成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞研究進(jìn)展

徐正燕，李鷹

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成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞研究進(jìn)展

徐正燕，李鷹

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020

徐正燕, 李鷹. 成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(7): 1069–1074.Xu ZY, Li Y. Direct reprogramming from fibroblasts into cardiamyocytes. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1069–1074.

心肌細(xì)胞的再生療法作為心臟疾病的新型療法受到人們的廣泛關(guān)注。細(xì)胞直接重編程技術(shù)為誘導(dǎo)獲得心肌細(xì)胞提供了新的方法，它可以繞過多潛能的階段，將一種終末分化的細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞，為將來細(xì)胞移植提供更為安全的細(xì)胞來源。文中對體內(nèi)外直接重編程成纖維細(xì)胞為心肌細(xì)胞的研究方法及其存在的問題進(jìn)行了總結(jié)，并對心肌細(xì)胞直接重編程的未來發(fā)展進(jìn)行展望。

成纖維細(xì)胞，直接重編程，心肌細(xì)胞

心臟作為胚胎發(fā)育過程中首個形成的器官，在一生中都有著非常重要的作用，但是由于哺乳動物的心臟在成年后再生和修復(fù)能力有限，因此，心臟疾病往往會產(chǎn)生致命性的后果，并且在發(fā)達(dá)國家是導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]。為了獲得再生的心肌細(xì)胞，研究者嘗試采用間充質(zhì)干細(xì)胞、豬羊水干細(xì)胞[2]等向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，目前采用較多的是將胚胎干細(xì)胞或人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)，使其向心肌細(xì)胞分化，但由于胚胎干細(xì)胞的倫理問題以及目前技術(shù)制備的人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的潛在致癌性和重編程效率低的問題，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。

細(xì)胞的直接重編程(Direct reprogramming)是指將一種終末分化的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N終末分化的細(xì)胞，這一轉(zhuǎn)變不經(jīng)過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞階段和去分化、再分化等過程。該方法不需要經(jīng)過將成體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞、再由多能干細(xì)胞分化為另一種終末分化細(xì)胞的復(fù)雜環(huán)節(jié)，避免了細(xì)胞獲得性免疫原性的問題，也不涉及到倫理和法律問題。理論上，這種越過多能干細(xì)胞階段、直接重編程而來的細(xì)胞降低了腫瘤形成的風(fēng)險，有希望為將來的細(xì)胞移植治療提供更為安全的細(xì)胞來源[3]。因此，這項研究具有十分重要的臨床意義。Vierbuchen等[4]第一次報道，在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入特異性轉(zhuǎn)錄因子 (Ascl1，Brn2，Mytl1)，無需經(jīng)過ips階段，將成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞。此后，直接重編程的方法也用于成纖維細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞[5-6]、造血細(xì)胞[7]、肝細(xì)胞[8]、骨骼肌細(xì)胞[9]、胰島β細(xì)胞[10]和內(nèi)皮細(xì)胞[11]等的誘導(dǎo)。本文主要針對成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞的直接重編程研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對其未來發(fā)展進(jìn)行展望。

1 體外直接重編程

1.1 轉(zhuǎn)錄因子

2010年，Ieda等[12]從心臟發(fā)育過程中起重要作用的14種轉(zhuǎn)錄因子中篩選出3種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5 (GMT)，將小鼠心肌成纖維細(xì)胞和小鼠尾尖成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞(Induced cardiomyocytes，iCMs)，首次報道了成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞的直接重編程。Ieda等[12]發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞不經(jīng)過心臟前體細(xì)胞階段可以直接重編程為心肌樣細(xì)胞，通過流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出的iCMs與新生小鼠的心肌細(xì)胞在基因的整體表達(dá)模式和一些表觀遺傳標(biāo)記方面很相似。研究者用心肌肌球蛋白重鏈啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白(αMHC promoter-driven green fluorescent protein, αMHC-GFP) 標(biāo)記新生小鼠心臟成纖維細(xì)胞，然后用攜帶GMT轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的病毒感染小鼠心臟成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染3 d后即有GFP＋細(xì)胞出現(xiàn)，10 d后，GFP＋表達(dá)率達(dá)到20%，并且在轉(zhuǎn)染4周后仍可檢測到GFP＋細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染1周后，GFP＋細(xì)胞中肌鈣蛋白T (cTNT)陽性表達(dá)僅有30%，4周后cTNT＋細(xì)胞達(dá)到45%。同時發(fā)現(xiàn)，大約30%的GFP＋細(xì)胞顯示出一定程度代表新生心肌細(xì)胞的自發(fā)的鈣離子濃度瞬時變化，這些細(xì)胞在培養(yǎng)了4?5周后有自發(fā)跳動的細(xì)胞出現(xiàn)。隨即，研究者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)以期提高重編程效率。2011年，Efe等[13]利用“Yamanaka四因子”中Oct4、Sox2、Klf4三個轉(zhuǎn)錄因子對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，并且通過阻斷小鼠細(xì)胞達(dá)到多能性所需的酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT) 通路和加入心臟發(fā)生因子BMP4，激活心臟前體程序，最后獲得可以跳動的心肌細(xì)胞，與傳統(tǒng)GMT法相比，誘導(dǎo)效率可提高近3倍。2012年，Song 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在GMT基礎(chǔ)上加入HAND2 (GHMT) 亦可在體外將小鼠心肌成纖維細(xì)胞和鼠尾尖成纖維細(xì)胞重編程為心肌樣細(xì)胞，且可使αMHC-GFP和cTNT共表達(dá)細(xì)胞的比率提高3倍左右。GHMT誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌樣細(xì)胞可以形成肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)，并且能夠產(chǎn)生鈣瞬變，在誘導(dǎo)5周以后，一小部分誘導(dǎo)心肌細(xì)胞可出現(xiàn)自發(fā)跳動。但是也有研究者對Ieda等[12]的研究方法提出了質(zhì)疑，Chen等[15]報道，單獨使用轉(zhuǎn)錄因子GMT不能有效地直接重編程成纖維細(xì)胞產(chǎn)生功能性的心肌細(xì)胞，研究者將攜帶GMT的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠心臟成纖維細(xì)胞和小鼠尾尖成纖維細(xì)胞后，僅有cTNT的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，并沒有功能性心肌細(xì)胞產(chǎn)生。之后，有研究者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子GMT的化學(xué)計量對于直接重編程獲得心肌細(xì)胞的αMHC-GFP和TNT的表達(dá)是特別重要的，Mef2c的高表達(dá)和Gata4與Tbx5的低表達(dá)可以增加誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞的產(chǎn)量[16]。這可能也是Chen等[15]不能有效獲得誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞的原因。

近幾年，人們開始探索將人來源成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞進(jìn)行重編程，研究發(fā)現(xiàn)，無論是GMT還是GMTH組合都不足以實現(xiàn)人成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，人源成纖維細(xì)胞比小鼠來源的成纖維細(xì)胞更難實現(xiàn)重編程，所需時間更長，而且往往需要加入額外的轉(zhuǎn)錄因子。Fu等[17]在GMT的基礎(chǔ)上加入ESRRG、MESP1、MYOCD和ZFPM2，誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞得到心肌樣細(xì)胞，其中，MYOCD和ZEPM2與提高人心肌細(xì)胞直接重編程效率有關(guān)。同時，Wada等[18]發(fā)現(xiàn)，在GMT基礎(chǔ)上加入MESP1和MYOCD (GMTMM) 也可以在體外將人心臟成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞。遺憾的是，他們沒有發(fā)現(xiàn)自發(fā)跳動的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，但是將轉(zhuǎn)錄1周后的細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后，5% GMTMM/GFP＋細(xì)胞出現(xiàn)同步收縮。Wada等[18]的研究表明，雖然GMTMM可以重編程人成纖維細(xì)胞為心肌細(xì)胞，但是誘導(dǎo)得到的心肌樣細(xì)胞并不成熟。另外，由于snai1在疾病發(fā)展階段可以促進(jìn)纖維化，有研究證明，在GMT轉(zhuǎn)導(dǎo)期間用siRNA敲掉snai1的表達(dá)可以提高心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)效率[19]?？紤]到TGF-β對snai1具有促進(jìn)作用，研究者發(fā)現(xiàn)，在GMT+Hand2+Nkx2.5轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，加入TGF-β信號通路的抑制劑SB431542可以使重編程效率提高5倍[20]。

1.2 microRNA

Jayawardena等[21]發(fā)現(xiàn)一組肌肉特異的miRNA (miR-1、miR-133、miR-208 和miR-499)可以在體外將小鼠心臟成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞，約1%?2%的細(xì)胞可觀察到心肌特異性蛋白的表達(dá)、節(jié)律性跳動和鈣瞬變，但效果也只能維持一段時間，隨著核酸的代謝降解，效應(yīng)減弱消失，需持續(xù)轉(zhuǎn)染。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)，miR-133對GMT誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞具有促進(jìn)作用[19]，在GMT中加入miR-133，可在誘導(dǎo)后第10天觀察到跳動的心肌細(xì)胞，而單獨用GMT處理的細(xì)胞在誘導(dǎo)后4周左右才出現(xiàn)跳動。

1.3 小分子化合物

由于轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的潛在致癌性和重編程效率低的問題，人們開始探索小分子化合物的誘導(dǎo)方法。2014年，Wang等[22]報道，在培養(yǎng)基中加入一系列特定小分子化合物(SB431542、CHIR99021、parnate和forskolin) 后，僅導(dǎo)入一個轉(zhuǎn)錄因子OCT4即可使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞，此方法引入小分子化合物后，減少了轉(zhuǎn)錄因子的使用，為小分子化合物對轉(zhuǎn)錄因子的完全取代奠定了基礎(chǔ)。 2015年，F(xiàn)u等[23]用小分子化合物 CRFVPTZ (C: CHIR99021; R: RepSox; F: Forskolin; V: VPA; P: Parnate; T: TTNPB; Z: DZnep) 將鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)得到的心肌樣細(xì)胞表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物，可看到肌節(jié)結(jié)構(gòu)，有典型的鈣流動和電生理特性，并且發(fā)現(xiàn)早在加入小分子化合物培養(yǎng)的第6?8天出現(xiàn)跳動的細(xì)胞群落，同樣的方法亦可將新生小鼠尾尖成纖維細(xì)胞重編程為心肌樣細(xì)胞。該項研究實現(xiàn)了小分子化合物對轉(zhuǎn)錄因子的完全取代，為利用小分子化合物進(jìn)行體內(nèi)誘導(dǎo)獲得心肌樣細(xì)胞提供了新的方法，為治療心衰造成的心臟損傷奠定了基礎(chǔ)。

同時，也有研究者嘗試使用小分子化合物對人成纖維細(xì)胞進(jìn)行直接重編程，以獲得心肌樣細(xì)胞?；赪ang等[22]的報道，Cao等[24]從已知的89種有利于重編程的小分子中篩選出不同小分子化合物，分別加入以SB431542、CHIR99021、parnate和forskolin作為基礎(chǔ)的小分子化合物中，研究發(fā)現(xiàn)7C (CHIR99021、A8301、BIX01294、AS8351、SCI、Y27632和OAC2) 足以有效地誘導(dǎo)人類包皮成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞，以此為基礎(chǔ)，研究者發(fā)現(xiàn)加入血小板衍生生長因子通路的兩個抑制劑SU16F和JNJ10198409 (9C) 可以促使成纖維基因的下調(diào)和增加誘導(dǎo)心肌跳動的群落。在誘導(dǎo)20 d左右可觀察到跳動的細(xì)胞群落，第30天，有近6.9% 9C處理的細(xì)胞表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物細(xì)胞肌鈣蛋白T (cTNT)，通過透射電鏡，可以觀察到Z帶、線粒體、肌纖維結(jié)構(gòu)。在重編程45–50 d后，大部分誘導(dǎo)所得心肌細(xì)胞表現(xiàn)心室肌樣動作電位，并可觀察到鈣離子流動。并且研究者發(fā)現(xiàn)，9C誘導(dǎo)獲得的心肌細(xì)胞與人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞具有相似的特性，都是順序性地經(jīng)過了中胚層、心臟前體階段和心肌細(xì)胞的基因表達(dá)過程。此外，9C誘導(dǎo)所得心肌細(xì)胞中，與心臟發(fā)育和心臟功能相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而與成纖維相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。同樣的，研究者發(fā)現(xiàn)9C也可以將人新生肺成纖維細(xì)胞體外直接重編程為心肌樣細(xì)胞。此研究證實，小分子化合物可以完全取代轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。

2 體內(nèi)直接重編程

大部分直接重編程研究都是在體外進(jìn)行的，對于再生醫(yī)學(xué)，體內(nèi)實驗更具有研究價值，相對于細(xì)胞移植更具有臨床意義，這也是直接重編程的方法優(yōu)于胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞的地方。近幾年，研究者嘗試運用類似于體外誘導(dǎo)的方法將心肌受損后填塞的成纖維細(xì)胞體內(nèi)直接重編程為心肌細(xì)胞。Qian等[25]建立心肌梗死模型后，在梗死部位注射攜帶有GMT的逆轉(zhuǎn)錄病毒，發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域縮小，梗死部位邊緣區(qū)域約有35%心肌細(xì)胞是由心臟成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)而來的，并且誘導(dǎo)所得心肌細(xì)胞可表現(xiàn)成年心室肌的功能特點，約有一半具有有條理的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，使心肌梗死后2–3個月的心臟功能得到改善。該研究表明，相對于體外誘導(dǎo)，體內(nèi)可誘導(dǎo)出更加成熟的心肌細(xì)胞，且誘導(dǎo)效率較高。隨后，Song等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死部位注射GHMT也可引起心臟成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞，且射血分?jǐn)?shù)是對照組的2倍，瘢痕組織也減少一半。另外，Jayawardena等[21]嘗試用慢病毒將miR-1、miR-133、miR-208和miR-499導(dǎo)入小鼠缺血心臟，發(fā)現(xiàn)有1%缺血部位心肌細(xì)胞由心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來。2016年，Mohamed等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β抑制劑SB431542和WNT抑制劑XAV939聯(lián)合GMT可以加強(qiáng)心肌細(xì)胞重編程的效率，研究者建立心肌梗死的小鼠模型后，發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌梗死部位，暴露于GMT、SB431542和XAV939兩周后的小鼠與單獨暴露于GMT的小鼠相比，其重編程效率和心肌功能明顯提高。目前體內(nèi)誘導(dǎo)的方法仍以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒作為載體介導(dǎo)為主，因為有致癌的風(fēng)險，且體內(nèi)誘導(dǎo)所得心肌細(xì)胞生存時間等問題不清楚，故體內(nèi)誘導(dǎo)的方法還需進(jìn)一步探索，至今尚未見報道以人為研究對象的體內(nèi)直接重編程研究。

3 展望

通過將成纖維細(xì)胞直接重編程獲得心肌樣細(xì)胞，不僅避免了誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中混入多能干細(xì)胞從而增加細(xì)胞移植的致癌風(fēng)險，還縮短了誘導(dǎo)獲得心肌細(xì)胞的時間，有望成為修復(fù)受損心臟組織的新方法。但是轉(zhuǎn)錄因子的方法存在致癌性的風(fēng)險，microRNA的方法需要反復(fù)轉(zhuǎn)染，近幾年，研究者已研究出小分子化合物對轉(zhuǎn)錄因子完全取代的誘導(dǎo)方法，誘導(dǎo)效率也有很大提高，但對于臨床應(yīng)用仍是不足的，目前小分子化合物誘導(dǎo)方法得到的細(xì)胞避免了轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)致癌性的風(fēng)險，但得到的細(xì)胞仍不完全成熟，僅有一小部分細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)性收縮、自發(fā)電活動等，有研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的心肌細(xì)胞會引起心律不齊[27]。因此，研究者還應(yīng)尋求更加完善的小分子誘導(dǎo)方案，提高誘導(dǎo)效率和誘導(dǎo)所得心肌細(xì)胞的成熟度，為臨床應(yīng)用提供安全有效的細(xì)胞來源。細(xì)胞直接重編程的方法給研究者們提供了新的思路，目前心臟直接重編程的方法也在不斷進(jìn)步，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走，對于重編程的機(jī)制問題、重復(fù)性問題以及移植入體內(nèi)的細(xì)胞存活時間問題等還需進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Direct reprogramming from fibroblasts into cardiamyocytes

Zhengyan Xu, and Ying Li

Medical Research Center, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China

Cardiac regenerative therapy has attracted much attention as a novel approach for heart diseases. Direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes without going through a pluripotent stem cell stage would provide a promising source of cells for cell transplantation in future. This review summarizes the research methods and problems of direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytesand, and forecasts the future development of this new strategy.

fibroblasts, direct reprogramming, cardiomyocytes

December 22, 2016; Accepted:February 9, 2017

Ying Li. Tel: +86-10-85231482; E-mail: leeeying2013@hotmail.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31440062).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31440062) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-02-20

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170220.1417.002.html