“激飲康”對熱應(yīng)激肉兔血清兔瘟抗體及補(bǔ)體C3、C4含量的影響

李清豐，趙川，黃光遠(yuǎn)，王紅均，劉波，黃慶洲

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

“激飲康”對熱應(yīng)激肉兔血清兔瘟抗體及補(bǔ)體C3、C4含量的影響

李清豐，趙川，黃光遠(yuǎn)，王紅均，劉波，黃慶洲*

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

為探討“激飲康”對夏季熱應(yīng)激肉兔免疫機(jī)能的影響，以重慶榮昌夏季自然濕熱環(huán)境為熱應(yīng)激源，選擇 64 只 1 月齡健康伊拉兔，隨機(jī)分為“激飲康”高（I）、中（II）、低劑量組（III）及熱應(yīng)激對照組（IV），于正式試驗前1d接種兔瘟弱毒疫苗，觀察試驗后15d及30d時血清中兔瘟抗體及補(bǔ)體C3、C4含量的變化。結(jié)果表明:高溫高濕環(huán)境下，在肉兔飲水中添加“激飲康”可提高肉兔血清特異性兔瘟抗體、血清重要補(bǔ)體成分的含量，增強(qiáng)肉兔熱應(yīng)激狀態(tài)下的免疫能力。

兔；熱應(yīng)激；激飲康；抗體；補(bǔ)體

炎熱夏季熱應(yīng)激常常是危害肉兔生產(chǎn)的重要環(huán)境因素，往往會引起肉兔免疫功能下降、抗病力減弱、腸道疾病等，發(fā)病率及死亡率顯著增加[1-2]。為探討“激飲康”對夏季高溫時期肉兔免疫機(jī)能的影響，本試驗在夏季剛斷奶肉兔的飲水中添加“激飲康”后再接種兔瘟疫苗，觀察免疫后不同時間點血清中兔瘟抗體、補(bǔ)體C3及C4含量的變化，旨在為降低熱應(yīng)激對肉兔免疫機(jī)能的危害提供新方法。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

1.1.1 中藥 藿香、薄荷、石膏、黃芪、冰片、肉蓯蓉等12味中藥。

1.1.2 電解質(zhì) LCl、LHCO3、檸檬酸鈉。

1.1.3 兔瘟疫苗 兔病毒性出血癥滅活苗（南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：159142）。

1.1.4 免疫指標(biāo)測定試劑盒 兔瘟抗體（RHDV Ab）ELISA試劑盒，主要包括RHDV Ab標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記兔瘟病毒抗原、兔瘟病毒抗原（批號：201509）；兔 C3、C4 ELISA試劑盒，主要包括C3、C4標(biāo)準(zhǔn)品，兔C3、C4抗體，HRP標(biāo)記的 C3、C4抗體（生產(chǎn)批號：201509）。ELISA試劑盒均購于上海滬鼎生物科技有限公司。

1.2 動物 30日齡健康斷奶伊拉仔兔64只，體重0.5～0.6kg/只，雌雄各半（未接種過疫苗）。

1.3 試驗飼料 肉兔生長期配合飼料572（彭州某飼料有限公司生產(chǎn)），主要組成：豆粕、苜蓿草、麩皮、次粉、磷酸氫鈣、大豆油、食鹽、多種氨基酸、微量元素等。飼料成分分析保證值：粗蛋白質(zhì)≥15.5%、粗纖維14.0%～25.0%、粗灰分≤11.0%，總磷≥0.4%、鈣0.5%～1.5%、水溶性氯化物0.30%～0.80%、水分≤14%、賴氨酸≥0.7%。

1.4 方法

1.4.1“激飲康”的制備 “激飲康”飲水劑由中藥及電解質(zhì)兩部分組成。中藥部分：主要由藿香、薄荷、石膏、黃芪、冰片、肉蓯蓉等12味中藥按一定比例組成；清水浸泡過夜，水煎三次，每次40～60min，濾液合并，煮沸濃縮至生藥1g/mL藥液，分裝成250mL/瓶，120℃滅菌30min，避光保存?zhèn)溆?。電解質(zhì)部分：LCl、LHCO3、檸檬酸鈉等按比例混合后，分成30g/包密封備用。

1.4.2 動物飼養(yǎng)及分組 試驗在西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物房進(jìn)行。用4層16位兔籠飼養(yǎng)，每位2只，自由采食與飲水，舍內(nèi)自然通風(fēng)。預(yù)試5d，采食、飲水無異常后轉(zhuǎn)入正式試驗。正式試驗期間，每天6：00和18：00各喂料一次，喂料時根據(jù)上次喂料后兔的采食情況適當(dāng)增減料量，保持自由采食狀態(tài)。

正式試驗前一天將30日齡仔兔隨機(jī)分為4組，即“激飲康”高劑量組（I組）、中劑量組（II組）、低劑量組（III組）、熱應(yīng)激空白對照組（IV組）。每組16只，組內(nèi)共設(shè)8個重復(fù)，每個重復(fù)2只。試驗分兩個階段：第一階段35～50日齡，第二階段51～65日齡，試驗時間30d。

1.4.3 疫苗接種 正式試驗開始前1d（34日齡）于兔頸部皮下接種兔瘟滅活疫苗（1mL/只）；正式試驗第8d皮下接種巴氏桿菌疫苗（1mL/只）。

1.4.4“激飲康”使用方法 正式試驗開始后，I組、II組、III組每天在每千克飲水中分別添加“激飲康”中藥部分 4mL、2mL、1mL 與電解質(zhì) 6g、3g、1.5g，IV 組飲水中不添加任何藥物。

1.4.5 溫濕指數(shù)測定 在兔舍中部及四個角落內(nèi)上方距地面1.5m高處懸掛干濕溫度計，試驗期間每日7：00、11：00、15：00、19：00、23：00 記錄干濕球溫度。按Marai[3]提出的濕熱指數(shù)（THI）作為肉兔熱應(yīng)激狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)，THI計算公式：

式中db表示每天干球溫度平均值，RH表示每天平均相對濕度/100。當(dāng)THI＜27.8時，兔無熱應(yīng)激，THI在 27.8～28.9之間為輕微熱應(yīng)激，THI在 28.9～30.0之間處于中度熱應(yīng)激，THI＞30時為重度熱應(yīng)激。1.4.6 血樣采集 在肉兔50、65日齡早晨空腹時，每組隨機(jī)選取8只，后肢靜脈采肝素抗凝血2mL與非抗凝血3mL，其中抗凝血用于淋巴細(xì)胞計數(shù)；非抗凝血自然凝固后，4℃下4000r/min離心15min，收集血清，分裝于0.5mL EP管，-40℃保存?zhèn)錅y。

1.4.7 兔血液淋巴細(xì)胞計數(shù)、血清兔瘟抗體（RHDV Ab）及補(bǔ)體C3、C4含量的測定 淋巴細(xì)胞計數(shù)采用五分類全自動血細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行；抗體及補(bǔ)體含量測定采用雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測，具體操作步驟見試劑盒使用說明書。

2 結(jié)果

2.1 試驗期間兔舍的溫度及濕熱指數(shù)變化 試驗第一階段（15 d），每天平均溫度最低 24.7℃，最高35.5℃，每天平均濕度最低62.33%，最高87.51%，試驗兔處于輕、中、重度熱應(yīng)激的天數(shù)分別為5、7、2d，熱應(yīng)激天數(shù)百分率達(dá)93.33%；試驗第二階段（15d），每天平均溫度最低25.3℃，最高32.8℃，每天平均濕度最低67.54%，最高91.23%，試驗兔處于輕、中、重度熱應(yīng)激天數(shù)分別為5、2、1d，熱應(yīng)激天數(shù)百分率達(dá)53.33%。結(jié)果見表1。

表1 兔熱應(yīng)激程度及環(huán)境溫、濕度統(tǒng)計

2.2 “激飲康”對兔血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量及兔瘟抗體含量的影響 結(jié)果見表2。對表中數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表明，兔瘟抗體含量在50、65日齡時，I組極顯著高于IV 組（P＜0.01）；II、III組與 IV 組間差異不顯著（P＞0.05）。50日齡時，I、II組淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著或極顯著高于IV組（P＜0.01或0.05），但I(xiàn)II組與 IV組間差異不顯著（P＞0.05）；65 日齡時，I、II、III組均極顯著高于IV 組（P＜0.01）。

表2 不同日齡兔血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量及兔瘟抗體含量的變化

2.3 “激飲康”對兔血清補(bǔ)體C3、C4含量的影響 表3表明，在兔飲水中添加“激飲康”，試驗第一階段及第二階段末，I、II、III組兔血清中的 C3、C4 含量均顯著或極顯著高于IV組（P＜0.01或0.05），且高劑量組明顯高于中、低劑量組。

表3 不同日齡兔血清補(bǔ)體C3、C4含量的變化 μg/mL

3 結(jié)論與分析

本試驗在重慶地區(qū)7、8月間進(jìn)行，此時正值高溫、高濕季節(jié)，試驗期間肉兔處于較嚴(yán)重的熱應(yīng)激狀態(tài)。觀察該環(huán)境條件下“激飲康”對肉兔兔瘟疫苗免疫應(yīng)答的影響，對于緩解熱應(yīng)激對肉兔的免疫危害具有現(xiàn)實意義。

研究表明，動物遭受熱應(yīng)激時，一方面熱應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，抑制了淋巴細(xì)胞激活因子、細(xì)胞生長因子及抗體的產(chǎn)生，另一方面使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸機(jī)能亢進(jìn)，糖皮質(zhì)激素分泌增多，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)果使動物抗病力減弱、發(fā)病率升高[4]。劉思當(dāng)?shù)萚5]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理后的雞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少，抗體被顯著抑制。趙川等[6]發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激后期肉兔非特異性指標(biāo)C3水平減低。本試驗在肉兔熱應(yīng)激階段的飲水中持續(xù)添加“激飲康”，發(fā)現(xiàn)接種兔瘟疫苗15d及30d后外周血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高，血清中特異性RHDV Ab水平及補(bǔ)體C3、C4含量也明顯高于未添加組，且呈一定的量效關(guān)系，說明“激飲康”能增強(qiáng)熱應(yīng)激狀態(tài)下肉兔的特異性及非特異性免疫能力。

“激飲康”飲水劑是由中藥藿香、薄荷、石膏、黃芪、冰片、肉蓯蓉等及電解質(zhì) LCl、LHCO3、檸檬酸鈉等按比例組成。電解質(zhì)對于熱應(yīng)激狀態(tài)下補(bǔ)充機(jī)體水分、電解質(zhì)過度丟失，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及新陳代謝正常進(jìn)行具有重要意義。按照中醫(yī)理論，濕熱病證當(dāng)以清熱祛濕為治則，方中藿香、薄荷、石膏等兼具化濕和胃、祛暑解表、清熱瀉火之功效，同時配以黃芪、肉蓯蓉等達(dá)到補(bǔ)氣、滋腎陰、補(bǔ)腎陽的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，黃芪、肉蓯蓉等補(bǔ)氣壯陽類中藥與動物的免疫機(jī)能密切相關(guān)。

補(bǔ)體是體液中一組具有酶原活性的不耐熱球蛋白，可通過經(jīng)典途徑、旁路途徑激活后參與溶菌及溶解病毒作用，調(diào)理吞噬細(xì)胞吞噬、炎癥介導(dǎo)、免疫粘附作用等多種非特異免疫功能，其血清含量的升高是機(jī)體非特殊免疫功能增強(qiáng)的重要客觀指標(biāo)[7]。在補(bǔ)體系統(tǒng)中，C3是濃度最高、最重要的一個組分，是補(bǔ)體系統(tǒng)中最重要的非特異性免疫因子；C4分子結(jié)構(gòu)與C3相似，可通過經(jīng)典途徑生成C3轉(zhuǎn)化酶促進(jìn)C3的活性[8]?！凹わ嬁怠蹦芴岣邿釕?yīng)激狀態(tài)下肉兔血清中補(bǔ)體C3、C4的含量，表明其可加強(qiáng)補(bǔ)體系統(tǒng)功能，提高機(jī)體的非特異性免疫水平。

[1]楊奉珠，郭志強(qiáng)，謝曉紅，等.營養(yǎng)調(diào)控兔熱應(yīng)激的研究進(jìn)展[J].中國草食動物，2011，31（4）：68-69.

[2]李振.抗熱應(yīng)激劑對獺兔生產(chǎn)性能和血液生化指標(biāo)的影響[J].中國飼料，2013（19）：18-23.

[3] Marai I F M，Habeeb A A M，Gad A E.Rabbit′productive，reproductive and physiological performance traits as affected by heat stress：a review[J].Livestock Production Science，2002，78：71-90.

[4]魏學(xué)良，張家驊.高溫環(huán)境對奶牛生理活動及生產(chǎn)性能的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005（5）：25.

[5]劉思當(dāng)，寧章勇，譚勛，等.實驗性熱應(yīng)激對肉仔雞免疫器官的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2003（3）：281-283.

[6]趙川，黃光遠(yuǎn)，熊權(quán)鑫，等.急性持續(xù)熱應(yīng)激對兔血漿補(bǔ)體C3、溶菌酶含量及抗菌活性的影響[J].四川畜牧獸醫(yī)，2015，42（12）：22-25.

[7]王志平，張士璀，王光鋒，等.魚類補(bǔ)體系統(tǒng)成分及補(bǔ)體特異性和功能的研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報，2008（5）：760-769.

[8] 昝琦，劉欣，逄越，等.補(bǔ)體C3結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（4）：549-553.

Effect of“Jiyinkang”on Serum RHDV Antibody and Alexin C3、C4 in Heat Stress Rabbits

Li Qingfeng，Zhao Chuan，Huang Guangyuan，et al.
（Department of Veterinary Medicine of Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing Rongchang 402460，China）

In order to explore the effect of medicament named “Jiyinkang”on the immune function of heat stress meat rabbits，the natural hot and humid environment in Chongqing Rongchang was as heat stress source，64 one month old health IRA rabbits were randomly divided into four groups：“Jiyinkang”high（I），medium（II），low dose group（III）and heat stress control group（IV），a day before the official trial，the rabbits hemorrhagic disease attenuated vaccine was in oculated，and observed the changes of serum antibody and alexin C3，C4 content after 15d and 30d.The results showed that，in the high temperature and high humidity environment，adding “Jiyinkang”could improve the rabbit specific serum RHD antibody，serum alexin content，and enhance the rabbit immunity under the heat stress.

Rabbit；Heat stress；Jiyinkang；Antibody；Alexin

S858.291.5

B

1001-8964（2017）07-0027-03

2017-04-21

李清豐（1993-），男，四川閬中人，在讀碩士，研究方向:動物熱應(yīng)激。

*通訊作者：黃慶洲（1966-），副教授，主要從事動物生理學(xué)教學(xué)及科研工作。