白藜蘆醇通過促進Apaf-1/caspase-9復合物的形成增強5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群凋亡的誘導

張紅萍， 袁 梅

(嘉興市中醫(yī)院檢驗科， 浙江 嘉興 314001)

白藜蘆醇通過促進Apaf-1/caspase-9復合物的形成增強5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群凋亡的誘導

張紅萍△， 袁 梅

(嘉興市中醫(yī)院檢驗科， 浙江 嘉興 314001)

目的： 探討白藜蘆醇聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群的協(xié)同殺傷效應及機制。方法: 將人骨肉瘤細胞系MG-63 CD133+細胞亞群及相應CD133-細胞亞群用5-氟尿嘧啶及白藜蘆醇進行體外處理。MG-63細胞的相對細胞活力用MTT法進行檢測；細胞凋亡率用流式細胞術進行檢測；用Western blot實驗檢測caspase-9和caspase-3的活化、Apaf-1的表達水平及細胞色素C的釋放；用免疫共沉淀法檢測Apaf-1與caspase-9前體的相互作用。結果: 5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群的殺傷活性和凋亡誘導活性均顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群。但聯(lián)用白藜蘆醇能顯著提高5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群的細胞活力抑制率。白藜蘆醇處理能顯著上調MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1的表達水平，在MG-63 CD133+細胞亞群中轉染Apaf-1 siRNA后，5-氟尿嘧啶聯(lián)用白藜蘆醇的協(xié)同效應受到顯著抑制。另外，免疫共沉淀實驗結果表明白藜蘆醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶能顯著誘導MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1/caspase-9復合物的形成，從而誘導caspase-9發(fā)生活化。結論: 白藜蘆醇通過促進Apaf-1/caspase-9復合物的形成,增強5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群凋亡的誘導。

白藜蘆醇; 5-氟尿嘧啶; 骨肉瘤; CD133+細胞亞群; Apaf-1; Caspase-9

骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。在骨肉瘤的治療中，化療是一種不可替代的行之有效的治療方法。然而在化療過程中，腫瘤細胞會逐漸產生耐藥性，從而大大限制了化療的臨床應用[2]。近期的研究表明癌癥可以被認為是一種干細胞失調性疾病，腫瘤可能是由一種具有“干細胞樣”的惡性細胞增殖形成的。CD133是一種表達于干細胞表面的糖蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤細胞(如骨肉瘤細胞)表面也表達CD133，這些CD133+的腫瘤細胞相比于普通的CD133-腫瘤細胞具有更強的增殖能力、自我更新能力和耐藥性，經鑒定這些CD133+的腫瘤細胞具有“腫瘤干細胞(can-cer stem cells，CSCs)”的特性[3-5]。5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的同類物，在腫瘤細胞中通過阻斷脫氧核糖尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶而干擾DNA的合成。因此5-氟尿嘧啶能阻斷腫瘤細胞的DNA修復機制，從而使細胞進入凋亡程序[6-7]。然而，一些腫瘤細胞(特別是CD133+的腫瘤細胞)對5-氟尿嘧啶的治療不敏感，并且分子機制也不十分清楚[8]。因此，研究CD133+細胞亞群如何產生對5-氟尿嘧啶抵抗的分子機制并采取輔助治療手段提高CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性有十分重要的意義。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細胞系MG-63購于ATCC。CD133-FITC熒光抗體用于MG-63 CD133+細胞亞群的分選：將MG-63細胞系用CD133-FITC熒光抗體在暗處冰上孵育30 min，之后用生理鹽水將細胞洗滌3遍后用流式細胞儀進行細胞分選，F(xiàn)ITC熒光強度高的MG-63細胞即分選為MG-63 CD133+細胞亞群，F(xiàn)ITC熒光強度弱的MG-63細胞即分選為MG-63 CD133-細胞亞群。MG-63 CD133+細胞亞群及MG-63 CD133-細胞亞群均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。

2 實驗試劑

噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、白藜蘆醇、Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒和5-氟尿嘧啶購于Sigma；CD133-FITC熒光抗體購于Miltenyi Biotec；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco；細胞蛋白提取液以及抗人cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、caspase-9前體(pro-caspase-9)、Apaf-1、細胞色素C和β-actin的抗體購于CST；線粒體分離試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于Santa Cruz；Apaf-1 siRNA購于上海吉瑪生物，正向序列為5’-UGCUCUACUACAUGAAGGAUU-3’, 反向序列為5’-UCCUUCAUGUAGUAGAGCAUU-3’； Lipofectami-ne 2000購于Invitrogen； ECL試劑盒購于Pierce。

3 方法

3.1Apaf-1基因沉默 為了抑制MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1的蛋白表達，根據Apaf-1 mRNA編碼區(qū)序列，設計了幾對Apaf-1 siRNA，其中，正向序列為5’-UGCUCUACUACAUGAAGGAUU-3’, 反向序列為5’-UCCUUCAUGUAGUAGAGCAUU-3’的Apaf-1 siRNA具有良好的效果，能有效抑制MG-63細胞中Apaf-1蛋白的表達。在進行Apaf-1基因沉默實驗時，將MG-63 CD133+細胞亞群接種在培養(yǎng)板上，孵育過夜后將Apaf-1 siRNA(終濃度為50 nmol/L)用Lipofectamine 2000轉染入腫瘤細胞中，培養(yǎng)24 h。

3.2 5-氟尿嘧啶半數(shù)有效濃度(IC50)的測定 將MG-63 CD133+細胞亞群和MG-63 CD133-細胞亞群按每孔5×103接種在96孔板上孵育過夜，分成MG-63 CD133+細胞亞群組和CD133-細胞亞群組。2組細胞用0～10 μmol/L 5-氟尿嘧啶處理腫瘤細胞48 h，之后加入20 mL MTT (5 g/L)于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，移除孔內培養(yǎng)基，加入100 μL二甲亞砜，570 nm波長下測定吸光度(A)。細胞活力結果用5-氟尿嘧啶處理組與對照組的A值比值表示。根據細胞活力實驗結果曲線計算5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群和MG-63 CD133-細胞亞群的IC50。

3.3 細胞凋亡實驗 實驗分為MG-63 CD133-細胞亞群對照組、MG-63 CD133-細胞亞群5-氟尿嘧啶處理組、MG-63 CD133+細胞亞群對照組和MG-63 CD133+細胞亞群5-氟尿嘧啶處理組。將MG-63 CD133+細胞亞群或MG-63 CD133-細胞亞群按每孔5×105接種在6孔板上，孵育過夜使細胞完全貼壁。將5-氟尿嘧啶(終濃度為6 μmol/L)加入到培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)48 h。之后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶和Annexin V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin V陽性細胞即為凋亡細胞。

3.4 細胞活力的檢測 實驗分為MG-63 CD133+細胞亞群對照組、MG-63 CD133+細胞亞群白藜蘆醇處理組、MG-63 CD133+細胞亞群5-氟尿嘧啶處理組、MG-63 CD133+細胞亞群5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇處理組和MG-63 CD133+細胞亞群5-氟尿嘧啶+白藜蘆醇+Apaf-1 siRNA處理組。將MG-63 CD133+細胞亞群按每孔5×103接種在96孔板上，孵育過夜使細胞完全貼壁。將Apaf-1 siRNA(終濃度為50 nmol/L)用0.5 μL的Lipofectamine 2000進行轉染并用100 μL無血清培養(yǎng)基孵育6 h，之后將無血清培養(yǎng)基更換為100 μL有血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后按照實驗設計將白藜蘆醇(終濃度為10 μmol/L，該濃度白藜蘆醇對MG-63 CD133+細胞亞群細胞活力幾乎無影響)及5-氟尿嘧啶(終濃度為6 μmol/L，該濃度5-氟尿嘧啶單獨處理僅對MG-63 CD133+細胞亞群有輕微的細胞活力抑制作用)加入到培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)48 h。之后加入20 μL MTT (5 g/L)培養(yǎng)4 h，移除孔內培養(yǎng)基，加入100 μL二甲亞砜，570 nm波長下測定A值。相對細胞活力結果用實驗組與對照組的A值比值表示。

3.5 線粒體分離 使用線粒體分離試劑盒分離MG-63 CD133+細胞亞群的線粒體和細胞質，用以檢測細胞質中細胞色素C的表達以確定白藜蘆醇(終濃度為10 μmol/L)、5-氟尿嘧啶(終濃度為6 μmol/L)及Apaf-1 siRNA(終濃度為50 nmol/L)處理后MG-63 CD133+細胞亞群的細胞色素C的釋放。

3.6 Western blot實驗 實驗分為對照組、白藜蘆醇處理組、5-氟尿嘧啶處理組、5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇處理組和5-氟尿嘧啶+白藜蘆醇+Apaf-1 siRNA處理組。將MG-63 CD133+細胞亞群或MG-63 CD133-細胞亞群按每孔5×105接種在6孔板上，孵育過夜使細胞完全貼壁。將細胞用白藜蘆醇(終濃度為10 μmol/L)、5-氟尿嘧啶(終濃度為6 μmol/L)和Apaf-1 siRNA(終濃度為50 nmol/L)處理后用蛋白提取液裂解細胞。裂解后的樣品用12% SDS-PAGE進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用抗cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、pro-caspase-9、Apaf-1、細胞色素C和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。目的蛋白的相對表達用目標蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。

3.7 免疫共沉淀 實驗分為對照組、白藜蘆醇處理組、5-氟尿嘧啶處理組、5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇處理組和5-氟尿嘧啶+白藜蘆醇+Apaf-1 siRNA處理組。將MG-63 CD133+細胞亞群用白藜蘆醇、5-氟尿嘧啶和Apaf-1 siRNA處理后裂解細胞并將細胞在12 000 r/min下離心10 min，收取上清液分成等量2份，一份直接進行Western blot實驗檢測β-actin的表達作為對照，另外一份加入Apaf-1抗體孵育過夜。Apaf-1抗體孵育完畢后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2 h。經過2 h免疫沉淀反應后進行Western blot實驗，檢測與Apaf-1結合的pro-caspase-9蛋白。結合pro-caspase-9蛋白的相對表達用目標蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

4 統(tǒng)計學處理

所有實驗重復3次，實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示并用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。兩組間均數(shù)的比較采用 Student’st檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群

流式細胞術實驗結果顯示MG-63 CD133+細胞亞群高表達CD133，而MG-63 CD133-細胞亞群不表達CD133，表明通過細胞表面標記CD133能將MG-63骨肉瘤細胞分為CD133+細胞群體和CD133-細胞群體。MTT細胞活力實驗結果顯示MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶(0～10 μmol/L)的敏感性顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群。直觀地看，5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群的IC50顯著高于MG-63 CD133-細胞亞群，表明骨肉瘤CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶有耐藥性。流式細胞術實驗結果顯示MG-63 CD133+細胞亞群在5-氟尿嘧啶(6 μmol/L)處理下的凋亡率顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群，同時MG-63 CD133+細胞亞群在5-氟尿嘧啶的處理下，caspase-9和caspase-3的活化程度顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群，這些結果表明骨肉瘤CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶誘導的凋亡信號不敏感，見圖1。

2 白藜蘆醇提高MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性

MTT細胞活力實驗結果顯示5-氟尿嘧啶(6 μmol/L)單獨處理對MG-63 CD133+細胞亞群的殺傷活性較弱，然而聯(lián)合白藜蘆醇后，5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群的殺傷活性顯著提高，表明白藜蘆醇輔助治療能提高骨肉瘤CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性。Western blot實驗結果顯示MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1蛋白的表達水平顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群，提示骨肉瘤CD133+細胞亞群可能通過Apaf-1途徑抵抗5-氟尿嘧啶的抗腫瘤活性。同時，實驗結果顯示白藜蘆醇能顯著上調MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1的表達水平，提示白藜蘆醇在MG-63 CD133+細胞亞群中對5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用可能與Apaf-1的上調有關。進一步的實驗結果顯示在MG-63 CD133+細胞亞群中轉染Apaf-1 siRNA沉默Apaf-1的表達后，白藜蘆醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶對MG-63 CD133+細胞亞群的殺傷活性受到顯著抑制，證實了白藜蘆醇通過上調Apaf-1的表達提高MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性，見圖2。

Figure 1.The sensitivity of MG-63 CD133+cell subset to 5-fluorouracil was significantly lower than that of MG-63 CD133-cell subset. A: sorting efficiency of MG-63 CD133+cell subset and MG-63 CD133-cell subset was analyzed by flow cytometry； B: the IC50of 5-fluorouracil for MG-63 CD133+cell subset was significantly higher than that for MG-63 CD133-cell subset; C: the apoptotic rate of MG-63 CD133+cell subset treated with 5-fluorouracil (6 μmol/L) was significantly lower than that of MG-63 CD133-cell subset; D: activation of caspase-9 and caspase-3 in the MG-63 CD133+cell subset treated with 5-fluorouracil was significantly lower than that in the MG-63 CD133-cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsMG-63 CD133-cell subset (control);#P<0.05vsMG-63 CD133+cell subset control;△P<0.05vs5-fluorouracil-treated MG-63 CD133-cell subset.

圖1 MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性顯著低于MG-63 CD133-細胞亞群

Figure 2.Resveratrol increased the sensitivity of MG-63 CD133+cell subset to 5-fluorouracil by downregulating the expression of Apaf-1. A: resveratrol enhanced the cytotoxicity of 5-fluorouracil to MG-63 CD133+cell subset; B: the expression of Apaf-1 was significantly lower in the MG-63 CD133+cell subset than that in the MG-63 CD133-cell subset; C: resveratrol significantly downregulated the expression of Apaf-1 in the MG-63 CD133+cell subset; D:Apaf-1 siRNA inhibited the cytotoxicity of the co-treatment with 5-fluorouracil and resveratrol in the MG-63 CD133+cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5-fluorouracil group;△P<0.05vsMG-63 CD133-cell subset;▲P<0.05vsresveratrol+5-fluorouracil group.

圖2 白藜蘆醇通過下調Apaf-1的表達提高MG-63 CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性

3 白藜蘆醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶誘導Apaf-1/caspase-9復合物的形成

研究表明，只有在細胞色素C的存在下，caspase-9前體才能通過與Apaf-1的結合而發(fā)生活化[9]。本實驗結果顯示5-氟尿嘧啶能顯著誘導細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，而與白藜蘆醇無關。另外，白藜蘆醇單獨處理雖能上調MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1的表達卻不能直接誘導Apaf-1與caspase-9的相互作用，而白藜蘆醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶不僅能上調MG-63 CD133+細胞亞群中Apaf-1的表達，同時也能誘導Apaf-1與caspase-9的相互作用，這些結果表明5-氟尿嘧啶通過誘導細胞色素C的釋放介導細胞的凋亡，而白藜蘆醇通過上調Apaf-1的表達促進5-氟尿嘧啶誘導的Apaf-1/caspase-9復合物的形成。另外，Western blot實驗結果顯示白藜蘆醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶能顯著活化caspase-9及其下游效應分子caspase-3。沉默Apaf-1的表達后，白藜蘆醇則不能促進5-氟尿嘧啶對caspase-9的活化，表明白藜蘆醇通過上調Apaf-1的表達促進5-氟尿嘧啶對caspase-9及其下游效應分子caspase-3的活化，見圖3。

Figure 3.Resveratrol promoted the activation of caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1. A: 5-fluorouracil induced the release of cytochrome C in the MG-63 CD133+cell subset; B: resveratrol promoted 5-fluorouracil-induced interaction between Apaf-1 and pro-caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1 in the MG-63 CD133+cell subset; C: co-treatment with resveratrol and 5-fluorouracil significantly triggered the activation of caspase-9 and caspase-3 in the MG-63 CD133+cell subset. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5-fluorouracil group;△P<0.05vsresveratrol+5-fluorouracil group.

圖3 白藜蘆醇通過上調Apaf-1的表達促進caspase-9的活化

討 論

腫瘤組織中CD133+細胞亞群的存在是造成藥物抵抗的重要因素，因此CD133+細胞亞群是腫瘤治療的重要靶點[10]。白藜蘆醇是一種有很強藥理活性的天然多酚類物質，對多種疾病均有良好的治療效果。近期的研究表明白藜蘆醇還有十分良好的抗腫瘤效應，如白藜蘆醇可抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移[11]，還可通過ROS途徑誘導卵巢癌細胞的死亡[12]。另外，白藜蘆醇聯(lián)合雷帕霉素還可有效治療膀胱癌[13]。盡管如此，白藜蘆醇對CD133+細胞亞群的輔助治療作用至今還很少報道。在本研究中，實驗結果表明白藜蘆醇單獨處理雖不能顯著殺傷骨肉瘤CD133+細胞亞群，但其卻能顯著提高5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群的殺傷能力，兩者聯(lián)合治療對骨肉瘤CD133+細胞亞群有協(xié)同效應。

研究表明5-氟尿嘧啶能誘導腫瘤細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡，使細胞色素C等凋亡誘導因子從線粒體中釋放到細胞質中從而激活細胞的凋亡通路[14-15]。在細胞色素C依賴的凋亡信號通路中，下游分子caspase-9的活化至關重要，活化的caspase-9能直接激活caspase-3這一效應分子，進而使腫瘤細胞的DNA發(fā)生片段化而發(fā)生凋亡[16-17]。研究表明在細胞色素C活化caspase-9的過程中，Apaf-1蛋白的參與至關重要。Apaf-1是一個分子量為130 kD 的凋亡相關蛋白，有多個caspase結合位點。細胞質中的Apaf-1在細胞色素C的活化下能與caspase-9前體結合，從而激活caspase-9并誘導細胞發(fā)生caspases依賴的凋亡[18-19]。在本研究中，實驗結果表明白藜蘆醇增強5-氟尿嘧啶對骨肉瘤CD133+細胞亞群殺傷活性的機制和其能上調Apaf-1的表達有關。5-氟尿嘧啶能引起骨肉瘤CD133+細胞亞群細胞色素C的釋放，而白藜蘆醇可能通過上調Apaf-1的表達增加其與caspase-9的結合，從而增強caspase-9的活化和凋亡，因此5-氟尿嘧啶和白藜蘆醇存在協(xié)同抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究證明了白藜蘆醇能顯著提高骨肉瘤CD133+細胞亞群對5-氟尿嘧啶的敏感性。通過機制研究我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過上調Apaf-1的表達使骨肉瘤CD133+細胞亞群中的caspase-9在細胞色素C的作用下與Apaf-1結合而發(fā)生活化，進而使骨肉瘤CD133+細胞亞群進入凋亡程序。這些研究為逆轉5-氟尿嘧啶對骨肉瘤的耐藥性提供了新的思路和理論依據。

[1] 黃志平, 邵立龍, 阮陽平. 雷公藤紅素通過ROS/JNK途徑誘導Saos-2細胞發(fā)生caspase依賴的凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1457-1461.

[2] Ando K, Heymann MF, Stresing V, et al. Current therapeutic strategies and novel approaches in osteosarcoma[J]. Cancers (Basel), 2013, 5(2):591-616.

[3] de Sousa E Melo F, Vermeulen L. Wnt signaling in can-cer stem cell biology[J]. Cancers (Basel), 2016, 8(7): e60.

[4] Hong M, Tan HY, Li S, et al. Cancer stem cells: the potential targets of chinese medicines and their active compounds[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(6):e893.

[5] Ni M, Xiong M, Zhang X, et al. Poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles conjugated with CD133 aptamers for targeted salinomycin delivery to CD133+osteosarcoma cancer stem cells[J]. Int J Nanomedicine, 2015, 10:2537-2554.

[6] 劉 宇, 高 東, 鐘靜靜, 等. 阿司匹林與氟尿嘧啶協(xié)同抑制結腸癌細胞生長增殖的機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6):988-993.

[7] Zhang JT, Zhou WL, He C, et al. 5-Fluorouracil induces apoptosis of colorectal cancer cells[J]. Genet Mol Res, 2016, 15(1):15017326.

[8] Zhan Y, Mou L, Cheng K, et al. Hepatocellular carcinoma stem cell-like cells are enriched following low-dose 5-fluorouracil chemotherapy[J]. Oncol Lett, 2016, 12(4):2511-2516.

[9] McStay GP, Green DR. Preparation of cytosolic extracts and activation of caspases by cytochromec[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2014, 2014(7):778-782.

[10]吳乾波, 張 敏, 陶志華. 歐前胡素通過下調c-met的表達提高肺癌CD133+細胞亞群對吉非替尼的敏感性[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(1):46-52.

[11]Du Z, Zhou F, Jia Z, et al. The hedgehog/Gli-1 signaling pathways is involved in the inhibitory effect of resveratrol on human colorectal cancer HCT116 cells[J]. Iran J Basic Med Sci, 2016, 19(11):1171-1176.

[12]Seino M, Okada M, Shibuya K, et al. Differential contribution of ROS to resveratrol-induced cell death and loss of self-renewal capacity of ovarian cancer stem cells[J]. Anticancer Res, 2015, 35(1):85-96.

[13]Alayev A, Salamon RS, Schwartz NS, et al. Combination of rapamycin and resveratrol for treatment of bladder cancer[J]. J Cell Physiol, 2017, 232(2):436-446.

[14]Hu Z, Lv G, Li Y, et al. Enhancement of anti-tumor effects of 5-fluorouracil on hepatocellular carcinoma by low-intensity ultrasound[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016, 35:71.

[15]Su J, Cheng H, Zhang D, et al. Synergistic effects of 5-fluorouracil and gambogenic acid on A549 cells: activation of cell death caused by apoptotic and necroptotic mechanisms via the ROS-mitochondria pathway[J]. Biol Pharm Bull, 2014, 37(8):1259-1268.

[16]Wen Q, Zhang X, Cai J, et al. A novel strategy for real-time andinsitudetection of cytochrome c and caspase-9 in Hela cells during apoptosis[J]. Analyst, 2014, 139(10):2499-2506.

[17]Liu J, Qin CK, Lv W, et al. OSU-03012, a non-COX inhibiting celecoxib derivative, induces apoptosis of human esophageal carcinoma cells through a p53/Bax/cytochromec/caspase-9-dependent pathway[J]. Anticancer Drugs, 2013, 24(7):690-698.

[18]Hu Q, Wu D, Chen W, et al. Molecular determinants of caspase-9 activation by the Apaf-1 apoptosome[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(46):16254-16261.

[19]Shang J, Yang F, Wang Y, et al. MicroRNA-23a antisense enhances 5-fluorouracil chemosensitivity through APAF-1/caspase-9 apoptotic pathway in colorectal cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2014, 115(4):772-784.

(責任編輯： 盧 萍, 羅 森)

Resveratrol enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis of osteosarcoma CD133+cell subset by promoting formation of Apaf-1/caspase-9 complex

ZHANG Hong-ping, YUAN Mei

(DepartmentofClinicalLaboratory,JiaxingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiaxing314001,China.E-mail:jxyuanhongping@163.com)

AIM: To investigate the synergistic effect of resveratrol and 5-fluorouracil on osteosarcoma CD133+cell subset. METHODS: Human osteosarcoma cell line MG-63 CD133+cell subset and the corresponding CD133-cell subset were treated with resveratrol and 5-fluorouracil. After treatment, the viability of MG-63 cells was measured by MTT assay. The apoptosis of MG-63 cells was analyzed by flow cytometry. Activation of caspase-9 and caspase-3, the expression of Apaf-1, and the release of cytochrome C were evaluated by Western blot. The interaction between Apaf-1 and pro-caspase-9 was detected by co-immunoprecipitation. RESULTS: The cell death and apoptosis of MG-63 CD133+cell subset induced by 5-fluorouracil were significantly weaker than those in the corresponding MG-63 CD133-cell subset. However, co-treatment with resveratrol significantly enhanced the effect of 5-fluorouracil on inhibiting the viability of MG-63 CD133+cell subset. Mechanically, treatment with resveratrol upregulated the expression of Apaf-1. Transfection withApaf-1 siRNA abolished the synergistic effect of resveratrol and 5-fluorouracil in MG-63 CD133+cell subset. In addition, the results of co-immunoprecipitation indicated that the combination of resveratrol and 5-fluorouracil significantly induced the formation of Apaf-1/pro-caspase-9 complex, leading to the activation of caspase-9 in MG-63 CD133+cell subset. CONCLUSION: Resveratrol enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis of osteosarcoma CD133+cell subset by promoting the formation of Apaf-1/caspase-9 complex.

Resveratrol; 5-Fluorouracil; Osteosarcoma; CD133+cell subset; Apaf-1; Caspase-9

1000- 4718(2017)07- 1196- 07

2016- 12- 14

2017- 02- 22

R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.007

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