雙柏膏微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

鐘柳芳 肖文可 孫樹周 溫穎婉

·實(shí)驗(yàn)研究·

雙柏膏微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

鐘柳芳 肖文可 孫樹周 溫穎婉

目的建立雙柏膏的微生物限度檢查方法, 并進(jìn)行適用性實(shí)驗(yàn)。方法按照中國藥典(2015年)對(duì)雙柏膏進(jìn)行微生物限度檢查適用性試驗(yàn)。雙柏膏可溶于十四烷酸異丙酯, 溶解后薄膜過濾,并在水相沖洗液中加入乳化劑聚山梨酯80, 控制菌檢查采用薄膜法。結(jié)果需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性實(shí)驗(yàn)中的回收率比值均在 0.5～2 內(nèi), 控制菌生長良好, 符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。結(jié)論該方法有效可行, 可用于雙柏膏的微生物限度檢查。

雙柏膏；微生物限度；適用性試驗(yàn)；薄膜過濾

雙柏膏是廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院制劑, 處方來源于85年版醫(yī)院制劑規(guī)范中的雙柏膏。處方主要成分為黃柏、側(cè)柏葉、冰片、凡士林組成的一種外用中藥復(fù)方膏劑, 具有清熱、消炎、祛瘀、止痛的功效［1-3］。臨床上用于跌打損傷、瘡?fù)茨[毒、消炎等癥, 是現(xiàn)代骨傷科中藥治療的主要藥物。為了提高雙柏膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 更準(zhǔn)確地反映該制劑質(zhì)量真實(shí)狀況, 確保醫(yī)院制劑的用藥安全, 本文根據(jù)《中國藥典》2015年版四部［3］微生物限度檢查法中的相關(guān)規(guī)定, 雙柏膏微生物限度檢查法進(jìn)行了重新修訂并進(jìn)行了適用性試驗(yàn)。在適用性試驗(yàn)過程中,發(fā)現(xiàn)該制劑處方中黃柏［1］、側(cè)柏葉［2］、冰片［3］對(duì)微生物限度檢查造成嚴(yán)重干擾, 常規(guī)平皿法、稀釋法檢查需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性實(shí)驗(yàn)中的回收率比值均不在 0.5～2 內(nèi)。利用雙柏膏可溶于十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液, 用薄膜過濾法可以有效地去除抑菌成分, 達(dá)到滿意的效果, 現(xiàn)對(duì)研究作如下匯報(bào)分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(型號(hào)：YM30Z, 上海三申醫(yī)療設(shè)備公司);霉菌培養(yǎng)箱(型號(hào)：LRH-150, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司);生化培養(yǎng)箱(型號(hào)：SPX-150B, 上海悅豐儀器表有限公司)；電熱恒溫水浴箱WBK-4A, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；無菌檢查儀(型號(hào)：WJ-6, 天津市羅根科技有限公司)；快速混合儀(型號(hào)：SZ-1, 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；生物安全柜(型號(hào)：BHC-1300ⅡA2,蘇凈集團(tuán)蘇冊(cè)安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 供試藥品 雙柏膏(批號(hào)：20160911、201601007、20161116,廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院制劑室)。

1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):20160816)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)(批號(hào)31105120)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)(批號(hào):3104880)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3102307)、pH=7.0無菌氯化鈉蛋白凍緩沖液(3104875)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：3104874), 以上培養(yǎng)基均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn), 均按照《中國藥典》2015版第四部通則有關(guān)規(guī)定配制并驗(yàn)證。

1.4 菌株 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心提供, 黑曲霉由中國藥品生物制品檢定所提供, 用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

1.5 方法

1.5.1 菌液的制備 按照中國藥典 2015 年版要求, 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌分別接種于新鮮培養(yǎng)物, 然后至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中, 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的TSB于33℃環(huán)境中培養(yǎng) 18 h；枯草芽孢桿菌的TSB在33℃環(huán)境中培養(yǎng) 24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中, 23℃環(huán)境中培養(yǎng)48 h(菌液a)。用 0.9%無菌氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物制成每1 ml含菌數(shù)≤100 cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物培養(yǎng) 120 h, 用 5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液(含 0.05%聚山梨酯 80)將孢子洗脫, 再用無菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi), 用含 0.05%聚山梨酯 80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成孢子懸液(每 1 ml含孢子數(shù)≤100 cfu)。

1.5.2 供試液制備

1.5.2.1 供試液的制備 取10 g雙柏膏可溶于20 m l十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的p H=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 m l分液漏斗中充分振搖、萃取,靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液(供試液a)。

1.5.2.2 試驗(yàn)組 取供試液a 1 m l, 加入 100 m l p H =7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中, 同時(shí)加入1 m l菌液a, 搖勻后薄膜過濾, 每膜用上述緩沖液600 m l 分次沖洗過濾, 取出濾膜貼至相應(yīng)的瓊脂平皿, 按中國藥典2015 年版規(guī)定培養(yǎng)。真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)為白色念珠菌和黑曲霉, 培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。總數(shù)計(jì)數(shù)的需氧菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉, 培養(yǎng)基為T S B, 每種試驗(yàn)菌株的試驗(yàn)組過濾、培養(yǎng)2 次。

1.5.2.3 供試品對(duì)照組 取供試液a 1 m l, 不加菌液, 根據(jù)試驗(yàn)組方法計(jì)數(shù)菌數(shù)。每種試驗(yàn)菌株的供試品對(duì)照組同法操作 2 次。

1.5.2.4 菌液對(duì)照組 用p H=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液, 在100 m l稀釋液中加入1 m l試驗(yàn)菌液, 根據(jù)試驗(yàn)組方法測(cè)定菌數(shù)。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收率計(jì)算公式：試驗(yàn)組菌回收率比值=試驗(yàn)組菌落數(shù)供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

1.5.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 取10 g雙柏膏可溶于20 ml十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液(供試液a)。

1.5.3.1 金黃色葡萄球菌檢查適用性試驗(yàn)結(jié)果 取兩份10 ml供試液a薄膜過濾, 用pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至600 ml, 分3次沖洗, 200 ml/次, 在最后一次沖洗液中分別加入銅綠假單胞菌、含菌50～100 cfu的金黃色葡萄球菌懸液1 ml, 過濾, 取出濾膜, 接種100 ml TSB中, 30～35℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h, 取培養(yǎng)物分別劃線接種于溴化十六烷基三甲銨(CTMAB)瓊脂培養(yǎng)基和甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板,培養(yǎng)18～72 h, 每種菌平行制備2張濾膜。

1.5.3.2 陰性對(duì)照組 以稀釋劑代替供試液, 不加試驗(yàn)菌,照“1.5.2.2”項(xiàng)中的步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組菌回收率均在《中國藥典》(2015年)中規(guī)定的 0.5～2 cfu/皿, 說明薄膜過濾法應(yīng)用于本品具有可行性。見表1, 表2。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 銅綠假單胞菌控制菌及金黃色葡萄球菌控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果 兩種菌的適用性試驗(yàn)中試驗(yàn)組均為陽性, 對(duì)照組均為陰性, 說明此法應(yīng)用于本品微生物限度控制菌檢查具有可行性。見表3, 表4。

表3 銅綠假單胞菌控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果

表4 金黃色葡萄球菌控制菌適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

雙柏膏是《中醫(yī)傷科學(xué)講義》中的經(jīng)典處方, 常規(guī)檢查法［4］會(huì)對(duì)檢查造成干擾。為降低抑菌成分, 消除干擾, 本次研究中采用薄膜過濾法進(jìn)行檢查, 試驗(yàn)中將樣品直接溶于無菌十四烷酸異丙酯, 用勻漿儀混勻, 取下清液膜過濾的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 為確保過濾效果良好, 采用含有0.5%乳化劑聚山梨酯 80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液, 用薄膜過濾法可以有效地去除抑菌成分, 能輕松通過微孔膜過濾, 避免濾膜堵塞。在實(shí)驗(yàn)過程中使用微生物限度儀沖洗900 ml, 分析金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組回收比值產(chǎn)生的原因可能與沖洗時(shí)微生物限度儀底座一直固定, 導(dǎo)致藥物無法充分洗脫有關(guān)。在沖洗的過程中, 集菌儀邊沖洗邊振搖則沖洗至900 ml各菌株的回收比值則可達(dá)到要求。通過表1、表2可以看出, 試驗(yàn)組菌回收率均在《中國藥典》(2015年)中規(guī)定的 0.5～2 cfu/皿, 說明薄膜過濾法應(yīng)用于本品具有可行性。此外, 兩種控制菌的適用性試驗(yàn)中試驗(yàn)組均為陽性, 對(duì)照組均為陰性, 說明此法應(yīng)用于本品微生物限度控制菌檢查具有可行性。結(jié)合工作經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為試驗(yàn)中的供試液制備較為繁瑣復(fù)雜, 尤其是非水溶性又具抗菌作用的軟膏制劑, 因而建議最好選用能溶解基質(zhì)的有機(jī)溶劑(無菌十四烷酸異丙酯)必要時(shí)可加熱45℃以下的加入含有0.1%～1%乳化劑聚山梨酯 80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液100 ml置于分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置取下層液作為(1:10)供試液, 這樣可直接用薄膜過濾法進(jìn)行微生物限度檢查方法, 并能通過適用性試驗(yàn), 本方法驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

［1］ 吳嘉瑞, 張冰, 張光敏.黃柏藥理作用研究進(jìn)展.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2009, 5(11):160-162.

［2］ 張俊飛, 孫廣璐, 張彬, 等.側(cè)柏葉藥理作用的研究進(jìn)展.時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(9):2231-2233.

［3］ 姜建昌, 曹雷, 姚瑜潔, 等.冰片的臨床應(yīng)用研究概況.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 22(2):221-223.

［4］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典(2015年版四部).北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015：附錄1105-1106.

Applicability test of microbial limit test for Shuangbai ointment

ZHONG Liu-fang, XIAO Wen-ke, SUN Shu-zhou, et al.
Guangzhou City Panyu District Institute of Food and Drug Control, Guangzhou 511400, China

ObjectiveTo establish microbial limit test for Shuangbai ointment, and perform applicability test.MethodsApplicability test of microbial limit test was made on Shuangbai ointment according to Chinese Pharmacopoeia (2015).Shuangbai ointment was soluble in isopropyl myristate.After dissolution, the membrane was filtered and emulsifier 80 was added into aqueous washing solution.The control bacteria were examined by membrane method.ResultsThe recovery ratio of aerobic bacteria count, fungi and yeasts count in applicability test was all within 0.5-2.The control bacteria grew well and met the requirements of "Chinese Pharmacopoeia" 2015 edition.ConclusionThis method is reliable and feasible, and it can be used in microbial limit test of Shuangbai ointment.

Shuangbai ointment; Microbial limit; Applicability test; Membrane filtration

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.14.114

2017-03-22］

511400 廣州市番禺區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所