硫酸酯化牡蠣多糖對3種腫瘤細胞抑制及凋亡的影響

趙冠華,佟長青,李 偉,曲 敏

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

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硫酸酯化牡蠣多糖對3種腫瘤細胞抑制及凋亡的影響

趙冠華,佟長青,李 偉,曲 敏*

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

采用氯磺酸-吡啶法制備得到硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP),通過CCK-8法檢測其對人胃癌細胞AGS、人卵巢癌SK-OV-3細胞和人肝癌HepG2細胞活力的影響,并用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果表明,SCGP對3種腫瘤細胞細胞活力有不同程度的抑制效應(yīng),其中對AGS細胞抑制效應(yīng)最明顯。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,SCGP對AGS細胞有很明顯的促進凋亡作用。本研究結(jié)果表明SCGP對AGS腫瘤細胞生長有一定的抑制效應(yīng)。

牡蠣多糖,硫酸酯化,抗腫瘤,凋亡

牡蠣是全球最大養(yǎng)殖貝類,也是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣肉質(zhì)鮮美可口并且具有藥用價值,被稱為“海底牛奶”[1]。牡蠣多糖是牡蠣體內(nèi)重要的活性物質(zhì)之一,在抗腫瘤、抗疲勞、抗凝血和增強機體免疫等方面都具有較好的生物活性[2]。

將硫酸基團引入到多糖的羥基上使其生物活性發(fā)生強烈的變化,能使多糖表現(xiàn)出其修飾前所沒有的生物活性[3]。硫酸酯化多糖具有抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗凝血[6]、抗氧化[7]、增強免疫[8]等多種生物活性。其中其所具備的抗腫瘤能力更是引起廣泛的關(guān)注。但是硫酸酯化牡蠣多糖的抗腫瘤活性篩選研究并不多,楊靜峰[9]利用降解的硫酸酯化牡蠣多糖研究其對Hela細胞的影響,發(fā)現(xiàn)其對Hela細胞抑制作用并不明顯。高蒙蒙[10]研究了硫酸酯化牡蠣多糖對HL-60細胞和K562細胞有一定的抑制作用。其他硫酸多糖也大多具有抗腫瘤活性,Wang等[3]對硫酸酯化脫脂米糠多糖抑制HepG2細胞進行研究,其具有較強的癌細胞抑制作用。Karnjanapratum等[8]研究3種礁膜硫酸多糖發(fā)現(xiàn)它們對AGS細胞有細胞毒性作用。Zhang J[11]發(fā)現(xiàn)硫酸酯化黑靈芝多糖可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖。Wei[12]研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖經(jīng)硫酸酯化后,抑制BGC-823細胞和A549細胞能力顯著增強,并具有凋亡效果。Wang等[13]研究了硫酸化滸苔多糖抑制HepG2細胞可能的凋亡途徑。

本文對實驗室前期制備得到的粗牡蠣多糖[14]進行硫酸酯化修飾,制備硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP),以人胃癌細胞AGS、人卵巢癌細胞SK-OV-3和人肝癌細胞HepG2作為受試細胞,通過CCK-8法評價其抗腫瘤活性,流式細胞儀檢測細胞凋亡,以期為牡蠣的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗牡蠣多糖(CGP) 本實驗室前期制備所得;氯磺酸、吡啶、N,N-二甲基酰胺(DMF)、硫酸鉀(K2SO4)、三氯乙酸(TCA)、氯化鋇(BaCl2)、溴化鉀(KBr)、葡萄糖胺(Gln) 美國Sigma公司;胎牛血清(FBS) 美國Hyclone公司;DMEM高糖、F12K、青霉素/鏈霉素(P/S) 美國Gibco公司;CCK-8檢測試劑盒 日本Dojindo公司;凋亡檢測Annexin V-APC-PI Apoptosis Kit試劑盒 天津三箭生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純；人胃癌細胞AGS、人卵巢癌細胞SK-OV-3和人肝癌細胞HepG2 中國科學院上海細胞庫;AGS細胞和SK-OV-3細胞的培養(yǎng)基 F12K+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素/鏈霉素(P/S)+1%葡萄糖胺(Gln);HepG2細胞的培養(yǎng)基 DMEM高糖+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素/鏈霉素(P/S)+1%葡萄糖胺(Gln)。

660-IR紅外光譜儀 美國Agilent公司;MuLTiSJAN MK3酶標儀、Microcl 17R離心機 美國Thermo公司;MCO-15AC 型CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本SANYO公司;DMLLLED型倒置顯微鏡 德國Leica公司;Accuri C6流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硫酸酯化牡蠣多糖(SCGP)的制備 牡蠣多糖的硫酸酯化采用氯磺酸-吡啶法[9]。向放置在冰水浴中,并帶有冷凝攪拌裝置的250 mL三頸燒瓶中加入50 mL吡啶,充分攪拌后,緩慢加入10 mL氯磺酸,反應(yīng)40 min,制得酯化試劑備用。稱取2.0 g前期制備的粗牡蠣多糖,溶于40 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,充分攪拌后加入到裝有酯化試劑的三頸燒瓶中,60 ℃水浴,攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,加入20% NaOH溶液調(diào)至pH7.0。之后加入3倍體積的95%乙醇過夜,離心(8000 r/min,10 min)得沉淀。沉淀溶解于水中,透析3 d,真空冷凍干燥得到硫酸酯化修飾產(chǎn)物。

1.2.2 硫酸根含量的測定及紅外光譜(IR)分析 SCGP硫酸基含量的測定方法采用明膠-比濁法[15]。稱取樣品3 mg加入1 mL 1 mol/L鹽酸,100 ℃水解6 h,冷卻后揮發(fā)干燥,殘渣再用1 mL蒸餾水溶解。用硫酸鉀溶液制作標準曲線,以0.2 mL鹽酸溶液作為空白,分別加入三氯乙酸3.8 mL、氯化鋇-明膠溶液1.0 mL,室溫靜置15 min,OD360 nm測吸光值A(chǔ)1;以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液,同法測吸光值A(chǔ)2;以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標,縱坐標為吸光值(A1-A2)。

紅外光譜分析:將CGP和SCGP分別與KBr混合研磨,壓片后在4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描檢測,以KBr為掃描背景。

1.2.3 體外抑制腫瘤細胞增殖實驗 采用CCK-8法進行測定SCGP對AGS細胞等三種腫瘤細胞存活率的影響。

SCGP多糖溶解于PBS,配成10 mg/mL的母液,培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。將細胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中,AGS細胞鋪板密度為8000/孔,SK-OV-3細胞和HepG2細胞鋪板密度為6000/孔,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將SCGP加入細胞培養(yǎng)板中,使其終濃度分別為2、20、200 和1000 μg/mL,分別處理12、24、36、60 和84 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,混勻后培養(yǎng)箱中孵育2 h,以不含細胞、加入藥物的培養(yǎng)基作為空白組,測定450 nm處的OD值,按下列公式計算SCGP對細胞存活抑制率:

細胞存活抑制率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(空白組OD值-培養(yǎng)基OD值)×100

1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡 將細胞懸浮液接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,AGS細胞和HepG2細胞接種量為1×105/孔,SK-OV-3細胞接種量為8×104個/孔,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,加入SCGP至終濃度達到1000 μg/mL,空白組不做處理,溶劑組加入等體積PBS,繼續(xù)培養(yǎng)96 h后,收樣檢測。用EP管分別收集各孔中的培養(yǎng)上清,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集培養(yǎng)上清中的細胞。同時,用胰酶消化底面貼壁的細胞,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集細胞,與前面離心的細胞混合。PBS洗滌細胞2次,4 ℃ 1000 r/min 離心5 min,收集細胞。每個樣品用200 μL binding buffer重懸細胞,輕輕吹勻,加入藻藍蛋白(APC)混勻,再加入液體PI染液染色,20 ℃避光孵育20 min,上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCGP硫酸根含量及其紅外光譜(IR)結(jié)果

用明膠-比濁法測得SCGP硫酸根含量為28.96%,取代值(DS)為0.66。如圖1所示,牡蠣多糖CGP和SCGP的紅外光譜特征峰類似。與牡蠣多糖相比,SCGP在1257.35 cm-1處存在一個不同于牡蠣多糖的特征吸收峰,這個特征峰為>S=O伸縮振動峰,說明其發(fā)生了硫酸酯化反應(yīng)[16]。另外,SCGP在811 cm-1處有一強吸收,說明硫酸基取代的空間構(gòu)象是平伏型[17]。

圖1 牡蠣多糖CGP與SCGP紅外光譜Fig.1 IR spectra of CGP and SCGP

2.2 SCGP對3種腫瘤細胞活力的抑制作用

由圖2a可知,SCGP對AGS細胞具有一定的抑制效果,除培養(yǎng)時間60 h抑制效果較之前有所下降外,其他時間點均呈現(xiàn)一定的時間與劑量依賴性。低濃度(2、20 μg/mL)時,SCGP對AGS細胞活力的抑制活性不明顯,高濃度時抑制活性顯著。在濃度為1000 μg/mL,培養(yǎng)時間為84 h時,SCGP對AGS細胞的抑制率為48.99%。由圖2b可知,SCGP在短時間、低濃度時,對SK-OV-3細胞沒有明顯的抑制作用。當SCGP濃度為1000 μg/mL,隨著培養(yǎng)時間的增加,SK-OV-3抑制率逐漸提高,在培養(yǎng)時間36、60、84 h時,抑制率分別為13.03%、16.48%、24.10%。由圖2(c)可知,SCGP在低濃度時對HepG2細胞的生長具有促進作用,而SCGP濃度為1000 μg/mL,培養(yǎng)時間84 h時,抑制率為29.42%。

圖2 SCGP對3種腫瘤細胞抑制率的影響Fig.2 Effect of SCGP on the inhibition rates of three kinds of carcinoma cell

由上可知,SCGP主要對AGS腫瘤細胞具有一定程度的抑制效果。SCGP對AGS細胞的抑制作用明顯比對SK-OV-3細胞和HepG2細胞強,說明AGS細胞對其更加敏感。研究表明不同的多糖對AGS細胞、SK-OV-3細胞和HepG2細胞抑制可能為直接抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的入侵和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞內(nèi)信號傳遞途徑[18-21],推測SCGP可能對3種腫瘤細胞抑制機理有所不同。

2.3 流式細胞檢測結(jié)果

用Annexin-V和PI染色法,在流式細胞儀檢測的圖3中,可分為四類:Q1象限為壞死細胞,其細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不完整;Q2象限內(nèi)為凋亡晚期細胞,其細胞質(zhì)膜滲透受到損傷;Q3象限為凋亡早期細胞;Q4象限為正常活細胞。用Q2和Q3之和計算細胞凋亡率。由圖3可知,1000 μg/mL SCGP對AGS細胞處理96 h后,凋亡率從9.02%±0.39%上升到19.76%±0.27%(p<0.05),表明SCGP對AGS細胞有很明顯的促進凋亡作用。1000 μg/mL SCGP對SK-OV-3細胞處理96 h后,凋亡率從17.52%±1.37%降到9.74%±0.09%(p<0.05),表明SCGP對SK-OV-3細胞有很明顯的抑制凋亡的作用。而1000 μg/mL SCGP對HepG2細胞處理96 h后影響變化較小。

綜上所述,SCGP對腫瘤細胞具有一定的凋亡作用,尤其對AGS細胞具有明顯的凋亡誘導作用。SCGP對AGS細胞的凋亡作用明顯比對其他兩種腫瘤細胞的強,研究表明不同來源的多糖對AGS細胞、SK-OV-3細胞、HepG2細胞凋亡途徑可能為下調(diào)抗細胞凋亡Bcl-2和Bcl-xL基因表達、激活p53基因表達和細胞凋亡線粒體途徑、引起細胞色素C的釋放和活化Caspase誘導細胞凋亡[19,22-24]。本實驗通過CCK-8和流式細胞檢測共同證明SCGP使AGS細胞增殖活性受到了明顯抑制并能使細胞發(fā)生凋亡。

3 結(jié)論

腫瘤是威脅健康并且死亡率很高的疾病之一,研究表明含有硫酸基團的多糖有較好的抗腫瘤活性。本文用實驗室前期制備的粗牡蠣多糖,通過氯磺酸-吡啶法制備得到了硫酸酯化牡蠣多糖SCGP,對3種腫瘤細胞表現(xiàn)出一定的抑制活性和凋亡作用。在1000 μg/mL SCGP對AGS細胞和HepG2細胞處理96 h后,都顯現(xiàn)出凋亡作用。尤其是對AGS細胞的抑制、凋亡作用明顯,可進一步研究。而SCGP對人卵巢癌SK-OV-3細胞凋亡效果不顯著,反而起到抑制凋亡作用。

圖3 SCGP對3種腫瘤細胞凋亡的影響Fig.3 The effects of SCGP on apoptosis of three kinds of carcinoma cell line

正常的細胞增殖和細胞凋亡保持一種平衡狀態(tài),當細胞過度增殖或凋亡減少就可能導致腫瘤發(fā)生[25]。目前多糖抗腫瘤的主要途徑為抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡、細胞周期阻滯、抑制腫瘤細胞的入侵、黏附、轉(zhuǎn)移、增強機體免疫能力和影響腫瘤細胞信號傳導等[26]。SCGP的抗腫瘤作用機理尚不清楚。因為影響硫酸酯化多糖活性的因素很多,比如取代值(DS)、分子量、硫酸根取代位、空間結(jié)構(gòu)等,同時多糖分子量較大,不容易進入細胞內(nèi)部,加之機體對多糖的吸收、代謝和運輸效果都不佳,所以不易在細胞內(nèi)達到足夠的濃度[27]。隨著蛋白質(zhì)組學、代謝組學、分子生物學及科學技術(shù)的發(fā)展,在以后研究中,將對SCGP進行更加深入探討,明確抗腫瘤機制及構(gòu)效關(guān)系,為牡蠣多糖的開發(fā)利用提供參考。

[1]徐靜. 牡蠣提取物的降血糖活性研究[D].濟南:山東大學,2005.

[2]王俊,姚瀅,張建鵬. 牡蠣多糖的制備和生物活性研究[J].醫(yī)學研究生學報，2006,19(3):217-220.

[3]Wang L,Li X X. Chen Z X. Sulfated modification of the polysaccharides obtained from defatted rice bran and their antitumor activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2009,44(2):211-214.

[4]Ji C F,Ji Y B,Meng D Y. Sulfated modification and anti-tumor activity of laminarin[J]. Experimental and Therapeutic Medicine,2013,6(5):1259-1264.

[5]Ghosh T,Chattopadhyay K,Marschall M,et al. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides:from structure-activity analysis to clinical evaluation[J]. Glycobiology,2009,19(1):2-15.

[6]Liang W A,Mao X,Peng X H,et al. Effects of sulfate group in red seaweed polysaccharides on anticoagulant activity and cytotoxicity[J]. Carbohydrate Polymers,2014,101:776-785.

[7]Wang J L,Niu S F,Zhao B T,et al. Catalytic synthesis of sulfated polysaccharides.Ⅱ:Comparative studies of solution conformation and antioxidant activities[J]. Carbohydrate Polymers,2014,107(17):221-231.

[8]Karnjanapratum S,You S G. Molecular characteristics of sulfated polysaccharides from Monostroma nitidum and theirinvitroanticancer and immunomodulatory activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2011,48(2):311-318.

[9]楊靜峰. 基于牡蠣糖原硫酸酯結(jié)構(gòu)的多糖構(gòu)效關(guān)系研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學,2013.

[10]高蒙蒙. 太平洋牡蠣多糖的提取、分離、結(jié)構(gòu)及硫酸酯化修飾研究[D].青島:中國海洋大學,2014.

[11]Zhang J,Liu Y J,Park H S,et al. Antitumor activity of sulfated extracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum from the submerged fermentation broth[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87(2):1539-1544.

[12]Wei D F,Wei Y X,Cheng W D,et al. Sulfated modification,characterization and antitumor activities of Radix hedysari polysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(4):471-476.

[13]Wang X X,Chen Y,Wang J J,et al. Antitumor activity of a sulfated polysaccharide from Enteromorpha intestinalis targeted against hepatoma through mitochondrial pathway[J]. Tumor Biology,2014,35(2):1641-1647.

[14]馬慧慧. 牡蠣多糖的制備及其生物活性研究[D].大連:大連海洋大學,2015.

[15]Yang J F,Zhu B W,Zheng J,et al. Stimulation of lymphocyte proliferation by oyster glycogen sulfated at C-6 position[J]. Carbohydrate Polymers,2013,94(1):301-308.

[16]Lloyd AG,Dodgson KS,Price RG,et al. Infrared studies on sulphate esters. I. Polysaccharide sulphates[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,1961,46(1):108-115.

[17]Zvyagintseva TN,Shevchenko NM,Nazarova IV,et al.Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Pharmacology,Toxicology and Endocrinology,2000,126(3):209-215.

[18]Bao H,Choi W S,You S,et al. Effect of sulfated modification on the molecular characteristics and biological activities of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(4):1408-1414.

[19]Park H S,Kim G Y,Nam T J,et al. Antiproliferative activity of fucoidan was associated with the induction of apoptosis and autophagy in AGS human gastric cancer cells[J]. Journal of Food Science,2011,76(3):77-88.

[20]Chen D,Zhang X L,Du Y,et al. Effect of gecko sulfated polysaccharide-protein complex on the defective biorheological characters of dendritic cells under tumor microenvironment[J]. Cell Biochemistry and Biophysics,2012,62(1):193-201.

[21]Liu X,Yang Y,Zhang X,et al. Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract inhibits cell invasion by modulating transforming growth factor-β/Smad in HepG2 cell[J]. Journal of Gastroenterology Hepatology,2010,25(2):420-426.

[22]張杰,楊旭東,包?；?等.樺褐孔菌多糖誘導人卵巢癌細胞凋亡的研究[J].中國食用菌，2010(4):38-39.

[23]許娜,賴一鳴,陳曉潔,等.五味子多糖誘導SKOV3細胞凋亡及分子機制研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013,24(5):1165-1166.

[24]徐晉,吳麗,徐巧芳.靈芝多糖誘導人肝癌細胞HepG2凋亡的研究[J].中國當代醫(yī)藥，2009,16(23):7-9.

[25]高楓,符兆英.天然產(chǎn)物誘導腫瘤細胞凋亡作用機制的研究進展[J].中華腫瘤預防雜志，2011,18(7):557-560.

[26]林俊,李萍,陳靠山.近5年多糖抗腫瘤活性研究進展[J].中國中藥雜志，2013,38(8):1116-1125.

[27]盧可可,張月巧,袁婭,等.硫酸化修飾多糖抗腫瘤活性構(gòu)效關(guān)系及分子機制研究進展[J].食品科學，2014,35(23):297-302.

Effect of sulfated polysaccharide fromCrassostreagigason inhibition and induction of three kinds of carcinoma cell

ZHAO Guan-hua,TONG Chang-qing,LI Wei,QU Min*

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Sulfated polysaccharide fromCrassostreagigsa(SCGP)was derived by using the chlorosulfonic acid-pyridine method. The inhibitory effects of SCGP on AGS cells,SK-OV-3 cells,and HepG2 cells were evaluated using CCK-8 assay,and the apoptosis changes were analyzed by flow cytometry. The results showed that SCGP significantly inhibited the growth of three cell. The inhibitory effect of SCGP was better on AGS cells than other cells. The flow cytometry results showed that SCGP could effectively induce the apoptosis of AGS cells. The results suggest that SCGP has inhibitory effect on growth of AGS cells.

Crassostreagigsapolysaccharide;sulfated modification;antitumor activity;apoptosis

2017-01-13

趙冠華(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：海洋藥源生物活性物質(zhì)開發(fā)，E-mail:lookgo@qq.com。

*通訊作者:曲敏(1976-)，女，博士，研究方向：海洋藥源生物活性物質(zhì)開發(fā)，E-mail:qumin2008@163.com。

海洋局公益性行業(yè)科研專項(201405017-03)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)13-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.056