扁咽口服液抗炎及其對急性咽炎模型大鼠治療作用的實驗研究

馬建麗，李 翔，黎春彤，劉 茜，蔣 偉，梁 璐，樸晉華

扁咽口服液抗炎及其對急性咽炎模型大鼠治療作用的實驗研究

馬建麗1，李 翔1，黎春彤1，劉 茜1，蔣 偉1，梁 璐2，樸晉華3*

目的 觀察評價扁咽口服液的抗炎作用，并考察其對急性咽炎的治療作用和對常見呼吸道病原菌的抑菌活性。方法 運用小鼠耳廓腫脹實驗、大鼠足腫脹實驗和小鼠腹腔白細胞游走實驗，評價扁咽口服液的抗炎作用；并采用大鼠急性咽炎模型，觀察扁咽口服液的治療作用；采用平皿法測定扁咽口服液對常見呼吸道病原菌的最低抑菌濃度。結果 扁咽口服液可顯著降低二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹度，減輕角叉菜膠所致大鼠的足腫脹(P<0.05或P<0.01)；扁咽口服液高、中劑量顯著降低羧甲基纖維素鈉致小鼠腹腔白細胞游走(P<0.05)；扁咽口服液可減輕急性咽炎模型大鼠咽部黏膜的炎癥表現(xiàn)，緩解急性咽炎癥狀，并且隨著藥物劑量的增加，其抗炎作用和對咽部黏膜的改善作用均增強。扁咽口服液對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌均較為敏感，其最小抑菌濃度分別為56、28、56、28、14 mg/mL。結論 扁咽口服液具有良好的抗炎作用，對急性咽炎有明顯的療效。

扁咽口服液；急性咽炎；抗炎

0 引言

扁咽口服液是我院獨立研制的中藥復方制劑，已收入《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》2015版[1]，由板藍根、桔梗、西青果、山豆根、大青葉、穿心蓮、大黃、蒲公英、紫蘇葉、紫花地丁、黃芩、黃連、玄參、連翹、生石膏、薄荷腦、冰片共17味藥材組成，具有清熱解毒，排膿利咽，滋陰生津的功效，臨床上適用于急、慢性咽炎、扁桃體發(fā)炎等癥[2-3]。扁咽口服液臨床應用多年，本課題組前期收集了大量的臨床數(shù)據(jù)，并報道了其治療急性咽炎的療效，但扁咽口服液的抗炎效果、作用機制和物質(zhì)基礎尚未明確，因此,本研究開展了扁咽口服液對抗急性炎癥的評價，建立大鼠急性咽炎模型，考察其對抗急性咽炎的效果，并針對呼吸道細菌開展體外抑菌實驗，評價其從根源上對抗咽炎的效果[4]。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SPX-250-Z型生化培養(yǎng)箱；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器；生物安全柜；無菌操作臺；BX53雙目生物顯微鏡；電子臺秤；AL204電子天平；打孔器；TU-1901紫外-可見分光光度計；一次性滅菌手術器械、滅菌注射器、醫(yī)用額鏡、壓舌板、軟尺等。

1.2 試藥 扁咽口服液：本院制劑室生產(chǎn)，每毫升含生藥0.56 g，批號：160104；腸溶阿司匹林片：拜耳醫(yī)藥，批號：BJ03384；注射用氨芐西林鈉：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：20151215。

二甲苯：天津市化學試劑三廠，批號：160205；角叉菜膠，SIDMA公司，批號：160203；戊巴比妥鈉：德國產(chǎn)，科昊生物工程有限責任公司分裝，批號：69020100。

1.3 實驗動物與標準菌株、培養(yǎng)基 昆明種小鼠(20±2)g，雌雄各半，SPF級，中國藥品生物制品檢定所實驗動物資源中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(京)2014-0017。SD大鼠(200±20)g，雌雄各半，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(晉)2014-0001。

肺炎鏈球菌(蘇聯(lián)國家鑒定所)31001、肺炎克雷伯菌ATCC46117、乙型溶血性鏈球菌CMCC(B)32210、金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922購自中國藥品生物制品檢定所。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(150128)、普通瓊脂培養(yǎng)基(150226)、血瓊脂基礎培養(yǎng)基(141016)均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 實驗方法

2.1 扁咽口服液對抗急性炎癥作用

2.1.1 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 取昆明種小鼠50只，雌、雄各半，隨機分為5組，每組10只，分別為A組～E組，其中A組給予生理鹽水，B、C、D組給予扁咽口服液，E組給予阿司匹林，給藥方式為灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后，以二甲苯試劑50 μL/只給小鼠右耳致腫脹，30 min后，將小鼠脫頸椎處死，取雙耳相同位置內(nèi)徑8 mm打孔，稱重計算腫脹度(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)和腫脹抑制率[腫脹抑制率=(陰性對照組腫脹度-用藥組腫脹度)/陰性對照組腫脹度]，結果見表1。

2.1.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗 取SD大鼠，分組方法及給藥情況同上，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d。末次給藥30 min后，以角叉菜膠0.1 mL/只在每只鼠右后足跖部皮下注射，致炎前后不同時間點測量踝關節(jié)周長，每隔1 h測量1次，共測5次，計算腫脹率[(致炎后踝關節(jié)周長-致炎前踝關節(jié)周長)/致炎后踝關節(jié)周長]，結果見表1。

2.1.3 大鼠羧甲基纖維素囊袋實驗 取SD大鼠，分組方法及給藥情況同上，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)3 d。實驗方法見文獻[5]。

2.2 扁咽口服液對實驗性急性咽炎模型大鼠的治療作用

2.2.1 急性咽炎造模 按照文獻方法[6]，從凍干瓶中復蘇乙型溶血性鏈球菌，劃線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37 ℃培養(yǎng)，24 h后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中(加入5%～10%的無菌脫纖維兔血)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用0.9%生理鹽水將菌落洗脫，稀釋菌液，目標濃度為含菌量108～109cfu/mL，至4 ℃冰箱中備用。選擇SD大鼠48只，體重(200±20)g，雌雄各半，隨機分組，每組8只，分別為：空白對照組，模型組，扁咽口服液高、中、低劑量組及陽性對照組。除正常對照組外，其余5組造模。造模組按照文獻方法[6]，給SD大鼠注射乙型溶血性鏈球菌(含菌量108～109cfu/mL)。已感染大鼠按常規(guī)飼養(yǎng)24 h后，第2次給予大鼠咽部黏膜乙型溶血性鏈球菌細菌感染。

2.2.2 給藥及標本采集與處理 造模后第4天起，按照《中藥藥理實驗方法學》中的人與動物用藥劑量換算方法[7]，扁咽口服液給藥劑量分別確定7.51、3.76、1.86 g/kg(相當于臨床等效量的20、10、5倍)，陽性對照組給藥劑量為0.6 g/kg氨芐西林鈉，正常組給等容量的滅菌水，給藥方式均為灌胃，連續(xù)給藥5 d。觀察動物的一般情況。

模型對照組，在造模第4天，用戊巴比妥鈉溶液經(jīng)腹腔注射麻醉，處死，摘取咽部黏膜以及黏膜下組織，10%福爾馬林溶液固定，切片，分別進行HE染色和免疫組化實驗。陽性對照組，扁咽口服液高、中、低劑量組均于給藥第5天后處死，同法取咽部組織。咽部黏膜組織經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察。

2.3 扁咽口服液抑菌試驗

2.3.1 試驗菌準備 取復蘇的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物接種至中國蘭平板，37 ℃再孵育24 h，取復蘇的乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌同法接種至血平板；分別取上述各菌24 h培養(yǎng)菌落，用麥氏比濁法調(diào)制108/mL,稀釋至105/mL作為工作液。

2.3.2 藥物制備 扁咽口服液用0.22 μm微孔濾膜過濾，以倍比稀釋法稀釋藥液濃度至1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。分別取上述溶液1 mL加培養(yǎng)基9 mL加入直徑為7 cm傾注平皿制成平板，肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌用培養(yǎng)基在HM培養(yǎng)基中加入5%的脫纖維羊血，制成血瓊脂培養(yǎng)基。平皿含藥液濃度為56、28、14、8、4 mg/mL。

2.3.3 最小抑菌濃度檢測 克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液20 μL涂布于平皿瓊脂上，肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌菌懸液涂布于血瓊脂培養(yǎng)基，同時用原液制成平板不接種任何菌作為陰性對照。37 ℃孵育18～24 h，檢查有無細菌生長。

3 結果

3.1 扁咽口服液對抗急性炎癥作用

3.1.1 扁咽口服液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制 扁咽口服液不同劑量組和陽性藥對照組均可抑制二甲苯導致的小鼠耳廓腫脹，其中中、高劑量組和陽性對照組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著劑量的增加，其抑制率顯著提高，結果見表1。

表1 扁咽口服液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用 (n=10)

注：與A組比較,*P<0.05，**P<0.01

3.1.2 扁咽口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的抑制 給予角叉菜膠后，大鼠的足趾腫脹明顯增加，并隨著時間延長而持續(xù)增加，至3 h達到最高值48.81%。而不同劑量的扁咽口服液和陽性對照藥對大鼠足腫脹均有抑制作用，其中高劑量組與陽性藥作用接近，在1～5 h內(nèi)與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中劑量組在1 h和2 h時比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在3～5 h時比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；低劑量組僅在3 h與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。我們發(fā)現(xiàn)扁咽口服液和陽性藥組的腫脹得到抑制，并且炎癥反應時間與空白組相比延后1 h。結果見表2。

表2 扁咽口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的抑制作用(n=10)

注：與A組比較,*P<0.05，**P<0.01

3.1.3 扁咽口服液對羧甲基纖維素鈉所致大鼠腹腔白細胞游走的抑制 試驗結果表明，阿司匹林和扁咽口服液中、高劑量組均能夠抑制局部注射羧甲基纖維素后引起的白細胞游走，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表3。

表3 扁咽口服液對羧甲基纖維素鈉所致大鼠腹腔白細胞 游走的抑制作用(n=10)

注：與A組比較,*P<0.05

3.2 扁咽口服液對實驗性急性咽炎模型大鼠的治療作用

3.2.1 一般狀態(tài)觀察 32只造模后SD大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳、頻飲水、納食少、體重下降等癥狀，在分別給予陽性藥及扁咽口服液高、中、低劑量后，上述癥狀有所緩解，空白對照組無上述癥狀。

3.2.2 咽部組織病理形態(tài)學觀察 空白組黏膜及黏膜下層間質(zhì)結構清晰，上皮表層可見角化，可見巢狀分布的黏液腺體，細胞無病變。與空白對照組相比，模型組上皮角化明顯，固有層內(nèi)可見大量炎癥浸潤伴水腫，病變累及黏膜、黏膜下層、黏膜下層黏膜腺體周圍及橫紋肌間質(zhì)，小血管擴張充血。扁咽口服液給藥組和陽性給藥組能有效改善造模后大鼠咽部黏膜組織的炎細胞浸潤，固有層充血、腺體的肥大、上皮增生等癥狀，中性粒細胞顯著減少，可見少量淋巴細胞浸潤，血管擴展不明顯。扁咽口服液高劑量組炎性細胞減少顯著，與陽性給藥組效果基本相同，較低劑量組改善效果明顯(見圖1)。

圖1 扁咽口服液治療急性咽炎模型大鼠咽部粘膜組織病理改變

3.3 扁咽口服液抑菌試驗 扁咽口服液對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌較為敏感，其最小抑菌濃度分別為56、28、56、28、14 mg/mL，見表4。

表4 扁咽口服液抑菌試驗結果

4 討論

扁咽口服液基于中醫(yī)理論治療風熱邪毒侵襲所致的“喉弊”，以連翹、板藍根為君，清熱解毒；大黃、玄參為臣，通便滋肺腎陰；佐以山豆根、大青葉，清熱利咽，對癥治療；并以桔梗為舟楫之藥，載藥上行。扁咽口服液有著深厚的中醫(yī)辨證理論指導，臨床應用基礎扎實，可作為中成藥治療急性咽炎的典型代表。

本文系統(tǒng)地評價了扁咽口服液對抗急性炎癥的效果，采用小鼠耳腫脹和大鼠足腫脹兩個模型，驗證其對抗以充血和脹大為特點的炎癥第一時相反應；采用大鼠腹腔白細胞游走試驗，驗證了其對抗以浸潤和白細胞游走為特點的炎癥第二時相反應[8]。試驗結果表明，扁咽口服液中、高劑量組和陽性對照組，抗炎效果均顯著，炎癥的發(fā)展程度受到抑制，炎癥的發(fā)作進度有所延緩。

基于扁咽口服液對急性炎癥的影響，本試驗進一步開展了對急性咽炎大鼠模型治療作用的考察。課題前期對急性咽炎模型進行探討，并建立了采用給大鼠咽部黏膜注射臨床最易引起上呼吸道感染、引發(fā)咽喉炎和扁桃體炎的致病力較強的病原菌-乙型溶血性鏈球菌的方式造模[9-10]，本研究所采用的造模方法更接近咽炎的臨床發(fā)病機制，模型大鼠與臨床急性咽炎癥狀更相近，因此在繼續(xù)試驗中，我們依然采用本模型。

急性炎癥大多是由病原菌引起的，對抗炎癥治療僅僅是對癥治療，抑制病原菌才能從根本上治愈急性咽炎。因此，本實驗進一步開展了扁咽口服液的抑菌試驗，由試驗結果可見，扁咽口服液對呼吸道常見菌-金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌有不同程度的抑制作用。

本研究系統(tǒng)評價了扁咽口服液對抗急性咽炎的療效，結果顯示，中、高劑量扁咽口服液明顯改善了局部的炎癥反應，體外抑菌試驗結果亦表明，扁咽口服液對呼吸道常見的病原菌均有一定的抑制作用，這可能是其能夠改善急性咽炎，防止急性咽炎惡化甚至轉為慢性咽炎的原因之一。但其調(diào)節(jié)炎癥反應的具體分子基礎和對炎癥因子的調(diào)節(jié)作用尚未明確，這將成為我們下一步實驗的重點。

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Anti-inflammatory effect of Bianyan oral solution and its treatment of acute pharyngitis in rat model

MA Jian-li1,LI Xiang1,LI Chun-tong1,LIU Qian1,JIANG Wei1,LIANG Lu2,PIAO Jin-hua3*

(1.First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;2.Shanxi Cardiovascular Hospital,Taiyuan 030024,China;3.Shanxi Institute for Food and Drug Control,Taiyuan 030001,China)

Objective To observe and evaluate the anti-inflammatory effect of Bianyan oral solution,explore its treatment effect on acute pharyngitis and test the bacteriostasis in common respiratory pathogenic bacteriainvitro.Methods The anti-inflammatory effects of Bianyan oral solution was evaluated by the auricle swelling experiments in mouse,the swelling experiments of rats′ feet and the abdominal leukocyte migration experiments in mouse.The treatment effect of Bianyan oral solution on acute pharyngitis was observed by using the rat model of acute pharyngitis.The minimum inhibitory concentration of Bianyan oral solution against common respiratory pathogenic bacteria was tested by plating method. Results Bianyan oral solution significantly reduced the auricle swelling caused by xylene in mouse and feet swelling caused by carrageen glue of rats (P<0.05 orP<0.01).High-dose and mid-dose of Bianyan oral solution significantly reduced the abdominal leukocyte migration caused by sodium carboxymethyl cellulose of mouse (P<0.05).Bianyan Oral Solution could alleviate the inflammatory reaction of pharyngeal mucosa in acute pharyngitis rats and remit symptoms of acute pharyngitis.Anti-inflammatory effects and improvement of pharyngeal mucosa were enhanced while the dosage of Bianyan oral solution was increased.Bianyan oral solution showed good sensitivity to the selected five bacteria,includingStaphylococcusaureus,Streptococcuspneumonia,Escherichiacoli,Klebsiellapneumoniastreptococcusandbetahemolyticstreptococcus,with the minimum inhibitory concentration at 56,28,56,28,and 14 mg/mL,respectively. Conclusion Bianyan oral solution shows good anti-inflammatory effects and obvious curative effects on acute pharyngitis.

Bianyan oral solution;Acute pharyngitis;Anti-inflammatory

2017-01-17

1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100048，2.山西省心血管病醫(yī)院，太原 030024，3.山西省食品藥品檢驗所，太原 030001

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707004