福建省鼠類感染巴爾通體調(diào)查及序列分析

肖方震，林代華，周淑姮，徐國英，鄧艷琴，2

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福建省鼠類感染巴爾通體調(diào)查及序列分析

肖方震1，林代華1，周淑姮1，徐國英1，鄧艷琴1，2

目的 了解福建省鼠類中巴爾通體(Bartonellaspp.)的感染狀況和基因特征。方法 2014-2016年采用籠日法在福建省閩東、閩西、閩南、閩北和閩中捕鼠，現(xiàn)場鑒定并記錄捕獲鼠類的釆集時間、地點(diǎn)、鼠種、性別、鼠齡等資料。采集鼠心臟血，PCR擴(kuò)增巴爾通體的gltA和16S～23S rRNA基因，陽性PCR產(chǎn)物送測序并進(jìn)行序列比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。感染率間的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。結(jié)果 調(diào)查共布放鼠籠5 917籠次，捕鼠381只，鼠密度為6.44%。巴爾通體感染率為12.34%。家鼠的巴爾通體感染率為10.61%，褐家鼠(Rattusnorvebicus)和黃胸鼠(Rattusflavipectus)感染率分別為11.30%和10.00%；野鼠的感染率為13.86%，黃毛鼠(Rattuslosea)和針毛鼠(Rattusfulvescens)感染率分別為22.86%和18.00%，野鼠的巴爾通體感染率高于家鼠的感染率，但無統(tǒng)計學(xué)意義。從地區(qū)分布看，閩西、閩北一帶的感染率較高，分別為20.00%和25.33%。閩南一帶感染率最低，為0。各地區(qū)感染率存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同性別、鼠齡的巴爾通體感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而不同的生境下的感染率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。陽性樣本測序分析顯示，福建省鼠類感染的巴爾通體序列與B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii序列最接近。結(jié)論 福建省鼠類存在巴爾通體感染，存在對人群致病的風(fēng)險。

巴爾通體； 鼠類；基因特征；福建

巴爾通體(Bartonellaspp.)是一群革蘭氏染色陰性菌，屬于變形菌綱、α亞綱、根瘤菌目、巴爾通體科、巴爾通體屬。目前至少有26個種和亞種[1]，其中超過半數(shù)與鼠類有關(guān)[2]。巴爾通體可引起人的戰(zhàn)壕熱、貓抓病、心內(nèi)膜炎、菌血癥和桿菌性血管瘤等疾病，尤其在免疫功能低下的人群，如HIV患者極易感染。近年由于各種巴爾通體引起的心內(nèi)膜炎、菌血癥等病例日益增多, 因此受到廣泛的關(guān)注。目前我國的云南、內(nèi)蒙古、浙江等省份陸續(xù)對鼠類感染巴爾通體開展了調(diào)查[3-5]，福建對家鼠開展過調(diào)查，但野鼠未見報道，本調(diào)查較為完整地對福建省不同地區(qū)的家鼠和野鼠開展調(diào)查，以了解福建省鼠類攜帶巴爾通體狀況并進(jìn)行基因鑒定和分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2014-2016年相繼在福建的長樂、德化、福安、古田等11個地區(qū)捕捉家棲鼠和野鼠，調(diào)查地點(diǎn)涵蓋了福建省的東西南北中不同地理區(qū)域，即閩東、閩西、閩南、閩北和閩中。捕鼠采用籠日法,鼠籠晚放晨收?，F(xiàn)場鑒定鼠種,填寫調(diào)查表，記錄每只鼠的相關(guān)信息包括編號、釆集時間、地點(diǎn)、生境、鼠種、鼠齡、雌雄等。同時將捕獲的鼠放入鼠袋內(nèi),經(jīng)乙醚麻醉后,消毒，心臟采血。共采集了381份鼠的全血樣本，置于-80 ℃保存。

1.2 DNA提取 使用血液基因組DNA提取試劑盒(廈門泰京生物技術(shù)有限公司)提取樣本DNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 PCR擴(kuò)增 參考相關(guān)文獻(xiàn)在gltA基因[6]和16S～23S rRNA基因間隔區(qū)(ITS)[7]分別設(shè)計一對引物。其中g(shù)ltA基因設(shè)計引物為BhCS781.p:5′-GGG GAC CAG CTCATG GTG G-3′，BhCS1137.n:5′-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3′。在16S～23S rRNA基因間隔區(qū)設(shè)計引物為TIIe.455p:5′-GCT TGT AGC TCA GTT GGT TAG-3′，TALa.885n:5′-TGC TTG CAA AGC AGG TGC TCT-3′PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中含有Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、DNA模板3 μL，加無菌去離子水至總體積25 μL。引物BhCS781.p和BhCS1137.n 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s、循環(huán)30次， 72 ℃總延伸5 min。引物TIIe.455P和TALa.885n 引物的條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s、55 ℃退火50 s，72 ℃延伸20 s、循環(huán)30次， 72 ℃總延伸5 min。兩對引物均為陽性，判定為陽性，若僅一對引物陽性則認(rèn)為陰性。首份PCR陽性標(biāo)本送上海生工生物技術(shù)公司測序，經(jīng)序列比對，確定為巴爾通體，其后的標(biāo)本檢測以此作為陽性對照。為避免發(fā)生假陽性反應(yīng)，DNA模板提取、PCR反應(yīng)、電泳均在不同的房間操作，同時每次反應(yīng)均設(shè)有陰性對照。

1.4 產(chǎn)物檢測 取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，90 V 40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。采用凝膠回收試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，參照試劑盒說明書進(jìn)行，純化后送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.5 DNA序列分析 測序得到的DNA序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行BLAST，與相似的序列進(jìn)行同源性分析。同時應(yīng)用BioEdit軟件對序列進(jìn)行剪接，應(yīng)用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，率的比較采用四格表χ2檢驗(yàn)、行列表χ2檢驗(yàn)和Fisher’s確切概率法，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)查的鼠密度以及鼠種構(gòu)成 調(diào)查共布放鼠籠5 917籠次，捕鼠381只，鼠密度為6.44%(表1、表2)。閩中和閩東地區(qū)鼠密度較高，分別為8.60%和8.46%，閩南地區(qū)最低，僅為3.29%(表3)。所捕獲的鼠中，家鼠179只，野鼠202只。家鼠中以褐家鼠和黃胸鼠為主，分別占64.25%和33.52%，小家鼠最少，僅占2.23%。野鼠中以黃毛鼠、板齒鼠和針毛鼠為主，分別占34.65%、22.28%和24.75%；東方田鼠所占比例最低，占0.50%。

表1 調(diào)查地區(qū)的鼠種構(gòu)成及分布

Tab.1 Distribution of rodents in survey areas of Fujian Province

鼠種Speciesofrodents地區(qū)(Region)閩東EasternFujian閩西WesternFujian閩南SouthernFujian閩北NorthernFujian閩中CentralFujian總計Total褐家鼠R．norvebicus49311322115黃胸鼠R．flavipectus288024060小家鼠MusmusculusLinnaeus000404板齒鼠Bandicotaindica82003545東方田鼠MicrotusfortisBuchner000101黑線姬鼠Apodemusagrarius000202黃毛鼠R．losea103184870青毛鼠Rattusbowersilatouchei72141024社鼠Rattusconfucianus7102010針毛鼠N．fulvescens1713011950總計Total126601675104381

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 引物BhCS781.p和BhCS1137.n和TIIe.455p和TALa.885n均擴(kuò)增出陽性產(chǎn)物，陽性產(chǎn)物片段分別為379 bp的片段(見圖1)和451 bp(圖2)。陰性對照均無擴(kuò)增出條帶。兩對引物擴(kuò)增出來的結(jié)果完全一致。

M：DNA標(biāo)志物；1：陽性對照；2：陰性對照； 3～9：本調(diào)查采集的鼠類血樣M: DNA marker; 1: Positive control; 2: Negative control; 3-9: Blood samples of rodents collected in the survey.圖1 鼠類血樣巴爾通體的gltA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Bartonella gltA gene

M：DNA標(biāo)志物；1：陰性對照；2：陽性對照； 3～9：本調(diào)查采集的鼠類血樣M: DNA marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3-9: Blood samples of rodents collected in the survey.圖2 鼠類血樣16S～23S rRNA 基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of Bartonella 16S-23S rRNA ITS

2.3 不同鼠種感染巴爾通體情況 調(diào)查共檢測381份鼠血，檢出巴爾通體陽性的樣本47份，陽性率為12.34%。其中家鼠的陽性率為10.61%，野鼠的陽性率為13.86%。兩者間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.93，P>0.05)。家鼠中陽性率最高的為褐家鼠，感染率為11.30%，其次是黃胸鼠，感染率為10.00%。小家鼠感染率最低。野鼠中黑線姬鼠的感染率為100%，但樣本量太少，不具有代表性。主要鼠種中黃毛鼠和針毛鼠感染率接近，分別為22.86%和18.00%，板齒鼠和青毛鼠的感染率為0。

表2 不同鼠種感染巴爾通體情況

Tab.2Bartonellainfection in different rodents

鼠種Speciesofrodent檢測數(shù)/只No．ofexamined陽性數(shù)/只No．ofpositive陽性率%Positiverate(%)家鼠Domesticatedrodents黃胸鼠R．flavipectus60610．00小家鼠M．Linnaeus400褐家鼠R．norvebicus1151311．30合計Total1791910．61野鼠Wildrodents黑線姬鼠A．a(chǎn)grarius22100黃毛鼠R．losea701622．86板齒鼠B．indica4500青毛鼠R．bowersilatouchei2400社鼠R．confucianus10110．00東方田鼠M．buchner100針毛鼠N．fulvescens50918．00合計Total2022813．86總計Total3814712．34

2.4 不同地區(qū)感染巴爾通體分析 調(diào)查涵蓋了福建的閩東、閩西、閩南、閩北和閩中。其中閩西、閩北一帶的感染率較高，分別為20%和25.33%。閩中次之，感染率為13.46%。閩東和閩南一帶感染率較低，分別為1.59%和0。各地區(qū)的差異存在統(tǒng)計學(xué)差異(Fisher’s確切概率法，P<0.05)。

表3 不同地區(qū)鼠形動物感染巴爾通體情況

Tab.3Bartonellainfection in rodents in different regions

地區(qū)Region布籠數(shù)No．ofcage捕獲數(shù)No．ofexamined鼠密度%Densityrate%陽性數(shù)No．ofPositive陽性率%Positiverate/%閩中CentralFujian12091048．601413．46閩東EasternFujian14901268．4621．59閩西WesternFujian1216604．931220．00閩南SouthernFujian487163．2900 閩北NorthernFujian1515754．951925．33合計Total59173816．444712．34

2.5 不同性別和鼠齡感染巴爾通體分析 對不同的性別、鼠齡等可能的影響因素進(jìn)行調(diào)查分析。共調(diào)查雄性鼠184只，雌性鼠197只，感染只數(shù)分別為25和22只，感染率分別為12.69%和11.96%(表4)，雌雄鼠間的感染率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.83>0.05)。以鼠齡分析，老年鼠、成年鼠和幼年鼠分別為25只、292只和64只，感染的只數(shù)分別為1、37和9只(表5)，其感染率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.10，P=0.29>0.05)。

表4 不同性別鼠類巴爾通體感染情況

Tab.4 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s gender

性別Sex檢測數(shù)(只)No．ofexamined陽性數(shù)(只)No．ofPositive陽性率(%)Positiverate/%雄性male1972512．69雌性Female1842211．96總計Total3814712．34

表5 不同鼠齡的巴爾通體感染情況

Tab.5 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s age

2.6 不同生境感染巴爾通體分析 野鼠是在農(nóng)田、丘陵灌叢和山坡中捕獲的，農(nóng)田捕獲鼠類的感染率最高為38.78%，丘陵灌叢捕獲的鼠類感染率最低為3.23%。由于部分家野鼠互竄，家棲的鼠類感染率為10.86%(表6)。不同生境下的感染率存在統(tǒng)計學(xué)差異(Fisher’s確切概率法，P<0.05)。在農(nóng)田地區(qū)感染巴爾通體危險性高于其他生境。

表6 不同生境野鼠感染情況

Tab.6 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s habitats

2.7 序列分析 從鼠血中擴(kuò)增出的gltA基因陽性標(biāo)本中隨機(jī)抽取部分進(jìn)行純化和測序，并進(jìn)行blast序列比對。結(jié)果顯示福建省鼠類感染的巴爾通體序列與B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii序列最接近。其中尤溪的巴爾通體序列與突尼斯的B.grahamii(KP126462)序列完全一致，同源性達(dá)100%。清流、長樂和順昌的樣本序列一致，該序列與法國野鼠中的B.tribocorum(AJ005494)序列高度相似，同源性達(dá)99%。永安的巴爾通體序列與臺灣的B.grahamii(GU056195)序列較接近，同源為96%。而與邵武的巴爾通體序列接近的是來源于泰國的B.elizabethae(GQ225710)，同源性為95%。同時選取Genbank基因庫中的序列構(gòu)建進(jìn)化樹。樹狀圖顯示同一地點(diǎn)的基因型基本一致。來源于清流、長樂和順昌的巴爾通體序列與B.tribocorum序列在同一分支，來源于邵武和尤溪的序列與B.elizabethae序列在同一分支，而來源于永安的巴爾通體的序列與B.grahamii序列處于同一分支。

圖3 巴爾通體gltA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gltA gene of Bartonella

3 討 論

巴爾通體病是近年我國新發(fā)的傳染病之一，分布十分廣泛，可以感染多種宿主動物包括貓科動物、犬科動物和偶蹄動物等，嚙齒動物中的家鼠和野鼠是巴爾通體最主要的自然宿主和最大的儲存宿主，野鼠的棲息地往往也是巴爾通體的自然疫源地[8-9]。鼠類對巴爾通體在自然界的長期保存、傳播和流行起著重要作用。福建省山地丘陵約占陸地總面積的80%,省內(nèi)分布有多個山脈，自然地理環(huán)境很適合鼠類的生存及巴爾通體的傳播。

本調(diào)查采用兩對引物對福建省巴爾通體感染狀況進(jìn)行調(diào)查，其中引物BhCS781.p和BhCS1137.n擴(kuò)增gltA基因，具有屬特異性，在國內(nèi)外已廣泛被用于巴爾通體感染的診斷和研究，而引物TIIe.455p 和TALa.885n結(jié)果兩對引物擴(kuò)增16S～23S rRNA基因間隔區(qū)，由于間隔區(qū)具有高度變異性，可擴(kuò)增出不同大小的片段，從而區(qū)別不同種巴爾通體。選取這兩對引物利于我們同其他地區(qū)的巴爾通體進(jìn)行比較。兩對引物擴(kuò)增的結(jié)果完全一致。調(diào)查顯示福建省鼠類的巴爾通體的感染率為12.34%，葉曦等曾對福建省部分地區(qū)的家鼠開展過相關(guān)調(diào)查，感染率為14.57%，與本次調(diào)查相近。但僅涉及褐家鼠和黃胸鼠[10]，鼠種局限。而與臨近的省份浙江省調(diào)查的巴爾通體感染情況(4.44%)比較，福建省鼠類的感染率明顯更高[5]。本次調(diào)查較為系統(tǒng)對福建省家鼠和野鼠展開了調(diào)查與研究。結(jié)果顯示，與家鼠比較，野鼠的陽性率較高，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。福建省最常見的家鼠中的褐家鼠、黃胸鼠均檢出病原，野鼠中的黃毛鼠、針毛鼠等亦檢出巴爾通體。但在部分常見的野鼠鼠種，包括青毛鼠和板齒鼠中未檢出巴爾通體，板齒鼠和青毛鼠的分布有一定的區(qū)域性，推測與病原存在區(qū)域性有關(guān)。

B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii3種鼠傳巴爾通體是公認(rèn)的人類致病菌，可以引起人類的心內(nèi)膜炎、視神經(jīng)視網(wǎng)膜炎以及發(fā)熱等人類癥狀。序列分析顯示福建省鼠類攜帶的巴爾通體序列與此3種高度相似，提示福建省鼠類存在多種巴爾通體種感染，且多對人類致病，需引起有關(guān)部門的高度重視。

對巴爾通體感染其他因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示生境對鼠類感染巴爾通體存在影響，分布于農(nóng)田和山坡的野鼠，感染率遠(yuǎn)高于丘陵灌叢，而這兩種生境往往是人類生產(chǎn)活動的主要場所，因此需要引起我們重視。而性別和鼠齡并不是鼠類感染巴爾通體的影響因素。有研究顯示部分亞成年動物感染率和發(fā)病率遠(yuǎn)高于成年動物[8]，但本次調(diào)查顯示幼年鼠感染率與成年鼠的感染率的差異并未有統(tǒng)計學(xué)意義。

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Investigation and sequence analysis onBartonellainfection in rodents in Fujian Province, China

XIAO Fang-zhen1, LIN Dai-hua1, ZHOU Shu-heng1, XU Guo-ying1, DENG Yan-qin1,2

(1.FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China;2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

We explored the status ofBartonellainfection in rodents and the sequence characteristics ofBartonellain Fujian Province. Rodents in Fujian Province were captured by the night trapping method during 2014-2016. Information of the captured rodents on capturing dates and geographic locations, species, gender and ages were recorded. Heart blood samples were collected, from which the fragments ofgltAgene and16S-23S rRNA gene ofBartonellawere amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were sequenced and the phylogenetic tree was constructed for homology analysis by biological analysis software. Data on infection rate were analyzed with Chi-square or Fisher exact test to indicate statistical significance. Results showed that 5 917 cages were laid and 381 rodents were captured, density of rodent was 6.44%. The overallBartonellainfection rate in rodents was 12.34%, while infection rate in domesticated rodents was 10.61%, with 11.30% inRattusnorvebicusand 10.00% inR.flavipectus. And the infection rate in wide rodents was 13.86%, with a rate of 22.86% inRattusloseaand 18.00% inR.fulvescens, respectively. The infection rate was higher in wild rodents than in domesticated rodents, however, no significant difference was found. The Western Fujian and Northern Fujian region had the higher infection rates of 20.00% and 25.33%, and no infection was found in Southern Fujian region. The statistical analysis result revealed that a significant difference in infection rate among different region and habitats, but no significant difference in infection rate between male and female rodents, or among different ages. The BLAST results revealed the species to beB.tribocorum,B.elizabethaeandB.grahamii. In conclusion,Bartonellainfection is found in the rodents in Fujian Province and more attention should be paid on its impact on public health in the province.

Bartonella; rodent; genetic identification; Fujian

Deng Yan-qin, Email: fjcdcdyq@163.com

福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No.2012-CXB-12)和福建省自然科學(xué)基金項目(No.2017J01139)聯(lián)合資助

鄧艷琴，Email：fjcdcdyq@163.com

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001； 2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州 350004

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.007

R37

A

1002-2694(2017)07-0607-06

2017-01-12 編輯：張智芳

Supported by the Medical Innovation Funding of Fujian Province (No. 2012-CXB-12) and the Natural Science Foundation of Fujian (No. 2017J01139)