河北保定地區(qū)羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲的調(diào)查與鑒定

于合宅

(河北省望都縣畜牧水產(chǎn)局，河北 保定 072450)

河北保定地區(qū)羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲的調(diào)查與鑒定

于合宅

(河北省望都縣畜牧水產(chǎn)局，河北 保定 072450)

為了解河北省山羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲的感染情況，本研究對河北省淶源縣、阜平縣和易縣的山羊和犬進行絳蚴蟲感染情況調(diào)查，并通過PCR技術對多頭蚴與多頭帶絳蟲分離株線粒體pnad1基因部分序列進行擴增與分析，確定多頭蚴和多頭帶絳蟲之間的種系發(fā)育關系。結果顯示，調(diào)查區(qū)域山羊多頭蚴與犬多頭帶絳蟲感染率分別為2.38%和15.33%，通過DNAStar軟件分析，所獲得多頭蚴和多頭帶絳蟲分離株分別與四川多頭帶絳蟲分離株的相似性分別為98.9%～99.5%和99.5%～99.8%，確定羊多頭蚴為犬多頭帶絳蟲的幼蟲。

多頭蚴;多頭帶絳蟲;調(diào)查;pnad1基因;鑒定

羊腦包蟲病由腦多頭蚴(Coenurus cerebralis)引起，而腦多頭蚴是多頭帶絳蟲(Taenia multiceps)的中絳期幼蟲。腦多頭蚴寄生于山羊、綿羊、牛和駱駝等有蹄動物的大腦、延腦與脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)，引起致死性腦多頭蚴病，人也可以感染［1］，多頭帶絳蟲寄生于犬、狼和狐貍等犬科動物小腸內(nèi)。該蟲種呈全世界分布，主要見于亞洲、非洲和歐洲等國家和地區(qū)，在我國主要以西北、東北和華北等廣大牧區(qū)較為常見，且近幾年動物感染率呈逐漸上升趨勢［2］。目前河北省尚無關于山羊多頭蚴感染情況的調(diào)查與種類鑒定。因此，本研究通過對河北省部分地區(qū)山羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲感染情況進行調(diào)查，提取多頭帶絳蟲頭節(jié)和多頭蚴蟲體DNA，對線粒體pnad1基因進行擴增與分子鑒定，為該地區(qū)多頭蚴/多頭帶絳蟲病的防制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查范圍及樣品數(shù)量 2016年4月－2016年10月，對河北省淶源縣、阜平縣和易縣3個縣區(qū)的6個羊場共546頭山羊和羊場附近的流浪犬、家犬等共150只進行絳蟲蚴病感染情況調(diào)查。

1.2 調(diào)查方法 通過詢問羊場畜主與羊群發(fā)病的情況，包括羊群的數(shù)量、發(fā)病頭數(shù)、臨床表現(xiàn)、發(fā)病史、治療藥物與效果等，對疑似患有多頭蚴病的山羊進行觀察與觸診，確定其體表、胸腔、腹部及腦部是否存在腫塊。

1.3 檢查方法 采用完全解剖法，對山羊皮下、肌肉、腹腔、大腦和脊髓等部位進行逐一檢查。對犬只進行禁食12 h，投喂含有氫溴酸檳榔堿(7.5 mg/kg體重)的肉塊進行體內(nèi)驅(qū)蟲，于1 h后收集犬排出的糞便，對分別進行無害化處理后收集多頭帶絳蟲節(jié)片，進行形態(tài)學鑒別后統(tǒng)計荷蟲數(shù)。

1.4 絳蚴蟲的分子鑒定與種系發(fā)育關系分析 對獲得的絳蚴蟲樣品進行分子生物學鑒定，用Omega生物技術公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取絳蚴蟲的DNA基因組，本試驗以PCR技術對絳蚴蟲線粒體pnad1基因序列進行擴增，通過序列分析對絳蚴蟲進行分子學鑒定。其中擴增引物利用湯國祥等［3］設計的引物，其中上游引物:Nad1-F:5'-GGGTTATTCTCAGTTTCGTAAGGGC-3'(25 bp)，下游引物Nad1-R: 5'-ATACATATTACGTACAAGATTA-3'(22 bp)，引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。采用25 ul擴增體系:雙蒸水13.75 uL，2×Taq PCR Master Mix 8.75μL，上下游引物(50 pmol/L)各0.25μL，模板DNA 2μL，混勻后低速離心，并作空白對照。反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，37個循環(huán)，72℃后延伸5 min。擴增產(chǎn)物于4℃保存。

取5μL擴增產(chǎn)物進行1%凝膠電泳，將陽性樣品回收后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，將測定的序列與GenBankTM收錄的同源序列進行同源性對比，利于DNAStar軟件分析序列之間差異。

2 結果

2.1 不同地區(qū)山羊多頭蚴與犬多頭帶絳蟲感染情況結果 通過對山羊進行剖檢與犬藥物驅(qū)蟲結果來看，多頭蚴病感染率為2.38%，感染強度為1～9;多頭帶絳蟲感染率為15.33%，感染強度為3～12，見表1和表2。

2.2 不同地區(qū)山羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲感染強度調(diào)查結果 見表2。

表1 不同地區(qū)山羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲感染率調(diào)查情況

表2 不同地區(qū)山羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲感染強度調(diào)查結果

2.3 不同生長階段羊多頭蚴感染情況 通過分析不同生長階段羊群感染多頭蚴病的特點，發(fā)現(xiàn)各生長階段羊群都可以感染多頭蚴病，但以6月齡以下羊群感染率稍高，而12月齡以上羊群感染強度則相對較大，見表3。

表3 不同生長階段羊多頭蚴感染情況

2.4 PCR擴增結果 隨機從6個地區(qū)分別抽取多頭蚴和犬多頭帶絳蟲樣品各1份，共對12個樣品均成功擴增出約520 bp的條帶，且無非特異性條帶，與預期擴增目的片段相符，空白對照為陰性。選擇全部樣品中6個樣品進行凝膠電泳(如圖1)。

圖1 多頭蚴和多頭帶絳蟲線粒體pnad1基因序列PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析M:DL-2 000相對分子質(zhì)量標準;1～6:DTY1、DTY2、DTY3、DTT1、DTT2和樣品DTT3;7:陰性對照

2.5 測序與序列分析結果 經(jīng)測序結果顯示，去掉引物片段后，所獲得的絳蚴蟲線粒體pnad1基因片段均為516 bp，6個多頭蚴和多頭帶絳蟲分離株線粒體pnad1基因序列相似性分別為99.2%～99.8%和99.8%～100%，與四川多頭帶絳蟲分離株(登錄號:KC794810.1)的相似性分別為98.9% ～99.5%和99.5%～99.8%，與帶屬其他絳蟲的相似性均分別低于90.4%和90.8%。結果顯示，此次研究獲得的多頭蚴和犬多頭帶絳蟲分離株均屬于多頭帶絳蟲。

3 討論

本次調(diào)查結果顯示，河北省部分地區(qū)山羊多頭蚴病感染率為2.38%，低于李連芳［4］報道的青海省牛、羊多頭蚴感染率(3.01%和1.44%)，高于戴榮四［5］等對湘西自治州不同地區(qū)山羊多頭蚴病感染率(5.31%)和夏晨陽［6］等對西藏地區(qū)綿羊多頭蚴病感染率(4.26%)。犬多頭帶絳蟲病感染率為15.33%，感染強度為1～16條，低于許正林［7］等報道的青海省天俊地區(qū)犬多頭帶絳蟲病感染情況(感染率為6.38%，平均感染強度為14.67條)，高于戴榮四［8］等對湖南省懷化地區(qū)犬多頭帶絳蟲病感染情況(感染率為25.0%，感染強度為2～14條)。對于不同生長階段羊群來看，6月齡以下的羊群多頭蚴病感染率最高，但是與夏晨陽［6］等調(diào)查結論有所差異(成年綿羊的多頭蚴病感染率最高)。由以上可知，不同地區(qū)絳蚴蟲病感染情況均有較大差異，這除了與當?shù)仞B(yǎng)殖場衛(wèi)生環(huán)境、飼養(yǎng)模式、絳蚴蟲病防疫和樣品采集時間、地點和數(shù)量密切相關以外，還與當?shù)卣c養(yǎng)殖戶對絳蚴蟲病的防制重視程度密切相關。

本次試驗首次在對河北省部分地區(qū)進行羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲感染調(diào)查的基礎上對羊絳蚴蟲進行線粒體pnad1基因序列進行擴增與種系發(fā)育分析。結果顯示，擴增所獲得的河北省3個不同地區(qū)6個羊多頭蚴和犬多頭帶絳蟲分離株線粒體pnad1序列長度一致，為516 bp，但不同分離株之間存在一定的遺傳差異，其中多頭蚴分離株之間種內(nèi)差異為0.2%～0.8%，而多頭帶絳蟲分離株之間種內(nèi)差異偏小，為0%～0.2%。多頭蚴和多頭帶絳蟲分離株與GenBank收錄的四川多頭帶絳蟲分離株(登錄號:KC794810.1)的同源性分別為98.9% ～99.5%和99.5%～99.8%，與帶屬其他絳蟲的相似性均分別低于90.4%和90.8%。結果顯示，此次研究獲得的多頭蚴和多頭帶絳蟲分離株均屬于多頭帶絳蟲，本試驗為羊多頭蚴與犬多頭帶絳蟲病的診斷、防制及進一步分子學研究奠定基礎。

［1］ 楊光友，張志和．野生動物寄生蟲病學［M］．北京:科學出版社，2013:386-389．

［2］ 李文卉，付寶泉．腦多頭蚴病研究進展［J］．動物醫(yī)學進展，2010，31(30):81-91．

［3］ 湯國祥，劉笛秋．山羊腦多頭蚴線粒體nad1基因的克隆及序列分析［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(9):87-90．

［4］ 李連芳．青海省牛羊多頭蚴病流行情況調(diào)查［J］．青海畜牧獸醫(yī)雜志，2011，41(1):25-26．

［5］ 戴榮四，李芬，劉偉，等．湘西地區(qū)山羊多頭蚴感染情況調(diào)查與種類鑒定［J］．中國人獸共患病學報，2009，25(4):391-394．

［6］ 夏晨陽，劉健枝，次仁多吉，等．西藏家畜三種絳蟲蚴病感染情況的調(diào)查［J］．中國獸醫(yī)科學，2014，44(11):1 205-1 209．

［7］ 許正林，李福壽．犬多頭帶絳蟲感染情況調(diào)查［J］．青海畜牧獸醫(yī)雜志，2009，39(3):28．

Epidemic survey and identifiaction of Coenurus and Taenia multiceps in parts areas of Hebei province

YU He-zhai

(The animal husbandry and Fisheries bureau of WangDu County，Baoding 072450，China)

The aims of the present study were to investigate the prevalence of Coenurus in goats and Taenia multiceps in dogs in Hebei province．We examined the infections of Coenurus and Taenia multiceps in Laiyuan，F(xiàn)upin and Yi counties in Hebei province．The survey showed that the prevalence of Coenurus and Taenia multiceps was 2．38%and 15．33%，respectively．In addition，the target gene(nad1)of Coenurus and Taenia multiceps was amplified by PCR to analyze the nad1 genetic difference between them．It was showed that the sequence similarity of Coenurus and Taenia multiceps with the sequence of Taenia multiceps available in Genbank was 98．9－99．5%and 99．5－99．8%，respectively．It is confirmed that Coenurus of the goats belongs to the larva of Taenia multiceps．

Coenurus;Taenia multiceps;Investigation;nad1 gene;Identification

2016-12-16

于合宅(1965-)，男，高級獸醫(yī)師，本科，從事獸醫(yī)技術推廣工作，E-mail:1321545275@qq．com

R383．3

A

0529-6005(2017)06-0018-03