膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理取材方式-七分法取材

俞 磊，漆松濤，易國仲，李志勇

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510515

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理取材方式-七分法取材

俞 磊，漆松濤，易國仲，李志勇

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510515

目的規(guī)范膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的病理取材方式，為臨床提供更為準(zhǔn)確的病理信息。方法我們規(guī)范GBM病理取材方式為“七分法取材”，即由術(shù)者在術(shù)中對GBM瘤塊的“中心、前方、后方、內(nèi)測、外側(cè)、上方、下方”共7個位置進(jìn)行取材。本研究共納入了40例經(jīng)“七分法取材”的GBM患者，我們分別對各個位置取材的腫瘤組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化檢測7個位置取材組織的IDH1蛋白、MGMT蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果腫瘤中心取材的腫瘤組織100%培養(yǎng)出了腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形、遷移快、增殖較塊；T1增強像以外其他位置取材的腫瘤組織原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率為60%，細(xì)胞呈圓鈍形、遷移慢、增殖慢，兩種細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞學(xué)功能上存在明顯差異。IDH1蛋白在7個位置表達(dá)情況存在差異的病例為10例，比例為25%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）； MGMT蛋白在7個位置表達(dá)存在差異的病例為12例，占比為30%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。結(jié)論7個位置取材的組織中均可培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞，并且IDH1及MGMT蛋白的表達(dá)也存在差異。中心取材的腫瘤組織雖能準(zhǔn)確反映腫瘤的病理學(xué)級別，但是考慮到GBM高度異質(zhì)性故需綜合考慮其他位置取材的組織病理及分子病理特征，才能更準(zhǔn)確地反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)特性。故七分法取材較傳統(tǒng)的病理取材對GBM的病理診斷更有指導(dǎo)意義。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；七分法取材；病理診斷

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）極強的侵襲性和極大的異質(zhì)性是直接導(dǎo)致GBM患者預(yù)后差的重要原因[1-2]。由于GBM具備極強的侵襲性，與周邊正常腦組織不存在明顯的界限，再加上多數(shù)情況下腫瘤位于功能區(qū)或者靠近功能區(qū)，故術(shù)后腫瘤細(xì)胞的殘余在所難免，這就注定了腫瘤復(fù)發(fā)[3-4]。早在2011年就曾提出南方膠質(zhì)瘤中心的膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的理念[5]。GBM亦是一個異質(zhì)性極強的惡性腫瘤[6-7]。故傳統(tǒng)的病理取材不可能代表腫瘤整體的生物學(xué)特性，故要求術(shù)者在術(shù)中應(yīng)該多點取材，并且將取材位置在影像片上標(biāo)記（甚至在導(dǎo)航輔助下），而不只是將腫瘤標(biāo)本切下來后交給病理科醫(yī)生按經(jīng)驗取材。

隨著新版的WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分型的推出，分子病理學(xué)診斷顯得越來越重要，如異檸檬酸脫氫酶（IDH1）、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、EGFR等蛋白的表達(dá)情況，能夠提示GBM患者的預(yù)后情況，或可指導(dǎo)臨床上的治療選擇（如靶向藥物選擇等）[8-9]。由于GBM存在的顯著腫瘤異質(zhì)性，到底哪一部分腫瘤組織能夠為我們臨床提供最為準(zhǔn)確病理信息呢？傳統(tǒng)的病理取材結(jié)果是否不夠全面？為此，我們提出由神經(jīng)外科醫(yī)生在術(shù)中進(jìn)行“七分法取材”的方法，旨在能夠得到更為精確的腫瘤病理信息，為臨床治療提供依據(jù)以及方向。

1 資料與方法

1.1 “七分法取材”方法

術(shù)中進(jìn)行腫瘤組織塊的切除與取材，取材主要為腫瘤中心區(qū)域以及腫瘤外周區(qū)域（圖1），腫瘤中心區(qū)域取材1個點，編號：（1）腫瘤中心；腫瘤外周區(qū)域取材6個位置，分別編號為：（2）正前方；（3）正后方；（4）正內(nèi)測；（5）正外側(cè)；（6）正上方；（7）正下方。取材依據(jù)如下原則：以人體自然立位時約定前后、上下，靠近中線側(cè)為內(nèi)，反之為外；如有個別為中心性雙側(cè)占位時，以占位病變體積小者一側(cè)為內(nèi)，體積大者一側(cè)為外；對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的“Q、S、T、P”4種不同切除方式所切除的瘤塊（切除分型：Q型切除指將MRI T1增強、T2、FLAIR異常信號區(qū)域全切除；S型切除指將MRI T1增強信號區(qū)域全切除，T2/FLAIR部分殘留；T型全切除指將MRI T1增強信號區(qū)域全切除，而T2/FLAIR較術(shù)前可無明顯變化；P型切除指MRI T1增強信號區(qū)域仍有明顯殘存[10]），腫瘤中心區(qū)域取材一般為T1增強區(qū)域（若中心為壞死組織，則取壞死周邊、離幾何中心最近的部位，若中心為囊變，則取囊變內(nèi)的實性成分）；周邊區(qū)域取材盡量靠近T2/Flair像的邊緣處（Q、S型切除）以及T1增強像的邊緣（T/P型切除）。總共有40例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行了“七分法取材”，每個位置取材的組織又分為3部分：一部分用于送檢病理診斷；一部分用于原代細(xì)胞培養(yǎng)；一部分作為凍存標(biāo)本組織。病理組織應(yīng)用于科學(xué)研究，患者均已知情并同意。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤“七分法取材”示意圖

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)

我們對40例GBM“七分法取材”的腫瘤組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)過程均在超凈工作臺中進(jìn)行，將術(shù)中“七分法取材”的腫瘤組織用PBS洗凈血液、燒灼的壞死組織等，用剪刀將組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，用0.25%的胰酶消化5～10 min后，1000 r/min離心3 min，將離心沉淀用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，鋪于10 cm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.3 免疫組化

利用免疫組化的方法，檢測“七分法取材”的7個位置腫瘤組織的IDH1及MGMT蛋白的表達(dá)情況。免疫組化使用的抗體為：IDH1（ZM-0447，中杉金橋，稀釋比例：1:50）；MGMT（A0693，Abclonal，稀釋比例：1:100）；二抗購自Abcam。采用DAB顯色液控制顯色，隨機取5個高倍鏡（400×）視野進(jìn)行觀察。依據(jù)表達(dá)強弱、陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分，并由此判斷陽性、陰性表達(dá)。評分方法為：（1）表達(dá)強弱判斷（陰性表達(dá)0分，淺黃色1分，深黃色2分，棕色3分）；（2）陽性細(xì)胞百分比（0%為0分；1%～10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；大于80%為4分）；最終得分為兩項評分的乘積，以≥4分為陽性表達(dá)[9]。對“七分法取材”的7個不同位置的組化結(jié)果，若七個位置的組化結(jié)果存在不同，則記為差異病例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對組化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，分析方法為：配對四格表資料一致性檢驗，Kappa系數(shù)＞0.75為一致性良好，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

在40例進(jìn)行“七分法取材”的GBM組織中，腫瘤中心取材的組織原代培養(yǎng)成功40例，成功率100%；腫瘤周邊區(qū)域6個位置取材的腫瘤組織，只要有1個位置的組織培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞即視為成功，此組原代培養(yǎng)成功24例，培養(yǎng)成功率為60%。對于“Q”、“S”型切除后的取材，腫瘤中心培養(yǎng)出的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，具有很長的細(xì)胞偽足，能在較短的時間內(nèi)從組織塊中爬出，細(xì)胞遷移能力強、增殖快（圖2A）；從腫瘤周邊區(qū)域（取材于T2/FLAIR異常區(qū)域）培養(yǎng)出的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，無明顯細(xì)胞偽足，增殖明顯慢于腫瘤中心區(qū)域培養(yǎng)出的細(xì)胞（圖2B）。

圖2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不同位置取材的腫瘤組織原代培養(yǎng)的情況（×400）

2.2 HE染色結(jié)果

腫瘤正中心取材的腫瘤組織，HE染色可以見明顯的血管生成、高密度的異型腫瘤細(xì)胞、核分裂像多見，呈典型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的表現(xiàn)；取材于外周T2/FLAIR異常區(qū)域的其他6個位置的腫瘤組織，HE染色可見腫瘤細(xì)胞散在分布、基本無新生血管，呈現(xiàn)低級別膠質(zhì)瘤的病理表現(xiàn)（圖3）。

圖3 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不同位置取材的腫瘤組織（HE染色，×400）

2.3 免疫組化結(jié)果

對40例進(jìn)行“七分法取材”的GBM中心及外周區(qū)域共7個位置進(jìn)行IDH1及MGMT蛋白的免疫組化，只要外周區(qū)域取材的6個位置中有1個與中心區(qū)域組化結(jié)果不一樣，即記為差異病例。對于IDH1蛋白，差異病例數(shù)為10例，比例為25%，一致性檢驗Kappa系數(shù)為0.5，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，圖4A、B）。對于MGMT蛋白，差異病例為12例，占比為30%，一致性檢驗結(jié)果Kappa系數(shù)為0.417，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004，圖4C、D）。

圖4 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不同位置取材的腫瘤組織IDH1、MGMT免疫組化結(jié)果（DAB染色，×400）

3 討論

GBM是由不同分化群瘤細(xì)胞組成的異質(zhì)性腫瘤，在一個瘤體之內(nèi)可能含有起源于多種細(xì)胞的腫瘤組織成分，同時具備極高的侵襲性，能夠沿著白質(zhì)纖維束、血管等遷移至離腫瘤中心很遠(yuǎn)的區(qū)域[3,4,7,11-14]?；谑瑱z及歷史上的手術(shù)活檢，腫瘤細(xì)胞可以在影像學(xué)異常范圍外很遠(yuǎn)的地方出現(xiàn)。腫瘤基因組的不穩(wěn)定性、腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和廣泛浸潤性決定了GBM的治療充滿了挑戰(zhàn)。不可否認(rèn)，手術(shù)切除程度是影響GBM患者預(yù)后的一個關(guān)鍵因素，統(tǒng)計南方醫(yī)院神經(jīng)外科收治的經(jīng)“Q型切除”輔以術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)放化療的GBM患者，其中位生存期超過國際上報道的14.6個月[15]。遺憾的是，即便GBM患者進(jìn)行了最為積極的治療，雖然一小部分患者可以長期生存[16-18]，但GBM患者的總體預(yù)后仍然較差。實際上腫瘤的異質(zhì)性對手術(shù)后的綜合治療失敗具有決定性影響。GBM不僅具有時間異質(zhì)性（即不同的時間可能腫瘤的基因型差異亦不同），還具有空間異質(zhì)性。故針對某一特定區(qū)域基因突變的靶向治療是不合適的，然而常規(guī)的病理取材（往往只是某一特定區(qū)域）并不能對腫瘤所有部位進(jìn)行取材及驗證突變。這就要求我們探索出一種符合腫瘤異質(zhì)性的規(guī)律的病理取材方法。

本研究中，我們對取材于GBM瘤體不同區(qū)域的組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，在腫瘤周邊區(qū)域（T2/FLAIR異常區(qū)域與正常MRI影像交界區(qū)）取材的組織培養(yǎng)出了腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)成功率為60%，這也驗證了GBM細(xì)胞具有高侵襲性的特性；同時，取材于中心區(qū)域和周邊區(qū)域所培養(yǎng)出的腫瘤細(xì)胞，無論是在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生物學(xué)功能上都存在極大的差異，這也證明了GBM所存在的腫瘤異質(zhì)性。IDH1突變型蛋白的陽性表達(dá)以及MGMT蛋白的陰性表達(dá)均是GBM患者預(yù)后良好的標(biāo)志，然而，我們同時對取材于不同區(qū)域的腫瘤組織進(jìn)行IDH1、MGMT蛋白的免疫組化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：40例GBM患者中，有10例患者IDH1蛋白存在表達(dá)差異，12例患者M(jìn)GMT蛋白表達(dá)存在差異，進(jìn)一步證明了GBM瘤體存在極大的異質(zhì)性。

既然GBM具有極強的異質(zhì)性那么到底哪部分腫瘤組織真正代表了腫瘤的生物學(xué)特性？結(jié)合文獻(xiàn)分析，我們認(rèn)為腫瘤周邊區(qū)域取材的組織更加具有代表性。GBM影像學(xué)和病理組織學(xué)顯示正常的區(qū)域中亦能培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞[14]，這一部分手術(shù)無法切除和被放療忽視的腫瘤細(xì)胞很可能就是腫瘤復(fù)發(fā)的真正根源，應(yīng)該是GBM患者治療的靶細(xì)胞[12]。近些年來文獻(xiàn)中一直強調(diào)的“Peritumoral Zone”[3]。從理論上講，腫瘤組織周邊區(qū)域在物理距離上離殘腔周邊的腫瘤細(xì)胞更近，更能代表這群殘余細(xì)胞的生物學(xué)特性。這也要求外科醫(yī)生在手術(shù)切除時注重完整整塊手術(shù)切除方式和腦溝、腦池等重要解剖結(jié)構(gòu)的辨認(rèn)，必要時可以在導(dǎo)航下取材，只有這樣才能保證腫瘤取材時在空間位置上的定位準(zhǔn)確。

選擇七分法主要原因是：對七分法取材的組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤中心取材的組織存在更為豐富的血管，腫瘤細(xì)胞密度、異型性亦甚于周邊區(qū)域取材的組織，因此在腫瘤中心區(qū)域取材，用于病理判斷腫瘤的組織學(xué)級別更為確切，也有利于和現(xiàn)有的文獻(xiàn)結(jié)果相比較；對周邊區(qū)域取材的腫瘤組織進(jìn)行分子病理學(xué)的檢測，其檢測結(jié)果更能代表術(shù)后殘存的腫瘤細(xì)胞，對判斷術(shù)后GBM患者的預(yù)后及治療選擇更有科學(xué)；考慮取材的簡便與可行性，我們選擇在上下、前后、內(nèi)外側(cè)總共3個維度、6個位置上進(jìn)行取材。結(jié)合術(shù)前影像學(xué)資料、術(shù)中神經(jīng)導(dǎo)航、術(shù)中術(shù)者切除腫瘤時的手感等等，神經(jīng)外科醫(yī)生能夠精確的對腫瘤的任何部位進(jìn)行取材，這種優(yōu)勢是傳統(tǒng)取材方法所不具備的。因此我們提出GBM的“七分法取材”的方式，通過神經(jīng)外科醫(yī)生在術(shù)中對GBM各個區(qū)域進(jìn)行取材，從而使得術(shù)后的病理結(jié)果更為完善、真實的反應(yīng)患者的情況，為神經(jīng)外科醫(yī)生的臨床決策提供更為準(zhǔn)確的信息。除了一部分WHO I級的膠質(zhì)瘤外，所有的膠質(zhì)瘤均遵循“七分法”病理取材的原則，會為我們提供更多關(guān)于腫瘤的組織和分子病理信息，對臨床和科研均具有重要意義。

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Molecular and histopathological differences depending on different MRI findings and tumor location in Glioblastoma

YU Lei, QI Songtao, YI Guozhong, LI Zhiyong
Department of neurosurgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

ObjectiveTo normalize the pathological sampling and provide precise information for clinical doctors.MethodsWe normalized Seven-part sampling method as the standard method of pathological sampling.Seven samples from seven different directions of Glioblastoma (GBM) tumor (central, anterior, posterior, medial, lateral, superior, inferior) were obtained by neurosurgeon during surgery. Forty glioblastoma patients which had pathological samples through Seven-part Sampling Method were included. Primary tumor cells cultivation were conducted. The expressions of MGMT、IDH1 proteins were detected through IHC in these seven tumor samples.ResultsTumor cells were cultivated in 100% from tumor tissue which in center of GBM tumor successfully.The primary tumor cells were spindle-shape with a strong ability of migration and high rate of proliferation. Primary tumor cells were cultivated in other sites of GBM tumor with a successful rate of 60%. The cells were obtuse-shape with a slower ability of migration and rate of proliferation. The two kinds of primary cells were different of cell morphology and biology. The expressions of IDH1 protein IHC in 10 cases were significantly different (P=0.001). The expressions of MGMT protein in 12 cases were significantly different (P=0.004).ConclusionSeven sites in GBM tumor have tumor cells. The expressions of IDH1 and MGMT proteins are different. The tumor tissue obtained from central site of GBM tumor can reflect the pathological grade of tumor more accurately.The other 6 sites in peritumoral area can reflect the molecular pathology information of these residual tumor cells which cannot be removed by surgery. Seven-part sampling method is very important for pathological diagnosis of glioblastoma.

glioblastoma; seven-part sampling method; pathological diagnosis

2017-05-22

廣東省自然科學(xué)基金（2014A030310008）

俞 磊，主治醫(yī)師，E-mail: battikindy@163.com

漆松濤，E-mail: qisongtaonfyy@126.com