細(xì)胞氧化—還原狀態(tài)影響貝母素甲對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞增殖的抑制

齊彥++++++廖斌++++++徐成波++++++皇甫真萍++++++陳佳薇

[摘要] 目的 探討貝母素甲對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，以及細(xì)胞氧化-還原狀態(tài)失衡對(duì)此作用的影響。 方法 在體外培養(yǎng)K562細(xì)胞。運(yùn)用四唑鹽（MTT）比色法分析不同濃度貝母素甲（50、100、200、400、800 μmol/L）處理24 h對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，并用Bliss法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用分光光度法分別分析藥物處理對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）與谷胱甘肽（GSH）含量的影響。 結(jié)果 貝母素甲能劑量依賴性的抑制K562細(xì)胞的增殖，IC50為238 μmol/L。貝母素甲能誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生ROS，下調(diào)其細(xì)胞內(nèi)GSH含量，破壞細(xì)胞的氧化-還原平衡狀態(tài)?；钚匝跚宄齽㎞-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）與GSH的預(yù)處理可以抑制貝母素甲的上述效應(yīng)。 結(jié)論 貝母素甲可抑制K562細(xì)胞增殖，細(xì)胞氧化-還原失衡可能在這一過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 貝母素甲；K562細(xì)胞；氧化-還原；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R733.7；R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0016-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of peimine on cell proliferation of human leukemia K562 cells and the function of redox imbalance in this progress. Methods The human leukemia K562 cells were cultured in vitro. After K562 cells were treated with peimine at concentrations of 50， 100， 200， 400 and 800 μmol/L for 24 h， the cell proliferation was measured by thiazolyl blue tetrazolium bromide （MTT） assay. And the half maximal inhibitory concentration （IC50） of peimine was calculated using the Bliss method. The changes of intracellular reactive oxygen species （ROS） and glutathione （GSH） concentration were detected using spectrophotometry. Results Peimine inhibited the proliferation of K562 cells in a dose-dependent manner. And the IC50 of peimine was 238 μmol/L. Furthermore， peimine could promote the ROS production and glutathione （GSH） depletion. The balance of oxidation-antioxidation function destroyed. Pre-incubation with antioxidants GSH or N acetyl cysteine （NAC） almost abolished the effects of peimine. Conclusion The present study therefore shows that peimine inhibits the proliferation activity in K562 cells. The redox imbalance may play a key role in this process.

[Key words] Peimine； K562 cells； Redox； Cell proliferation

浙貝母為臨床常用止咳化痰中藥，始載于《本草正》，為貝母屬植物浙貝母（Fritillatia thunbergii Miq.）的干燥鱗莖[1]。貝母素甲（Peimine）是浙貝母的主要藥效成分之一[2]，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多耐藥現(xiàn)象[2-7]。以浙貝母為君藥的復(fù)方淅貝母顆粒能提高難治性急性白血病圍化療期臨床緩解率[8]。盡管這些研究提示貝母素甲具有抗腫瘤活性，但其對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leu？鄄kemia，CML）細(xì)胞增殖影響的研究依然甚少，諸多相關(guān)問題有待厘清。

細(xì)胞在生命活動(dòng)過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。同時(shí)，細(xì)胞中還存在谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，GAT）等構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)，可清除過多的ROS，避免細(xì)胞受到過度的氧化損傷[9]。ROS的生成與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡使細(xì)胞處于一個(gè)正常的氧化-還原狀態(tài)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等正常生命過程[10-12]。此狀態(tài)的失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，甚至死亡。Bcr-Abl突變的CML細(xì)胞ROS水平比正常細(xì)胞高，對(duì)氧化-還原狀態(tài)的改變更為敏感[13]。一些藥物可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS爆發(fā)、GSH含量下調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤的效果[14-16]。

對(duì)此，本項(xiàng)研究采用人白血病細(xì)胞株K562為體外研究模型，試圖從細(xì)胞氧化-還原狀態(tài)變化的角度分析貝母素甲對(duì)人白血病細(xì)胞體外增殖的影響機(jī)制，為貝母素甲用于人白血病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562由福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

貝母素甲（Peimine，純度> 98%）產(chǎn)自美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司。稱取21.6 mg貝母素甲，采用0.2 mL無水乙醇助溶，再加19.8 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基，配制成50 mmol/L工作液，過濾除菌，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及設(shè)備

培養(yǎng)基RPMI 1640與胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）為Gibco公司生產(chǎn)；MTT[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide]和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）產(chǎn)自Amresco公司；還原型谷胱苷肽（glutathione，GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）、GSH檢測(cè)試劑盒（S0053）和活性氧檢測(cè)試劑盒（S0033）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品，超凈工作臺(tái)產(chǎn)于蘇州凈化設(shè)備有限公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀產(chǎn)自BioTek公司，Infinite 200 PRO全波長(zhǎng)多功能微孔板檢測(cè)儀產(chǎn)自瑞士TECAN公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS），培養(yǎng)環(huán)境為37℃、飽和濕度、5%CO2，3d傳代1次，收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞增殖的檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞（4×104個(gè)/mL）同步化后接種于96孔板內(nèi)，每孔加細(xì)胞懸液100 μL。各藥物組加入貝母素甲至終濃度分別為50、100、200、400、800 μmol/L，空白對(duì)照組加等體積的藥物溶解介質(zhì)。清除劑實(shí)驗(yàn)中，用GSH（5 mmol/L）或NAC（5 mmol/L）分別預(yù)處理K562細(xì)胞1 h，然后進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。加藥處理24 h后，每孔加MTT至0.5 mg/mL，常規(guī)培養(yǎng)3 h，離心棄上清，加100 μL DMSO溶解沉淀。采用570 nm為主波長(zhǎng)，630 nm為參比波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收值（A值）。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%，藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）采用Bliss法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 細(xì)胞ROS含量的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[17]所述方法進(jìn)行測(cè)量。大致如下：同步化適量的K562細(xì)胞并隨機(jī)分組。以不同終濃度貝母素甲處理的為藥物組，以加等體積藥物溶解介質(zhì)處理的為空白對(duì)照組。抑制劑實(shí)驗(yàn)中，采用ROS清除劑NAC預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞9 h后，各組細(xì)胞加ROS特異性熒光探針DCFH2-CA至10 μmol/L，37℃避光培養(yǎng)30 min，收集并用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。采用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，于全波長(zhǎng)多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)。以相對(duì)于空白對(duì)照組的倍數(shù)表示各組的ROS含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 細(xì)胞GSH含量的檢測(cè) 按“1.4.3”所述方法分組并處理細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，加入適量蛋白去除試劑溶液，振蕩混勻，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心取上清液進(jìn)行測(cè)定。具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行，405 nm處檢測(cè)光吸收值，計(jì)算GSH含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制

利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力是分析細(xì)胞增殖的一種快捷、常用的方法。本研究結(jié)果表明，各藥物組與空白對(duì)照組相比，100、200、400、800 μmol/L濃度組的吸光值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），抑制率隨藥物濃度增大而升高。貝母素甲對(duì)K562的IC50為238 μmol/L。上述結(jié)果提示貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖存在抑制作用。見表1。

2.2 貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞ROS生成的誘導(dǎo)

應(yīng)用DCFH2-DA熒光探針檢測(cè)貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞ROS含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貝母素甲100、200、400 μmol/L處理組的ROS含量分別為空白對(duì)照組的（1.41±0.17）倍、（1.81±0.18）倍和（2.19±0.18）倍。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，貝母素甲可誘導(dǎo)細(xì)胞ROS含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性。采用ROS清除劑NAC預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后再添加貝母素甲（400 μmol/L）處理，K562細(xì)胞ROS含量與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而與貝母素甲（400 μmol/L）處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示貝母素甲誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的增加受到NAC抑制。提示貝母素甲可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞ROS的生成。見圖1。

2.3 貝母素甲可引起K562細(xì)胞GSH含量的下降

研究結(jié)果表明，貝母素甲可以引起K562細(xì)胞內(nèi)GSH含量的顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。100、200、400 μmol/L貝母素甲處理可分別使GSH含量下降至空白對(duì)照組GSH含量的（72.01±9.15）%、（64.60±5.29）%和（50.89±3.34）%，具有量效關(guān)系。這提示貝母素甲可能抑制K562細(xì)胞內(nèi)GSH生成或促進(jìn)其消耗，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GSH含量。見圖2。

2.4 氧化-還原狀態(tài)的失衡參與貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制

結(jié)果顯示，NAC或GSH能有效逆轉(zhuǎn)貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制。利用NAC清除過多的ROS或是直接補(bǔ)充GSH，可避免細(xì)胞內(nèi)氧化-還原狀態(tài)的失衡。這提示氧化-還原狀態(tài)的失衡在貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制過程中起重要作用。見表2。

3 討論

浙貝母是臨床上常用的化痰藥物，具有清熱化痰，開郁散結(jié)之功效。其中主要活性成分之一貝母素甲的抗腫瘤作用頗受關(guān)注[18]。胡凱文等[7]率先報(bào)道貝母素甲對(duì)人白血病細(xì)胞K562具有體外抑制細(xì)胞增殖的作用。本研究亦證實(shí)貝母素甲可抑制K562細(xì)胞增殖與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

細(xì)胞內(nèi)正常的氧化-還原狀態(tài)是其生命活動(dòng)所必需的。細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生或抗氧化防護(hù)系統(tǒng)（如GSH）功能的下降，可導(dǎo)致氧化-還原狀態(tài)的失常，造成細(xì)胞氧化損傷乃至死亡。一些抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)K562細(xì)胞大量產(chǎn)生ROS，下調(diào)GSH含量，改變細(xì)胞的氧化-還原狀態(tài)，從而抑制K562細(xì)胞增殖，殺傷細(xì)胞[10，14，19]。GSH是細(xì)胞內(nèi)的一種重要抗氧化肽。有證據(jù)表明，細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化與某些藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用相關(guān)。鄭智等[20]報(bào)道復(fù)方浙貝母顆粒協(xié)同阿霉素可降低人白血病細(xì)胞移植瘤組織細(xì)胞中GSH含量，抑制抗氧化酶的表達(dá)，提高難治耐藥性白血病臨床緩解率。本研究結(jié)果表明，貝母素甲處理可改變K562細(xì)胞的氧化-還原狀態(tài)，具體表現(xiàn)為貝母素甲處理引起K562細(xì)胞ROS水平上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量下降。這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化-還原狀態(tài)的失衡。在上述工作基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用ROS清除劑NAC（5 mmol/L）或GHS（5 mmol/L）預(yù)處理K562細(xì)胞1 h，再給予貝母素甲（400 μmol/L）干預(yù)24 h，隨后進(jìn)行MTT檢測(cè)，分析氧化-還原狀態(tài)失衡與貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)性。ROS清除劑NAC的預(yù)處理和GSH的補(bǔ)充幾乎完全消除了貝母素甲對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制。這些結(jié)果說明貝母素甲引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化-還原失衡可能是其抑制K562細(xì)胞增殖，具有體外細(xì)胞毒作用的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)貝母素甲能抑制K562細(xì)胞增殖。在這一過程中，貝母素甲調(diào)節(jié)了K562細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH含量，破壞其氧化-還原平衡?；钚匝跚宄齽㎞AC和GSH的處理能抑制貝母素甲的上述效應(yīng)，提示氧化-還原狀態(tài)影響貝母素甲對(duì)人白血病細(xì)胞K562增殖的抑制作用。

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