結(jié)構(gòu)上看出與假手術(shù)組相比，心功能不全組心肌細(xì)胞形態(tài)不一、排列紊亂，纖維組織增生明顯。 Real-time PCR 結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，心功能不全組梗死區(qū)心肌組織Gal-3的mRNA表達(dá)明顯增加，與此同時Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原比值也明顯增加。由此可以說明心功能不全組家兔心肌組織中，心肌間質(zhì)膠原蛋白沉積，Ⅰ型膠原升高更明顯。Gal-3的mRNA表達(dá)水平與LVEF做相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Gal-3與LVEF存在負(fù)相關(guān)，且為強(qiáng)相關(guān)，這就表明隨著Gal-3水平的升高，心功能在逐漸下降。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，心功能不全組梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白含量顯著增加。Gal-3的蛋白含量與LVEF做相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Gal-3與LVEF存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。與假手術(shù)組相比，心功能不全組造模后4周血清Gal-3的含量明顯增加且與LVEF呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這就表明隨著血清Gal-3水平的升高心功能在逐漸下降，這也將為Gal-3成為心衰指標(biāo)提供了依據(jù)。上述結(jié)果與病理組織結(jié)構(gòu)改變是一致的。由此可見隨著Gal-3水平的升高，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)增加，心肌膠原網(wǎng)的構(gòu)架改變，心肌纖維化加重，促進(jìn)了心室肥厚和心室重構(gòu)過程，促進(jìn)了心功能下降和心衰的發(fā)生。

心室重構(gòu)是引起心力衰竭的重要病理生理機(jī)制之一，被認(rèn)為是心衰發(fā)展的基礎(chǔ)，是心衰患者發(fā)病率和死亡率的決定因素，所以減慢或延緩心室重構(gòu)的進(jìn)展成為治療心衰的主要方向。本研究已證實(shí)Gal-3促進(jìn)了心肌纖維化，參與了心室重構(gòu)過程，故可能成為心衰治療的一個新靶點(diǎn)。Gal-3相關(guān)抑制劑可能會給減慢或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)和心衰的治療注入新力量，但Gal-3能否真正成為心衰治療的靶點(diǎn)，其抑制劑能否逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)、改善患者預(yù)后均有待于進(jìn)一步研究。

[1] Emdin M, Vittorini S, Passino C, et al. Old and new biomarkers of hearts of heart failure[J]. Eur J Heart Fail, 2009, 11(4):331-335.

[2] Elola MT, Wolfenstein-Todel C, Troncoso MF, et al. Galectins: atricellular glycan-binding proteins linking cell adhesion, migration, and survival[J]. Cell Mol Life Sci, 2007, 64(13):1679-1700.

[3] de Boer RA, van Veldhuisen DJ, Gansevoort RT, et al. The fibrosis marker galectin-3 and outcome in the general population[J]. J Intern Med, 2012, 272(1):55-64.

[4] McCullough PA, Olobatoke A, Vanhecke TE. Galectin-3: a novel blood test for the evaluation and management of patients with heart failure[J]. Rev Cardiovasc Med, 2011, 12(4):200-210.

[5] Lok DJ, Klip IT, Lok SI, et al. Incremental prognostic power of novel biomarkers (growth-differentiation factor-15, high-sensitivity C-reactive protein, galectin-3, and high-sensitivity troponin-T) in patients with advanced chronic heart failure[J]. Am J Cardiol, 2013, 112(6):831-837.

[6] 郝 瀟， 李樹仁， 孟田田， 等．不同劑量培哚普利對缺血性心功能障礙家兔心功能及ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7) 軸的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2016, 32(3):554-557.

[7] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparativeCTmethod[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6):1101-1108.

[8] Baumbach GL, Heistad DD. Remodeling of cerebral arterioles in chronic hypertention[J]. Hypertention, 1989, 13(2):968-972.

[9] Kortekass KA, Hoogsjag GE, de Boer RA, et al. Galectin-3 and left ventricular reverse remodelling after surgical mitral valve repair[J]. Eur J Heart Fail, 2013, 15(9):1011-1018.

[10]Lok DJ, Lok SI, Bruggink-André de la Porte PW, et al. Galectin-3 is an independent marker for ventricular remodeling and mortality in patients with chronic heart failure[J]. Clin Res Cardiol, 2013, 102(2):103-110.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of galectin-3 on ventricular remodeling in rabbits with ischemic cardiac insufficiency

ZHANG Yue-hua, LI Shu-ren,DENG Wen-hao,HAO Xiao, LI Sha,MA Yu-long, YANG Ling-ling

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

AIM: To investigate the relationship between galectin-3 (Gal-3) and myocardial fibrosis, and to clarify the role of Gal-3 in ventricular remodeling in rabbits with ischemic cardiac insufficiency. METHODS: A rabbit model of ischemic cardiac insufficiency was established by ligation of the anterior descending branch of the coronary artery. The 20 rabbits were randomly divided into sham operation group and cardiac insufficiency group by random number table method. After 4 weeks of coronary artery ligation, the cardiac function was measured by cardiac echocardiogram. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of Gal-3, type I collagen and type III collagen at mRNA and protein levels in the myocardium. The serum Gal-3 contents were measured by ELISA. HE staining and Masson staining were used to observe the degree of fibrosis development in myocardial tissues after infarction. RESULTS: Compared with sham operation group, the mRNA expression of Gal-3 in cardiac insufficiency group was significantly increased. At the same time, type I collagen, type III collagen and collagen type I/III ratio were also increased significantly. The protein contents of Gal-3, type I collagen and type III collagen were increased significantly. The serum Gal-3 levels were significantly increased. The pathological changes were observed in cardiac insufficiency group as the myocardial cell morphological disorder and marked hyperplasia of fibrous tissue were seen. CONCLUSION: Gal-3 aggravates myocardial fibrosis in rabbits with ischemic cardiac insufficiency, and promotes the ventricular remodeling and the occurrence of heart failure.

Galectin-3; Heart failure; Myocardial infarction; Ventricular remodeling; Cardiac insufficiency

1000- 4718(2017)07- 1226- 05

2016- 11- 15

2017- 03- 24

R541； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.012

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△通訊作者 Tel： 0311-85988732; E-mail: lsr64@126.com)