涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

彭艷伶，李昊，余瓊，李建，張斌，沈思思，任玉鵬*

（1.四川省西昌市農(nóng)牧局，四川 西昌 615000；2.西昌學院動物科學院，四川 西昌 615013；3.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV感染檢測

彭艷伶1，李昊2，余瓊1，李建1，張斌3，沈思思3，任玉鵬3*

（1.四川省西昌市農(nóng)牧局，四川 西昌 615000；2.西昌學院動物科學院，四川 西昌 615013；3.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

為了解四川省涼山州部分豬場3種豬腹瀉病毒的感染情況，本研究采用RT-PCR方法，分別對來自德昌、冕寧縣和寧南縣多個規(guī)模化豬場的60份豬腹瀉樣本進行病原檢測，包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬Delta冠狀病毒（PDCoV）和豬A群輪狀病毒（GARV）。結果顯示:3種病原的檢出率分別為PEDV 15%、PDCoV 33.33%、GARV 58.33%，其中冕寧縣PDCoV檢出率為65%，而GARV檢出率更高達70%；3種病毒混合感染的情況普遍存在，總體混合感染率分別為:德昌15%（3/20），冕寧60%（12/20），寧南5%（1/20），混合感染類型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高，提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

豬流行性腹瀉病毒；豬Delta冠狀病毒；豬A群輪狀病毒；RT-PCR

豬腹瀉病是生豬養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一，在所有引起腹瀉的病毒性因素中，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬A群輪狀病毒（GARV）是目前臨床上較為常見的兩種病原[1]。近年還出現(xiàn)諸多新發(fā)病原從豬腹瀉病料中檢出，如豬Delta冠狀病毒（PDCoV）就是一個導致豬腹瀉的冠狀病毒科新成員，主要引起仔豬腹瀉、脫水等[2]。

四川省涼山州當前豬腹瀉疫情較嚴重，但近年關于病原感染情況尚未見報道，這一定程度上制約了疫病防控措施的制定。故本研究采用RT-PCR方法對2016年8～9月份采自涼山州德昌、冕寧、寧南縣三個地方的60份豬腹瀉樣本進行病原學檢測，以期為本地區(qū)腹瀉病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 試劑 Taq聚合酶、DNA Marker II均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T Simple Vector、PrimeScriptTMRT-PCR Lit（RNA反轉錄試劑盒）均購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 儀器 PCR 儀（Veriti 96 Well Thermal Cycle，ABI公司），凝膠成像儀（Universal Hood II，BIO-RAD公司），電泳儀（DYY-5型，北京六一儀器廠）。

1.2 引物 本試驗中用于RT-PCR法檢測 PEDV、PDCoV和GARV的引物均參照文獻[1，3]合成，所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。具體參數(shù)見表1。

表1 PEDV、TGEV、PDCoV、GARV 擴增引物

1.3 樣本采集與處理 本試驗待檢樣本于2016年8～9月采自四川省涼山州，其中德昌縣3個規(guī)?；B(yǎng)殖場20份、冕寧縣2個規(guī)?；i場20份、寧南縣2個規(guī)?；i場20份，共計60份腹瀉樣本。所有樣本均來源于30～60日齡保育豬。將樣本與無菌0.1mol/L PBS緩沖液按 1∶4（m/v）比例稀釋，振蕩混勻，靜置5min，以10000r/min離心10min，取上清液待檢。

1.4 cDNA模板制備 參照寶生物公司RNAiso Plus（總RNA提取試劑）說明書，提取樣本總RNA。依次加入上述上清液200μL、RNAiso Plus 500μL、氯仿150μL，振蕩混勻后離心取上清；然后加入等體積異丙醇，離心棄上清；再加入 75%乙醇1 mL（經(jīng)DEPC處理），離心棄上清；樣品自然干燥后加入45μL無RNA酶去離子水，溶解沉淀，置-40℃保存。

根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。反應體系：樣本總 RNA 4μL，5×Buffer 4μL，Random primer 1 μL，PrimeScript RTase 1 μL，dH2O 10 μL，總體系20μL。反轉錄程序：37℃ 15min，85℃ 15s，16℃ 1min。反轉錄產(chǎn)物置-40℃保存。

1.5 目的基因的PCR擴增 分別用檢測PEDV、PDCoV和GARV的3對引物，對待檢樣本中的cDNA模板進行PCR擴增。反應體系為：2×PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各 1.0 μL，cDNA 2.0 μL，dH2O 8.5μL，總體積 25μL。PCR 擴增條件為：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 55 s，35 個循環(huán)，72℃ 10min。取上述擴增產(chǎn)物各5μL在瓊脂糖凝膠板上以100V恒壓電泳45min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結果。對目的基因進行回收、連接和轉化，使其克隆至pMD19-T載體，并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序，用Blast比對分析結果。對不同來源樣本中的3種病毒病原的檢出率進行統(tǒng)計分析。

圖1 3種病原的RT-PCR擴增結果

2 結果

2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及測序 將待檢樣本cDNA的PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，并送樣到上海英駿生物技術有限公司測序，經(jīng)Blast比對分析，結果表明：與NCBI上已登錄的序列相比，PEDV擴增片段同源性為99%，PDCoV擴增片段同源性為95%，GARV擴增片段同源性為92%。

2.2 不同豬群的感染情況 在涼山州德昌、冕寧及寧南3個地區(qū)中，豬群中PEDV、PDCoV和GARV檢出率均為100%（3/3），3種病原總體檢出率分別為：PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，表明這3種病毒在本地區(qū)廣泛存在。PDCoV和GARV的總體檢出率均顯著高于PEDV，表明此二種病原是引起本次腹瀉疫情的主要病原（見表2）。

表2 3種病原的檢出率

3個地區(qū)不同病原的感染情況也有所差異（圖2）。來源于德昌縣和寧南縣5個豬場的腹瀉樣本中，3種病原感染情況相似，PEDV檢出率均為10%，PDCoV為15%，GARV為20%。冕寧縣2個豬場的腹瀉樣本中，PDCoV檢出率顯著高于其他兩個地區(qū)，其檢出率為65%。此外，GARV在所有豬場中的檢出率均為3種病原中的最高，表明引起近期涼山地區(qū)豬只腹瀉的主要病原為GARV，同時新發(fā)病原PDCoV也廣泛存在于該地區(qū)各養(yǎng)殖場中。

圖2 不同地區(qū)3種病原感染情況

2.3 病原的混合感染情況 在所檢測的腹瀉樣本中，存在多種病原混合感染的情況（表3）。3個地區(qū)豬場總體混合感染率分別為：德昌15%（3/20），冕寧60%（12/20），寧南 5%（1/20）。其中冕寧縣部分樣本存在3種病原同時檢出的情況（混感率為10%），表明引起冕寧縣養(yǎng)殖場腹瀉的病毒性病因更為復雜多樣。此外，3種病原兩兩混合或3種病原同時檢出的情況均存在，但檢測數(shù)據(jù)表明，3個地區(qū)不同來源的樣本中，PDCoV和GARV混合感染率分別為德昌縣10%（2/20），冕寧縣 55%（11/20），寧南縣 5%（1/20），均顯著高于同群其他感染類型。該結果一定程度上反映出PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性。

表3 3種病原的混合感染率

3 結論與分析

本試驗對采自四川德昌、冕寧縣及寧南縣的腹瀉樣本進行了PEDV、PDCoV和GARV檢測，結果3種病毒的總體檢出率分別為：PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，提示這3種病毒在本地區(qū)均有感染。此外，不同豬場主導的病因不同，因此養(yǎng)殖場應根據(jù)自身實際情況制定具有針對性的疫病防控措施。GARV在3個地區(qū)的檢出率均顯著高于PDCoV和PEDV（P＜0.01），說明當前引起涼山州部分豬場腹瀉疫情的主要病原為GARV。近年來國內(nèi)大部分研究表明，在規(guī)?；B(yǎng)殖場腹瀉病因中PEDV所占比例最高。如：霍金耀等[4]對2011～2012年華中地區(qū)190份腹瀉樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV陽性率高達62.11%，TGEV和 GARV陽性率分別為 0.53%和7.37%；常鐵城等[5]對2014年來自全國11個省市42個豬場的165份樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV群體陽性率為85.71%，單獨感染PEDV的豬場占總數(shù)的59.52%。但本次研究卻表明，當前涼山州規(guī)?；B(yǎng)殖場中GARV感染情況比較嚴重，個別地方檢出率高達70%。因此應進一步對GARV在本地區(qū)的流行規(guī)律進行系統(tǒng)調(diào)查，同時建立長期有效的監(jiān)控機制，加強針對該病原的疫苗免疫，避免引起更大規(guī)模的腹瀉疫情。

作為豬腹瀉的新病原，PDCoV也逐漸受到關注。此前本實驗室已對2013年采自四川及重慶的222份臨床樣本進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)PDCoV陽性檢出率為7%[3]，表明這種新發(fā)病原已在本地區(qū)流行。本次來自涼山州的60份腹瀉樣本中，PDCoV總體檢出率為33.33%，冕寧縣的檢出率更高達65%。說明PDCoV也是引起該地區(qū)部分豬場腹瀉的重要病原。

本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，腹瀉樣本中PEDV、PDCoV和GARV 3種病原存在兩兩混合感染或3種病原同時感染的情況，而這可能是導致部分豬只病情加劇，迅速死亡的主要原因。檢測結果顯示：來源于3個不同地方的樣本中，PDCoV和GARV的混合感染率最高，提示PDCoV和GARV可能存在更高的協(xié)同致病性，同時也表明當前本地區(qū)腹瀉病因復雜多樣，應進一步加強上述兩種病原的實驗室檢測，做到早診斷、早治療。

[1]曹恭貌，張斌，岳華，等.四川部分豬場PEDV、TGEV、GARV和PLV感染狀況調(diào)查[J].動物醫(yī)學進展，2016，37（1）：118-122.

[2] Lee S，Lee C.Complete genome characterization of Lorean porcine deltacoronavirus strain LOR/LNU14-04/2014[J].Genome Announc，2014，2（6）：1114-1191.

[3]任玉鵬，張斌，湯承，等.同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步應用[J].中國獸醫(yī)科學，2016，46（6）：756-762.

[4]霍金耀，鄭逢梅，陳陸，等.豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、A群輪狀病毒和嵴病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].中國獸醫(yī)學報，2013，33（12）：1792-1794.

[5]常鐵成，陳建飛，馮力，等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報，2016，38（4）：335-338.

Infection Dete Ction of PEDV，PDCoV and GARV in Pig Farms of Liangshan Prefecture

Peng Yanlin1，Li Hao2，Zhang Bin3，et al.
（1.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Xichang City，Sichuan Xichang 615000；2.Animal Science College of Xichang University，Sichuan Xichang 615013；3.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

To investigate the infection of PEDV，PDCoV and GARV from different pig farms in 3 counties of Liangshan prefecture，this study detected three kinds of pathogens from a total of 60 feces samples by RT-PCR method.The results showed that the detection rates of these three kinds of pathogens were PEDV 15%，PDCoV 33.33%，GARV 58.33%，respectively.It indicated that PEDV，PDCoV and GARV were widespread in pig farms of Liangshan prefecture.Besides，the positive rate of PDCoV in Mianning county was 65%，which was significantly higher（P＜0.01）than that of the others，and the detection rate of GARV in this area was 70%.Moreover，These three pathogens often presented mixed infection，and the mixed infection rates in different areas were Dechang 15%（3/20），Mianning 60%（12/20），Ningnan 5%（1/20），respectively.Within these mixed infection types，the mixed infection rate of PDCoV and GARVwas highest，it could be inferred that GARV and PDCoV might have synergistic pathogenicity.

PEDV；PDCoV；GARV；RT-PCR

S854.43

B

1001-8964（2017）07-0018-04

2017-02-23

“十三五”國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500705）

彭艷伶（1968-），女，獸醫(yī)師，現(xiàn)從事動物防疫工作。

*通訊作者：任玉鵬(1986-)，男，實驗師，研究方向:動物傳染病病原學。