拮抗旱柳枯萎病菌YQT13菌株發(fā)酵條件和抑菌穩(wěn)定性1)

朱丹璐 劉忠玄 劉雪峰 劉朝霞 王斌

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (內(nèi)蒙古鄂爾多斯市森防站)

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拮抗旱柳枯萎病菌YQT13菌株發(fā)酵條件和抑菌穩(wěn)定性1)

朱丹璐 劉忠玄 劉雪峰 劉朝霞 王斌

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (內(nèi)蒙古鄂爾多斯市森防站)

從鄂爾多斯伊金霍洛旗旱柳枯萎病疫區(qū)采集的土樣中分離獲得對(duì)該病原菌(成團(tuán)泛氏菌Pantoeaagglomerans)生長有抑制作用的菌株YQT13(米根霉Rhizopusoryzae)。通過平板打孔對(duì)峙方法對(duì)該菌株進(jìn)行最佳培養(yǎng)基篩選、最適培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵液穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖40 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、初始pH值6.2、搖培速度160 r·min-1、培養(yǎng)溫度35 ℃，其發(fā)酵原液抑菌直徑(14.2±0.3)mm。濃縮作用能有效提高發(fā)酵液抑菌效果，發(fā)酵液于121 ℃滅菌30 min或-80～0 ℃保存20 d抑菌活性幾乎不變，但光穩(wěn)定性較差；pH值3.0保存24 h抑菌活性不變，隨著pH值增大抑菌直徑減小，pH≥10.0保存24 h會(huì)完全失活。

生防菌；發(fā)酵條件；旱柳枯萎??；成團(tuán)泛氏菌；根霉菌

Biocontrol bacteria； Fermentation conditions；Salixmatsudanawilt disease；Pantoeaagglomerans；Rhizopus

旱柳是鄂爾多斯地區(qū)最主要的造林喬木，在沙漠治理和城市綠化中有極其重要地位[1-2]。2012年以來，旱柳枯萎病大面積暴發(fā)嚴(yán)重威脅樹木健康，發(fā)病植株新葉提前枯萎、凋落，且感病枝干橫截面邊材位置有褐色的環(huán)狀壞死病斑，伴有臭味液體流出，整株將在1～3 a完全枯死[3]。

在國外，1924年荷蘭學(xué)者Day[4]首次發(fā)現(xiàn)由Erwiniasalicis引起板球拍柳水印?。?931年Lindeijer[5]報(bào)道白柳水印病和Day描述的癥狀相似。英國、荷蘭、比利時(shí)、澳大利亞、美國、日本都有柳樹水印病的報(bào)道，防治上均采取銷毀感病株、植物檢疫、抗病育種、化學(xué)防治等方法，但防治效果并不理想[6-11]。國內(nèi)僅有金九辰[12]對(duì)西寧地區(qū)的柳樹枯萎病有過研究，病原與國外報(bào)道一致，但未提出良好的防治方法。

霉菌在自然界分布較廣，用途廣泛，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的糖化菌、產(chǎn)酸菌和生防菌多為霉菌[13-14]。在森林病蟲害防治方面，木霉菌是理想的廣譜性生防菌，對(duì)土傳或氣傳的真菌和細(xì)菌性病害均有較好防治效果[15-16]，而利用黑根霉和木霉協(xié)同作用防治引起多種枯萎病的病原尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)效果更顯著[17]；筆者通過分離獲得米根霉(Rhizopusoryzae)對(duì)旱柳枯萎病病原有較好的抑菌作用，筆者對(duì)其抑菌培養(yǎng)條件和抑菌物穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為下一步生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

供試菌種:旱柳枯萎病病原菌(成團(tuán)泛氏菌Pantoeaagglomerans)[3]。生防菌YQT13(米根霉RhizopusoryzaeWent et Pr. Geerl.)從內(nèi)蒙古鄂爾多斯伊金霍洛旗旱柳枯萎病疫區(qū)土壤中分離獲得。二者均保存于東北林業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室。

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選：選用PDA、1/2PDA、1/5PDA、MMN、Martin、沙保弱、沙氏葡萄糖、察氏共8種培養(yǎng)基對(duì)YQT13菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。平板打孔對(duì)峙法測量抑菌直徑以評(píng)價(jià)抑菌效果，依據(jù)菌絲干質(zhì)量評(píng)價(jià)真菌的生長量，菌絲干質(zhì)量=搖培菌絲干質(zhì)量-接入菌絲干質(zhì)量；用抑菌直徑評(píng)價(jià)抑菌效果，抑菌直徑=實(shí)測抑菌直徑-打孔直徑(14 mm)。菌絲干質(zhì)量測定，150 mL三角瓶中加入以上液體培養(yǎng)基60 mL，各重復(fù)3組，滅菌，接入經(jīng)PDA充分活化的10 mm生防菌餅2個(gè)，160 r·min-1、25 ℃搖培3 d，用紗布過濾菌絲烘干至恒質(zhì)量測量其干質(zhì)量。抑菌直徑測定，90 mm平板加入20 mL PDA，凝固后用三角推涂布200 μL細(xì)菌原液，均勻打孔4個(gè)，孔徑14 mm，滴加300 μL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾的發(fā)酵液，25 ℃培養(yǎng)36 h測其抑菌直徑。

碳、氮形態(tài)對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響：將篩選出的最佳的培養(yǎng)基中氮形態(tài)分別替換為NaNO3、蛋白胨、酵母膏、(NH4)2·SO4、NH4Cl和無氮；再將碳形態(tài)分別替換為蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和無糖進(jìn)行單因素試驗(yàn)。經(jīng)換算使各成分加入的碳或者氮元素含量一致，重復(fù)3組，測量菌絲干質(zhì)量和抑菌直徑。

搖培轉(zhuǎn)速對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響：從碳、氮形態(tài)對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果影響的試驗(yàn)中篩選的最佳碳氮形態(tài)剛好為沙氏葡萄糖培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)配方(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L，pH值5.8)。將YQT13接入到沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，分別設(shè)置靜止、80、160、200于25 ℃搖培3 d，測量菌絲干質(zhì)量和抑菌直徑。

培養(yǎng)溫度對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響：在測得的最佳搖培速度下，將拮抗菌YQT13接入到沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，分別在15、25、35、45 ℃下，160 r·min-1進(jìn)行液體搖培，培養(yǎng)3 d，測量菌絲干質(zhì)量和抑菌直徑。

pH值對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響：預(yù)試驗(yàn)表明，用HCl和NaOH配制成不同pH值的無菌水溶液對(duì)細(xì)菌生長無抑制作用。所以，在測得的最佳培養(yǎng)溫度下，用1 mol·L-1的HCl和NaOH調(diào)節(jié)沙氏葡萄糖培養(yǎng)基pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接入YQT13，35 ℃，160 r·min-1，搖培3 d，測量菌絲干質(zhì)量和抑菌直徑。

正交試驗(yàn)：以單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取碳形態(tài)、氮形態(tài)、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和pH值5因素設(shè)計(jì)4水平(表1)正交試驗(yàn)L16(45)，液體搖培3 d后測定抑菌直徑。

YQT13發(fā)酵液活性物質(zhì)穩(wěn)定性的測定：發(fā)酵液活性物質(zhì)光穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的研究對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐至關(guān)重要。將通過0.22 μm水性濾膜真空抽濾的無菌發(fā)酵液進(jìn)行55 ℃的2倍真空旋轉(zhuǎn)濃縮，將原液和濃縮液進(jìn)行打孔對(duì)峙試驗(yàn)，以2倍濃縮液進(jìn)行穩(wěn)定性測定。熱穩(wěn)定性測定，在黑暗條件下保存于-80、-20、0、25、60、121 ℃(30 min)，過程中應(yīng)避免液體蒸發(fā)丟失，除了121 ℃外，其他溫度下每5 d測定抑菌效果。光穩(wěn)定性測定，將YQT13濃縮發(fā)酵液于25 ℃下分別放置在全光照、12 h交替光照和黑暗條件下，每5 d測量抑菌效果。pH穩(wěn)定性測定，首先測定YQT13發(fā)酵液的pH值，再用1 mol·L-1的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)濃縮液至pH為3.0、6.0、8.0、10.0、12.0，25 ℃避光放置0、6、12、24 h后測量抑菌效果。

表1 YQT13優(yōu)化培養(yǎng)正交試驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

由表2可見，沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中YQT13的發(fā)酵液抑菌效果最好，原液抑菌直徑為(12.4±0.2)mm；MMN菌絲干質(zhì)量達(dá)8.568 3 g·L-1，但抑菌直徑僅為(6.3±0.3)mm；Martin培養(yǎng)基中菌絲干質(zhì)量達(dá)6.456 7 g·L-1，但無抑菌效果，說明抑菌效果和菌絲量不成正比關(guān)系。沙氏葡萄糖培養(yǎng)基的菌絲干質(zhì)量和抑菌直徑均大于PDA，所以選擇前者為最佳培養(yǎng)基。

表2 YQT13最適培養(yǎng)基篩選

注：表中抑菌直徑為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.1.2 碳、氮形態(tài)對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響

以葡萄糖和蛋白胨分別為碳氮形態(tài)時(shí)，發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制效果最好，原液抑菌直徑為(12.5±0.6)mm(表3)。該拮抗菌不能在無氮、無機(jī)氮和氨態(tài)環(huán)境生長。YQT13菌株無碳源時(shí)菌絲能生長，而無氮源時(shí)，菌絲不能生長；單糖、雙糖和多糖均能被利用。

2.1.3 轉(zhuǎn)速、溫度和pH值對(duì)YQT13發(fā)酵液抑菌效果的影響

搖培速度對(duì)菌絲干量和發(fā)酵液抑菌效果的影響十分顯著。靜止培養(yǎng)有少許菌絲產(chǎn)生，但發(fā)酵液無抑菌效果；80 r·min-1培養(yǎng)時(shí)，菌絲干量較小，發(fā)酵液抑菌效果不明顯。160、200 r·min-1培養(yǎng)，菌絲生長旺盛，但抑菌效果差異不大(表4)。因此，從搖培成本以及對(duì)設(shè)備保護(hù)角度考慮，選擇160 r·min-1培養(yǎng)更佳。

15 ℃或45 ℃都會(huì)減緩YQT13菌株的生長，且發(fā)酵液抑菌效果下降；25 ℃和35 ℃搖培YQT13菌株生長良好，且抑菌效果較好，相比之下35 ℃時(shí)菌絲生長更旺盛，抑菌更強(qiáng)，為(13.3±0.1)mm。所以，35 ℃培養(yǎng)更佳。

pH值6.0的培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌效果最佳，抑菌直徑為(13.1±0.1)mm。過酸或過堿都不利于YQT13生長并產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

表3 不同碳、氮形態(tài)的YQT13發(fā)酵液抑菌效果

注：表中抑菌直徑為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

表4 不同轉(zhuǎn)速、溫度和pH值YQT13發(fā)酵液抑菌效果

注：表中抑菌直徑為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.2 正交試驗(yàn)

16組試驗(yàn)獲得的抑菌直徑分別為(10.1±0.2)、(10.8±0.4)、(12.1±0.3)、(11.4±0.3)、(11.5±0.1)、(11.8±0.2)、(12.4±0.2)、(12.3±0.2)、(11.8±0.3)、(11.9±0.4)、(12.9±0.1)、(13.1±0.3)、(12.0±0.3)、(11.7±0.4)、(11.7±0.1)、(12.2±0.2)mm。極差結(jié)果表明：各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響作用由大到小依次為葡萄糖、蛋白胨、初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速(表5)。最佳抑菌培養(yǎng)條件為葡萄糖40 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、初始pH值6.2、搖培速度160 r·min-1、培養(yǎng)溫度35 ℃，經(jīng)驗(yàn)證其原液抑菌直徑為(14.2±0.3)mm。

表5 YQT13培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.3 發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

2倍發(fā)酵濃縮液抑菌直徑為(15.7±0.2)mm，原液的抑菌直徑為(14.2±0.3)mm(圖1)?？梢姡婵諠饪s能提升發(fā)酵液抑菌效果。發(fā)酵液在-80 ℃保存20 d其抑菌效果無明顯變化；在-20、0、25 ℃條件下保存20 d，抑菌直徑緩慢減小(圖2)；而60 ℃保存20 d，發(fā)酵液抑菌直徑快速下降至(6.6±0.2)mm；而121 ℃滅菌30 min，抑菌效果無明顯變化，仍然大于15.0 mm。即：活性物質(zhì)在-80～121 ℃較穩(wěn)定，但隨著保存時(shí)間的延長，抑菌效果有所下降，且高溫加快其失效。

A．原液抑菌；B.2倍濃縮液抑菌

圖2 溫度對(duì)YQT13抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

2.3.2 光穩(wěn)定性

25 ℃下3種光照條件保存20 d，發(fā)酵液抑菌效果有顯著差異。全光照和避光保存20 d時(shí)，抑菌直徑相差4.4 mm，半光照下抑菌效果介于二者之間(圖3)。說明光照不利于YQT13發(fā)酵液發(fā)揮抑菌作用和儲(chǔ)存。

2.3.3 pH穩(wěn)定性

沙氏葡萄糖培養(yǎng)基的YQT13發(fā)酵原液pH值為2.71～2.94。調(diào)節(jié)YQT13發(fā)酵液pH值進(jìn)行pH穩(wěn)定性測定(圖4)，pH值為3.0保存24 h，抑菌效果無變化；當(dāng)pH值為6.0和8.0時(shí)，前12 h內(nèi)抑菌直徑明顯下降，12 h后趨于平穩(wěn)不再下降；而調(diào)節(jié)發(fā)酵液至pH值為10.0或12.0時(shí)，其抑菌效果快速下降，且24 h內(nèi)完全失去抑菌活性。說明酸性條件有利于抑菌化合物的保存及發(fā)揮抑菌效果。

圖4 pH值對(duì)YQT13抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

以抑菌直徑為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，單因素試驗(yàn)篩選出沙氏葡萄糖培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，葡萄糖和蛋白胨為最佳的碳氮源，搖培速度、培養(yǎng)溫度和初始pH值明顯影響YQT13菌絲生長及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。通過正交試驗(yàn)篩選得出最佳抑菌培養(yǎng)條件為：葡萄糖40 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、初始pH值6.2、搖培速度160 r·min-1、培養(yǎng)溫度35 ℃，其發(fā)酵液具有最佳的抑菌效果，發(fā)酵原液抑菌直徑為(14.2±0.3)mm，2倍濃縮液抑菌直徑為(15.7±0.2)mm，即濃縮作用能有效提高抑菌效果。長時(shí)間(大于20 d)光照或高溫(大于20 ℃)處理都會(huì)加速活性物質(zhì)的降解，pH值8.0～12.0環(huán)境中顯著加快活性物質(zhì)降解，并在24 h內(nèi)失去抑菌活性。所以抑菌活性物質(zhì)在低溫(20

℃以下)、避光、酸性(pH值2.7～3.0)環(huán)境中能發(fā)揮更佳的抑菌效果也更便于儲(chǔ)存。

培養(yǎng)基篩選中，Martin培養(yǎng)基培育出大量的菌絲但是發(fā)酵液完全沒有抑菌效果；MMN培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌絲量最多，但是發(fā)酵液的抑菌效果不如沙氏葡萄糖培養(yǎng)基明顯，可能是由于培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)限制了抑菌物質(zhì)的生產(chǎn)或者是有效抑菌成分被降解。而Martin培養(yǎng)基中含有多種離子化合物可能是無抑菌效果的主要因素；察氏培養(yǎng)基中菌絲不生長，也可能與其中大量的離子化合物有關(guān)。YQT13菌株發(fā)酵液嚴(yán)重偏酸(pH值2.71～2.94)，這種酸性物質(zhì)可能是抑菌的活性成分，而這些酸的大量積累也抑制了YQT13菌絲繁殖；堿性環(huán)境明顯降低抑菌效果甚至完全失活，也從側(cè)面說明酸可能是抑菌物質(zhì)。鄂爾多斯地區(qū)屬于嚴(yán)重的鹽堿地，部分地區(qū)地表可見白色鹽堿物，土壤平均pH值為8.0，而堿性環(huán)境不利于抑菌物質(zhì)發(fā)揮作用，所以探究出在鹽堿地環(huán)境施藥方法是下一步研究工作重點(diǎn)。

[1] 何維明,董鳴.毛烏素沙地旱柳生長和生理特征對(duì)遮蔭的反應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2003,14(2):175-178.

[2] 吳統(tǒng)貴,周和鋒,吳明.旱柳光合作用動(dòng)態(tài)及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J].生態(tài)學(xué)雜志,2008,27(12):2056-2061.

[3] 晁開瑞.柳樹枯萎病病原菌及其致病毒素和潛在風(fēng)險(xiǎn)性的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2016.

[4] DAY W R. The watermark disease of the cricket bat Willow (Salixcaerulea)[J]. Oxford Forestry Memoirs,1924(3):30.

[5] LINDEIJER E J. Een bacterie-ziekte van de wilg[J]. Tijdschrift Over Plantenziekten,1931,37(3):63-67.

[6] TURNER J G, DAVIS J M L, GUVEN K. Watermark disease of tree willows[J]. Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. Section B. Biological Sciences,1992,98:105-117.

[7] DOWSON W J.Bacteriumsalicisday, the cause of the watermark disease of the cricket-bat willow[J]. Annals of Applied Biology,1937,24(3):528-544.

[8] METCALFE G. The watermark disease of willows. Ⅰ. Host-parasite relationships[J]. New Phytologist,1940,39(3):322-332.

[9] MAES M, HUVENNE H, MESSENS E.Brenneriasalicis, the bacterium causing watermark disease in willow, resides as an endophyte in wood[J]. Environ Microbiol,2009,11(6):1453-1462.

[10] SAKAMOTO Y, SANO Y. Inhibition of water conductivity caused by watermark disease inSalixsachalinensis[J]. Iawa Journal,2000,21(1):49-60.

[11] SAKAMOTO Y, TAKIKAWA Y, SASAKI K. Occurrence of watermark disease of willows in Japan[J]. Plant Pathology,1999,48(5):613-619.

[12] 金九辰,劉瑞,王清萍.西寧地區(qū)柳樹細(xì)菌性枯萎病的研究[J].中國森林病蟲,2001,20(1):5-7.

[13] SCHIPPER M A A. Revision of the genusRhizopus[J]. Stud Mycol,1984,25:1-34.

[14] 孔維銳,郭福宗,周勝.產(chǎn)糖化酶根霉菌的分離及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].釀造科技,2012(9):32-35.

[15] 姚彥坡.防治馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病木霉菌的篩選及生防機(jī)制研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[16] BHUYAN S A. Antagonistic effect ofT.viride,T.harzianumandAaperigillusterreusonRhizoctoniasolanicausing sheath blight of rice[J]. Agricultural Science Society of North East India,1994,7(1):125-128.

[17] 樊恒達(dá).擬康氏木霉和黑根霉對(duì)枯萎病的協(xié)同防治作用[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2015.

朱丹璐，女，1991年11月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：913695404@qq.com。

劉雪峰，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，研究員。E-mail：757489401@qq.com。

2016年12月13日。

S763.1

Fermentation Conditions and Antibacterial Stability ofSalixmatsudanaWilt Disease Antagonistic Fungi YQT13//Zhu Danlu Liu Zhongxuan, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Liu Zhaoxia, Wang Bin(Forest Protection Station, Erdos City in Inner Mongolia Autonomous Region)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(7)：94-97.

1)事業(yè)單位委托科技項(xiàng)目(2015-170)。

責(zé)任編輯：程 紅。

The strain YQT13 (Rhizopusoryzae), which inhibits the growth of pathogens (Pantoeaagglomerans), was isolated from the soil samples collected from the Ejin Horo Banner. The optimum culture medium was screened by plate perforation confinement, the optimum culture condition was optimized and the stability of fermentation broth was studied. The glucose of 40 g·L-1, peptone of 10 g·L-1, pH of 6.2, 160 r·min-1and culture temperature of 35 ℃ were the best culture conditions. The fermented stock solution had a bacteriostatic diameter of (13.3±0.1)mm. Concentration could effectively improve the bacteriostatic effect of fermentation broth. The bacteriostatic activity of the fermentation broth was kept at 121 ℃ for 30 min or -80 ℃-0 ℃ for 20 d, but the light stability was poor. The bacteriostatic activity was not changed in pH of 3.0 for 24-h storage. With the increase of pH, the bacteriostatic diameter was decreased, and the bacteriostatic diameter was 0 in pH≥10.0 for 24-h storage.