MMP-1、7、9基因多態(tài)性與青?；?、漢族胎膜早破相關(guān)性*

白玉芳，祁存秀，路 麗，沙仁高娃，王榮華，朱雪玲，鞏海風(fēng)，蘇占海

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科；2.青海大學(xué)研究生院；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院供應(yīng)室； 4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 青海 810001)

MMP-1、7、9基因多態(tài)性與青?；?、漢族胎膜早破相關(guān)性*

白玉芳1，祁存秀2，路 麗2，沙仁高娃2，王榮華3，朱雪玲2，鞏海風(fēng)2，蘇占海4

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科；2.青海大學(xué)研究生院；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院供應(yīng)室； 4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 青海 810001)

目的 利用PCR及測(cè)序方法分析青海地區(qū)回、漢族胎膜早破孕婦MMP-1、7、9基因多態(tài)性特點(diǎn)及是否具有民族差異性。方法 提取胎膜早破孕婦和對(duì)照組組織DNA，利用PCR和瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序法，檢測(cè)基因多態(tài)性并行相關(guān)分析。結(jié)果 MMP-1 rs1799750 G/G、-/G、-/-基因型頻率在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中分別是44.25%、51.33%、4.42%和34.29%、47.14%、18.57%，兩組基因型頻率分布具有顯著差異性(P=0.006)；在回族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別是45.98%、50.57%、3.45%和51.72%、34.48%、13.79%，兩組基因型頻率呈現(xiàn)顯著差異性(P=0.005)。MMP-7 rs11568818三種基因型A/A、A/G、G/G在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別是60.18%、37.17%、2.65%和84.29%、8.57%、7.14%，兩組相比，基因型頻率分布具有顯著差異性(P=0.000)；回族對(duì)照組和胎膜早破基因型頻率分布分別是9.77%、39.08%、1.15%和86.21%、6.90%、6.90%，兩組基因型頻率相比具有顯著差異性(P=0.000)。MMP-9 rs3918242 SNP三種基因型C/C、C/T、T/T在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分布分別是72.57%、26.55%、0.88%和70.00%、28.57%、1.43%，其基因型頻率在兩組中無(wú)顯著性差異(P=0.895)；在回族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別是71.26%、8.74%、0.00%和70.69%、27.59%、1.72%，兩組相比無(wú)顯著差異性(P=0.468)。結(jié)論 MMP-1 rs1799750和MMP-7 rs11568818基因多態(tài)性可能與青海漢、回族胎膜早破相關(guān)；而MMP-9 rs3918242基因多態(tài)性與胎膜早破無(wú)關(guān)。同時(shí)，MMP-1 rs1799750、MMP-7 rs11568818和MMP-9 rs3918242基因頻率分布在青海漢、回族對(duì)照組和胎膜早破組中無(wú)特異性。

MMP基因 基因多態(tài)性 胎膜早破 青海 回族 漢族

胎膜早破的發(fā)病原因多，近來(lái)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在對(duì)胎膜本身結(jié)構(gòu)的變化上，而對(duì)胎膜本身結(jié)構(gòu)的變化又主要集中在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)上。膠原的降解主要由MMP介導(dǎo)，當(dāng)分娩發(fā)動(dòng)后，胎膜組織中MMP活性顯著升高，從而加速對(duì)間質(zhì)膠原的降解，影響到胎膜組織結(jié)構(gòu)，從而使胎膜組織的強(qiáng)度下降，導(dǎo)致胎膜破裂[1-3]。

本研究利用PCR及SNP基因分型技術(shù)分析MMP-1、7、9基因多態(tài)性與青海回、漢族產(chǎn)婦胎膜早破的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)分析MMP基因多態(tài)性在胎膜早破中的表達(dá)是否具有民族特異性，最終為闡明青海回、漢族產(chǎn)婦胎膜早破分子機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及選擇標(biāo)準(zhǔn)

選取2015年8月～2016年12月，在青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海紅十字醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院、青海省交通醫(yī)院收集回族胎膜早破標(biāo)本58例，回族正常87例；漢族胎膜早破70例，漢族正常113例。胎膜早破納入標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集

在胎盤(pán)娩出后5 min 內(nèi)，于近宮頸的胎膜破口處，無(wú)菌剪取胎膜組織(2cm2)，用生理鹽水反復(fù)沖洗其表面污跡后，置滅菌過(guò)的標(biāo)本收集管中，入 -80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 試劑和設(shè)備選擇

無(wú)水乙醇、瓊脂糖、電泳緩沖液、基因組DNA提取試劑盒及引物(生工生物公司，上海)；離心機(jī)(Eppendorf AG，德國(guó))，恒溫箱(瑯玕公司，上海)，渦旋器(IKA Laboratory Equipment，荷蘭)，電泳儀(六一，北京)，Namedrop 2000 c分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，美國(guó))。

1.2.3 基因組DNA的提取

取小塊胎膜組織立刻置于液氮中研碎，加入Proteinase K溶液混勻后，恒溫箱中放置3 h，至組織溶解；按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，最后用無(wú)水乙醇沉淀并提純DNA，保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 PCR及SNP基因分型分析

PCR所需引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)為預(yù)變性99 ℃ 94 s，94 ℃ 45 s，退火55 ℃～57 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；每次取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1%瓊脂糖凝膠上100 V電壓下電泳40 min，溴化乙錠染色后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相并保存。最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序并進(jìn)行SNP技術(shù)分型，根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定基因型和基因頻率。

表1 MMP-1、-7、-9引物

Table 1 The primes of MMP-1，-7 and -9

1.2.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

提取的組織基因組DNA，上樣于1%瓊脂糖凝膠，并在200 V電壓下電泳30 min 后檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)掃描后保存，以備分析和驗(yàn)證。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0軟件處理，結(jié)果分析采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA電泳檢測(cè)

胎膜組織和胎膜早破組織DNA提取后，進(jìn)行DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)，并通過(guò)凝膠成效系統(tǒng)照相分析。結(jié)果顯示，基因組DNA提取成功，條帶清晰(圖1)。

(M：DNA Marker；1-4：正常孕婦胎膜組織DNA；5-7：胎膜早破孕婦組織DNA)

圖1 基因組DNA電泳結(jié)果

Figure 1 The results of genome electrophoresis

(M：DNA Marker；左側(cè)1-8為MMP-1引物PCR產(chǎn)物；右側(cè)1-8為 MMP-7引物PCR產(chǎn)物)

2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

通過(guò)DAN瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增狀態(tài)。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增成功，條帶較為清晰(圖2)。

2.3 SNP基因分型分析

圖3 MMP-1rs1799750 基因G/G型變?yōu)?/G型

Figure 3 The MMP-1 rs1799750 genotype G/G changed into -/G type

圖4 MMP-7 rs11568818基因A/G型變?yōu)锳/A型

圖5 MMP-9 rs3918242基因C/C型變?yōu)镃/T 型

對(duì)SNP基因分型發(fā)現(xiàn)，MMP-1 rs1799750基因G/G變?yōu)?/G基因型(圖3)；MMP-7 rs11568818基因中A/G型變?yōu)锳/A基因型(圖4)，MMP-9 rs3918242基因C/C型變?yōu)镃/T 基因型(圖5)。

其中，MMP-1 rs1799750 SNP三種基因型G/G、-/G、-/-在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別是44.25%、51.33%、4.42%和34.29%、47.14%、18.57%，且兩組基因型頻率分布具有顯著差異性(P=0.006)，其基因頻率也具有差異性(P=0.018)；在回族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別是45.98%、50.57%、3.45%和51.72%、34.48%、13.79%，兩組基因型頻率呈現(xiàn)顯著差異性(P=0.005)，其基因頻率分布具有差異性(P=0.019)(表2)。

表2 MMP-1rs1799750基因型分布及基因型頻率分析(%)

Table 2 Frequency distribution of MMP-1 rs1799750 genotype and allele(%)

MMP-7 rs11568818 SNP三種基因型A/A、A/G、G/G在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別為60.18%、37.17%、2.65%和84.29%、8.57%、7.14%。兩組相比，基因型頻率分布具有顯著差異性(P=0.000)，其基因頻率也具有差異性(P=0.016)；回族對(duì)照組和胎膜早破基因型頻率分布分別為9.77%、39.08%、1.15%和86.21%、6.90%、6.90%，兩組基因型頻率相比具有顯著差異性(P=0.000)，其基因頻率分布差異明顯(P=0.020)(表3)。

表3 MMP-7 rs11568818基因型分布及基因型頻率分析(%)

Table 3 Frequency distribution of MMP-7 rs11568818 genotype and allele(%)

MMP-9 rs3918242 SNP三種基因型C/C、C/T、T/T在漢族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分布分別為72.57%、26.55%、0.88%和70.00%、28.57%、1.43%，其基因型頻率和基因頻率在兩組中無(wú)顯著性差異(P=0.895，P=0.683)；同時(shí)在回族對(duì)照組和胎膜早破組中基因型頻率分別為71.26%、8.74%、0.00%和70.69%、27.59%、1.72%，兩組相比無(wú)顯著差異性(P=0.468)，其基因頻率在兩組中亦無(wú)差異(P=0.787)(表4)。

通過(guò)比較MMP-1 rs1799750、MMP-7 rs11568818和MMP-9 rs3918242基因型分別在漢族和回族對(duì)照組或者胎膜早破組中基因頻率的分布，發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)差異性(P>0.05)，說(shuō)明三個(gè)基因的基因頻率在青海漢族和回族對(duì)照組和胎膜早破組中無(wú)民族特異性。

表4 MMP-9 rs3918242基因型分布及基因型頻率分析(%)

Table 4 Frequency distribution of MMP-9 rs3918242 genotype and allele(%)

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，絕大多數(shù)SNPs本身雖不是易感性的原因，但在全基因組范圍內(nèi)比較易感和非易感人群之間的SNP圖譜，可顯示易感人群基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析尋找易感基因。研究顯示，胎膜細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解失衡是導(dǎo)致胎膜結(jié)構(gòu)薄弱、易于破裂的重要原因，而MMPs在ECM的降解中起著最為重要的作用。在胎盤(pán)和胎膜中主要為MMP-1、2、3、7、8、9等[4-6]。胎膜的胞外基質(zhì)成分包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，氨基葡聚糖，纖維結(jié)合素。其中，Ⅳ型膠原為基底膜的主要成分，在保持膜完整性方面起重要作用。MMP-1和MMP-8可以特異性地作用于胎膜中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原，使之降解。MMP-7基因定位于11q21-q22，cDNA長(zhǎng)1094 bp，分子量為28 KD。據(jù)報(bào)道，其啟動(dòng)子區(qū)-181位點(diǎn)存在A(yíng)/G多態(tài)性。此位點(diǎn)的A-G突變可使該基因的轉(zhuǎn)錄活性增高。因此，我們推測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的SNP可能通過(guò)影響MMP-7基因轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)水平而影響PROM的發(fā)生、發(fā)展[7-9]。正常妊娠時(shí)MMP-8不會(huì)出現(xiàn)在羊水內(nèi)，但會(huì)出現(xiàn)在宮頸組織中，有研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，宮頸的成熟往往伴隨著大量中性粒細(xì)胞的侵入，而中性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生大量MMP-8，從而使維持宮頸硬度的膠原水解，促使宮頸成熟。Shapiro[12-14]認(rèn)為，胎膜早破的原因是分娩發(fā)動(dòng)后MMP-9被激活，降解胎膜中的IV型膠原，最終導(dǎo)致胎膜破裂。而金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)作為MMPs的特異性抑制因子，能以非共價(jià)鍵形式緊密結(jié)合MMPs催化位點(diǎn)，從而抑制了MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[15-17]。因此，這些基因及其SNP分型都與胎膜早破有密切關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，MMP-1 rs1799750和MMP-7 rs11568818基因型頻率和基因頻率在漢族、回族對(duì)照組和胎膜早破組中分布具有顯著差異性，暗示其表達(dá)分布可能與胎膜早破具有一定相關(guān)性；而MMP-9 rs3918242基因型頻率和基因頻率分別在漢族、回族對(duì)照組或者胎膜早破組中分布均沒(méi)有顯著差異性。但分析上述三個(gè)位點(diǎn)基因頻率后發(fā)現(xiàn)，在青海漢族、回族對(duì)照組和胎膜早破組中其分布沒(méi)有民族特異性。

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The correlation study between MMP-1，7，9 gene polymorphism and premature rupture of membranes in the pregnant woman in Qinghai Han- and Hui-Chinese

BAI Yu-fang1，QI Cun-xiu2，LU Li2，SHAREN-Gaowa2， WANG Rong-hua3，ZHU Xue-ling2，GONG Hai-feng2，SU Zhan-hai4

(1.Dept. Of Obstetrics，Qinghai University Affiliated Hospital； 2.Graduate School of Qinghai University；3.Supply Room，Qinghai University Affiliated Hospital； 4.Basic Medical Research Center，Qinghai University Medical College；Xining，Qinghai，810001)

Objective To analyze the polymorphism of MMP-1，7，9 gene in pregnant women with premature rupture of membranes in Han- and Hui-Chinese at Qinghai province by PCR and sequencing.Methods Genome DNA was extracted from preterm premature rupture of membranes and control group.The polymorphism of the gene was analyzed by PCR，agarose gel electrophoresis and sequencing.Results The frequency of MMP-1 rs1799750 G/G，-/G，-/- genotype was 44.25%，51.33%，4.42% and 34.29%，47.14%，18.57%，respectively，in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.006).Meanwhile the frequency of genotype was 45.98%，50.57%，3.45% and 51.72%，34.48%，13.79% respectively in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.005).The frequency of MMP-7 rs11568818 A/A、A/G、G/G genotype was 60.18%、37.17%、2.65% and 84.29%、8.57%、7.14% in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.000).Meanwhile the frequency of genotype was 9.77%，39.08%，1.15% and 86.21%，6.90%，6.90%，respectively，in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.000).The frequency of MMP-9 rs3918242 C/C，C/T，T/T genotype was 72.57%，26.55%，0.88% and 70.00%，28.57%，1.43% in the Han control and the premature rupture of membranes groups，the genotype frequency was significantly different between two groups(P=0.895).Meanwhile the frequency of genotype was 71.26%，8.74%，0.00% and 70.69%，27.59%，1.72%，respectively，in the control and the premature rupture of membranes group in Hui Chinese，and the genotype frequency was obviously different between two groups(P=0.468).Conclusion The polymorphisms of MMP-1 rs1799750 and MMP-7 rs11568818 may be related to the premature rupture of membranes in Qinghai Han and Hui Chinese，and the polymorphism of MMP-9 rs3918242 gene is not related to premature rupture of membranes.Meanwhile，the allele frequencies of MMP-1 rs1799750，MMP-7 rs11568818 and MMP-9 rs3918242 are not specific between Han and Hui nationality.

MMP Genepolymorphism Premature Rupture of membranes Qinghai Han and Hui nationality

R393

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.006

2016-11-12

※：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016-ZJ-762)；青海省衛(wèi)生計(jì)生委指導(dǎo)性課題(2015) 白玉芳(1972～)，女，回族，青海籍，主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，副教授