食品級納米二氧化硅對小鼠器官功能影響的研究

劉嘉褀,候曉敏,彭子荷,劉和亮,郝小惠,*

(1.華北理工大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學實驗技術專業(yè),河北唐山 063000;2.華北理工大學公共衛(wèi)生學院,河北唐山 063000;3.華北理工大學醫(yī)學實驗研究中心,河北唐山 063000;4.國家科技部老年醫(yī)學國際科技合作基地,河北唐山 063000)

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食品級納米二氧化硅對小鼠器官功能影響的研究

劉嘉褀1,候曉敏2,彭子荷1,劉和亮3,4,郝小惠3,4,*

(1.華北理工大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學實驗技術專業(yè),河北唐山 063000;2.華北理工大學公共衛(wèi)生學院,河北唐山 063000;3.華北理工大學醫(yī)學實驗研究中心,河北唐山 063000;4.國家科技部老年醫(yī)學國際科技合作基地,河北唐山 063000)

目的:通過測定小鼠連續(xù)性口服食品級納米二氧化硅(Nano silicon dioxide,Nano-SiO2)12周后血清及肝、腎、睪丸組織中硅元素的含量,并對小鼠肝腎等器官進行觀察,初步評價納米二氧化硅對機體的安全性。方法:將雄性昆明小鼠隨機分為對照組(0.05%BSA)、納米SiO2低劑量組(100 mg/kg/day)、中劑量組(500 mg/kg/day)、高劑量組(1000 mg/kg/day)和微米SiO2組(1000 mg/kg/day),各組按上述劑量分別連續(xù)灌胃二氧化硅84 d后全部處死,利用HE染色觀察各組動物的肝臟、腎臟、睪丸等組織病理學變化;ICP-OES檢測血清及肝、腎、睪丸組織中硅元素的含量;檢測各組動物血清中的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和尿素氮(BUN)的含量。結果:病理學觀察在納米低、中、高劑量組均發(fā)現肝臟、腎臟和睪丸組織有形態(tài)上的異常改變,以高劑量組更嚴重;納米組血清中ALT、AST和BUN的含量均顯著增高(p<0.01或p<0.05);同時在血清及肝、腎、睪丸組織中納米組的硅離子含量增高并呈現劑量依賴性;上述指標中同等劑量納米組和微米組相比,納米組含量高且病理變化更明顯。結論:較長時間口服攝入食品級納米二氧化硅可能在機體的肝臟、腎臟、睪丸等臟器內蓄積,造成一定程度的肝臟、腎臟等的病理學損害并影響其功能。長期多量食入納米二氧化硅可能會對機體造成不良影響。

食品添加劑,納米二氧化硅,ICP-OES,谷草轉氨酶,谷丙轉氨酶

二氧化硅(SiO2)在我國乃至世界范圍是一種廣泛應用的食品添加劑,在食品中主要使用的是無定型二氧化硅,以E551的名字出現在各類食品的配料表上,是防止顆粒聚集結塊、保持食品松散、自由流動的抗結劑[1-2]。隨著生產工藝的發(fā)展,SiO2已經達到了納米尺寸,在食品、藥品、化妝品、農業(yè)等領域均有廣泛的應用[3-4]。目前我國公民日常從食物中攝取的二氧化硅量未見相關的統(tǒng)計數據。但國外有文獻報道人們每天從食物中攝取的二氧化硅約有9.4 mg/kg/day,其中估計有1.8 mg/kg/day是納米范圍的[5]。由于納米顆粒的比表面積增大、表面反應基團數目增多,其生物活性也大大增加,因此,納米材料的毒性和生物安全性成為人們關注的熱點之一[6]。然而目前針對食品中納米SiO2的研究較少。因此對食品級納米SiO2的安全性評價與代謝研究是保證食品安全應做的重要工作。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性昆明小鼠40只[北京華阜康生物科技有限公司,許可證編號:SCXK(京)2014-0004],體質量18～22 g；R972型納米二氧化硅(20～30 nm) 上海緣鈦化工產品有限公司;LH-102型微米二氧化硅 天津市龍華化工有限公司;牛血清白蛋白 美國sigma公司;二氧化硅標準溶液(500μg/gNCS納克公司;TirtonX-100 美國Amresco 公司;谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒、谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒、尿素氮(BUN)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES) 美國PerkinElmer公司;iMARK680型酶標儀 美國BIO-RAD伯樂公司;Milli-Q10型超純水機 美國Millipore公司;Q5000型微量紫外分光光度計 美國Eppendorf 公司;DP80圖像采集系統(tǒng) 日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理 將40只小鼠隨機分為對照組、低劑量納米SiO2組(100 mg/kg/day)、中劑量納米SiO2組(500 mg/kg/day)、高劑量納米SiO2組(1000 mg/kg/day)、微米SiO2組(1000 mg/kg/day)每組各8只[5]。高壓超純水配制質量濃度為0.05%的牛血清白蛋白溶液(BSA),用0.05%的BSA配制10、50、100 mg/mL的納米SiO2,100 mg/mL的微米SiO2,每只小鼠按照上述分組根據體重給予相應體積的SiO2灌胃,對照組給予10 mg/kg/day的0.05%的BSA一次性灌胃,共持續(xù)84 d,并每天觀察動物的生長狀況、生活習性等一般性狀。每周稱量質量并按照該值調整各組動物的灌胃體積,于灌胃后第85 d經麻醉后處死全部動物。

1.2.2 標本的制備 各組小鼠分別抽取約0.8 mL抗凝血,4 ℃,12000 r/min,離心15 min后提取上清待用;分別取動物部分肝臟、腎臟、睪丸組織經4%甲醛固定后經過脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片進行病理組織學觀察;其余上述組織置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.3 小鼠器官組織病理學觀察 將制備好的小鼠肝臟、腎臟、睪丸等組織石蠟標本切片,常規(guī)脫蠟、水化后,進行蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色,用OLYMPUS光學顯微鏡組織切片成像系統(tǒng)觀察小鼠各組織病理學結構并攝片。

1.2.4 小鼠血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶含量測定 按照試劑盒說明書步驟操作,分別將各組小鼠血清與相關試劑混勻,37 ℃水浴30 min后,于酶標儀510 nm波長處讀取讀數,同時繪制標準曲線,其中谷丙轉氨酶公式為y=298.02x-2565.59(R2=0.9988);谷草轉氨酶公式為y=3435.2x2-5.8098x-0.4749(R2=0.9996),根據標準曲線和測得的吸光度值計算出各樣本的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶含量,為卡門氏單位U。

1.2.5 小鼠血清尿素氮含量測定 按照試劑盒說明書將一定量樣本中依次加入各試劑并混勻水浴后,用分光光度計在640 nm波長處測量出標準液和各樣本的OD值,設空白對照調零。

尿素氮含量=待測樣本的OD值/標準品OD值×標準濃度(10 μmol/L)×樣品稀釋倍數。

1.2.6 ICP-OES檢測各組動物血清及肝、腎、睪丸組織中游離硅原子含量

1.2.6.1 ICP-OES工作條件 功率:1.30 kW;等離子氣流:15.0 L/min;輔助氣流量:1.50 L/min；進樣時間:30 s;霧化器流量:0.70 L/min;穩(wěn)定時間:15 s;清洗時間:10 s;觀察高度:7 mm;蠕動泵轉速:15 r/min;積分時間:5.00 s;積分次數:3。

1.2.6.2 樣品處理 室溫解凍血清,吹打至均勻,取0.4 mL血清用稀釋液(1% HNO3加0.1% TirtonX-100)1∶20稀釋后上機檢測;準確稱取0.20 g肝、腎及睪丸組織于微波消解罐中,加入消解液在微波消解儀中消化,用超純水稀釋后上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 小鼠組織病理學觀察

圖1 各組小鼠肝臟、腎臟及睪丸組織切片觀察(HE染色×400)Fig.1 The pathology observation of liver,kidney and testis of mice in each group by HE(×400)注:A:對照組;B:納米低劑量組;C:納米中劑量組;D:納米高劑量組;E:微米組。

表1 各組小鼠血清ALT、AST和BUN檢測結果Table 1 The results of ALT,AST and BUN in serum of mice in each ±s)

注:與對照組比較,a)p<0.05,b)p<0.01,;與微米SiO2組比較,c)p<0.05,d)p<0.01,表2同。2.1.1 小鼠肝臟組織病理學觀察 對照組小鼠肝臟組織HE染色切片用高倍鏡觀察所見,肝小葉結構清晰,肝細胞排列成索條狀,匯管區(qū)結構清晰,肝細胞大小均一,被膜光滑,中央靜脈及肝血竇無擴張充血表現。納米低、中、高劑量組均可見部分肝小葉中央靜脈擴張充血、肝竇充血,肝細胞索尚呈放射狀排列,在高劑量組匯管區(qū)可見小靜脈擴張充血,肝細胞脂肪樣變性,少數肝細胞的壞死。中央靜脈周圍間質可見成纖維細胞,微米組也可見上述擴張充血表現,與納米低劑量組病變程度相當。

2.1.2 小鼠腎臟組織病理學觀察 對照組小鼠腎臟組織皮質髓質清晰可辨,腎小球和腎小管邊界清晰,近曲小管和遠曲小管細胞特征明顯,細胞排列整齊。納米低劑量組的細胞可見腎臟背膜光滑,未見增厚,有少量腎小球體積增大,血管擴張充血,腎小球內皮細胞數目增多。腎小管未見異常病變,皮質厚度正常。中、高劑量納米組小鼠腎小管可見輕微水變性,腎間質小血管擴張充血。微米組腎臟可見改變如同低劑量納米組。

2.1.3 小鼠睪丸組織病理學觀察 對照組小鼠睪丸組織腺管細胞排列整齊,腺腔內可見各級生精細胞層次分明,細胞數量多,成熟精子排列整齊清晰可辨。而納米組的小鼠睪丸腺腔內腺管排列紊亂,腺腔內各級生精細胞排列紊亂、層次不清,極向紊亂,隨著納米劑量的增加,細胞紊亂程度增加。微米組的存在上述異常表現但較輕微。

2.2 小鼠血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶含量檢測結果

表1中小鼠肝臟功能檢測結果顯示,納米和微米SiO2組的谷丙轉氨酶含量均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);其中納米高劑量組增高最明顯，是正常對照組的4.25倍,微米組的谷草轉氨酶含量低于各納米劑量組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。表1中顯示谷草轉氨酶含量測定結果略不同于谷丙轉氨酶,只有高劑量納米SiO2組的該酶含量高于正常對照組,同時也高于微米SiO2組,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),其他各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 小鼠血清尿素氮含量檢測結果

表1中各組小鼠血清尿素氮檢測結果可見納米SiO2各劑量組和微米組的尿素氮均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01或p<0.05);納米組和微米組相比,中、高劑量納米組的尿素氮檢測結果高于微米組(p<0.01或p<0.05)。

2.4 ICP-OES檢測小鼠血清及肝、腎、睪丸組織中硅含量結果

由表2可見,正常對照組小鼠血清硅含量均值為4.029 μg/mL,三個納米SiO2組小鼠的血清硅含量均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),其中以中劑量組含量最高,均值為5.961 μg/mL,大約高于正常對照組47.9%,微米SiO2組的硅含量略高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);微米組與納米組相比,中、高劑量納米組血清硅含量高于微米組(p<0.01)。低劑量納米組和微米組相比差異無統(tǒng)計學意義。

肝臟組織中硅含量測定結果顯示,納米低、中、高劑量組及微米組的硅含量均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01);納米高劑量組硅含量高于同劑量微米組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01);低、中劑量納米組和微米組相比差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各組小鼠血清及肝、腎、睪丸組織中游離硅元素檢測結果±s)Table 2 The results of free-Si in serum,liver,kidney and testis of mice in each ±s)

表2結果顯示,納米低、中、高劑量組及微米組的腎臟組織中硅含量均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01或p<0.05);微米組與納米組相比,中、高劑量納米組硅含量高于微米組(p<0.01)。低劑量納米組和微米組相比差異無統(tǒng)計學意義。

由睪丸組織中硅含量測定結果可見,納米低、中、高劑量組及微米組的硅含量均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01);與微米組相比,納米中、高劑量組硅含量均比微米組高,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),納米低劑量組含量低于微米組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。

3 結論與討論

有動物實驗研究發(fā)現，經靜脈或腹腔注射進入體內的納米SiO2經血循環(huán)再分布后在肝臟和脾臟有較高的富集[7-9],而肺臟和腎臟的再分布量較少[10-11],Meike等[5]經連續(xù)口服給予大鼠低劑量的食品級納米SiO228 d后觀察到其在肝腎脾僅有少量的分布,而在空腸和回腸有大量的蓄積。但也有研究認為經口服后SiO2可在機體的肝腎等臟器蓄積,對于SiO2的生物安全性狀研究表明,不同途徑進入機體的納米SiO2對肺臟、心血管系統(tǒng)、肝腎、胃腸、神經等組織器官均有不同程度的損害作用[12-14]?？诜M入人體的納米SiO2,首先與胃腸道粘膜接觸產生作用,對胃腸道粘膜細胞有可能造成損害,關于這方面的文獻寥寥無幾,針對食品中的納米SiO2的研究更少。另一方面,長期攝入是否對肝脾腎等器官造成損害也是值得明確的問題。目前對于食品級納米SiO2的研究相對匱乏,因此日常食用的食品級納米SiO2在體內分布情況及對重要臟器是否造成影響是此研究的核心問題。從納米SiO2的特性和上述的研究現狀出發(fā),本實驗選擇小鼠作為實驗對象,分別設計了高于我們日常攝入量約10、50和100倍的納米SiO2經消化道連續(xù)飼養(yǎng)動物12周即84 d,同時應用等同于納米SiO2高劑量的微米SiO2做對比,觀察其對小鼠肝、腎等重要臟器是否有不良影響。

由結果可見,從病理切片組織學的角度觀察肝臟的情況,與正常對照組小鼠相比,納米組的肝組織出現肝細胞脂肪變性,肝小葉中央靜脈和匯管區(qū)靜脈擴張充血等表現,在納米低劑量組即出現上述表現,中劑量組和高劑量組表現相似,沒有肝細胞壞死、硬化等發(fā)生,但肝細胞脂肪變性的程度加深。而微米SiO2組的上述變化不很明顯,只可見少數肝細胞的脂肪變性程度輕微,推測SiO2經血循環(huán)進入肝細胞,并對肝細胞產生一定的不良影響,納米組的病變程度較微米組的為重,可能因為納米顆粒細小,經胃腸道粘膜吸收入血進入肝臟的機會增多[3]。

腎臟的病理學表現也大致相同,納米SiO2組的腎臟可見部分腎小球體積增大,血管擴張充血,間質內的細胞成分如血管內皮細胞增生,上述變化在各劑量納米組均可見。在中高劑量組可見腎小管的輕微水變性,可見間質小血管的擴張充血。在微米組的變化如同納米低劑量組的變化程度。

在實驗過程中發(fā)現灌胃開始1周左右動物的睪丸有紅腫現象,但隨著灌胃時間的延長逐步消失,因此在組織病理學觀察時特意對睪丸組織進行了觀察,發(fā)現在納米組的動物睪丸腺腔內腺管排列紊亂,腺腔內的各級生精細胞排列紊亂、層次不清,極向消失,成熟的精子數量減少,并且上述變化隨著納米劑量的增高而程度加深,而微米組上述的變化程度很輕微。黃遂[15]的研究發(fā)現納米SiO2可通過調節(jié)凋亡信號通路上的關鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達水平的變化而引起生殖損傷,另有文獻報道通過氣管內灌注納米SiO2的方法發(fā)現長期接觸可引起雄性小鼠的精子存活率下降、畸形率增加[16],本實驗的睪丸病理學觀察所見是上述結果的病理學印證。

這些病理變化的結果提示納米SiO2可能更易通過胃腸道粘膜吸收入血,再分配到達肝臟,腎臟,睪丸等組織細胞當中,對上述器官產生一定程度的影響。但目前的觀察并未發(fā)現上述器官出現硬化、增生甚至大量壞死等更加嚴重的形態(tài)學病變。

為進一步探究納米級SiO2進入機體后對上述器官的功能是否產生不利的影響,我們觀察了肝臟功能相關的指標即肝臟的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶以及腎臟的血清尿素氮的水平。肝臟的谷丙轉氨酶檢測結果顯示,在納米組的該值增高,在納米高劑量組增高尤為明顯,是正常對照組的4.25倍,而微米組增高后的水平與納米低劑量組相當,與病理變化相一致。谷丙轉氨酶主要體現的是肝細胞受損的程度,上述結果表明納米SiO2進入肝臟對肝細胞功能造成影響,并與納米SiO2的劑量相關。然而同時檢測的谷草轉氨酶則表明肝細胞壞死的狀況,結果只有納米中、高劑量組出現了具有統(tǒng)計學意義的增高,說明納米SiO2進入肝臟主要引起細胞的變性,而無明顯的細胞壞死。反映腎臟功能指標的血清尿素氮檢測結果顯示在納米組尿素氮含量均顯著增加,而微米SiO2組的該指標值較低,提示可能對腎臟功能產生一定程度的影響。

上述ALT、AST及BUN的結果提示納米SiO2可能更容易穿過胃腸道的細胞膜被吸收并且可以隨血流到達其他作用的靶器官,如肝臟、腎臟、睪丸等,并對其功能產生不良影響。Nishimori[17]等人研究顯示70 nm的SiO2對小鼠肝臟有損傷,此外,還發(fā)現70 nm的SiO2對肝血清指標ALT、IL-6、TNF-α存在劑量效應,長期接觸可以導致肝纖維化。Park[18]等研究表明,微米級SiO2只能到達細胞間質,而納米SiO2可被吸收至細胞核中。趙光強[19]等采用透射電子顯微鏡觀察不同粒徑SiO2細胞內分布,納米SiO2組細胞間質可見高電子密度納米SiO2顆粒,部分膜不完整,而微米SiO2組細胞質內未發(fā)現高電子密度顆粒,膜結構完整。推測本實驗結果可能與納米SiO2粒徑小易穿過細胞膜有關。相比之下相同劑量的微米SiO2上述血清生化指標及組織病理變化非常輕微可能主要是因為微米SiO2的粒徑相對較大,不易穿過胃腸道的細胞膜而吸收少。

上述推測也被ICP-OES測得的血清及肝、腎、睪丸組織中游離硅含量變化進一步證實,該結果顯示在血清及肝、腎、睪丸組織中,納米SiO2的含量較微米SiO2含量明顯增高,并且納米SiO2含量與攝入量呈正相關關系。本實驗研究是基于動物實驗并且是高于可能的日常攝入量很多倍的實驗結果,因此應該謹慎的解釋和評價,關于相關的人群方面的研究,目前尚缺乏有力的證據[20],但我們在應用如食品添加劑納米SiO2等諸如此類的納米材料的同時應高度警惕其可能潛在的對人體的危害。

綜上所述,食物中的納米SiO2更易進入體內被機體吸收,并會對機體的重要臟器及其功能產生不良的影響,且影響的程度與攝入的量相關。本次實驗結果是在高于人體正常攝入量很多倍的基礎上得出的,而攝入多大劑量的納米SiO2會對人體健康造成威脅還有待進一步的實驗證實。

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Study on the effects of the food grade silica Nanoparticleson the organ function of the mice

LIU Jia-qi1,HOU Xiao-min2,PENG Zi-he1,LIU He-liang3,4,HAO Xiao-hui3,4,*

(1.Basic Medical College,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;2.School of Public Health,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;3.Medical Research Center,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;4.International Science and Technology Cooperation Base of Geriatric Medicine of Ministry ofScience and Technology,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

Objective:To evaluate the safety of Nano silica on the tissues of the mice,the mice were taken oral administration with the food grade silica Nanoparticles(Nano silicon dioxide,Nano-SiO2),after 12 weeks the content of silica in serum,livers,kidneys and testis of silica were detected,and the livers and kidneys of mice were observed. Methods:Male KM mice were randomly divided into different groups including the control group(0.05%BSA),Nano-SiO2groups(100,500,1000 mg/kg/day)and micron-SiO2group(1000 mg/kg/day). 84 days later,all animals were killed and the tissues were collected. The histopathological changes of livers,kidneys,testis and other tissues of the mice by HE staining were obversed. Content of silicon in livers,kidneys,testis and serum were detected by ICP-OES. The content of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)and blood urea nitrogen(BUN)in serum were measured by colorimetric method. Results:All the results were compared with the control group. The HE staining showed the varying differences of pathological changes in the livers,kidneys and testicular tissue abnormalities and the high dose of Nano-SiO2group was the most. With the increase of Nano-SiO2doses,the contents of ALT,AST and BUN were increased. The examination of the silicon in the livers,kidneys,testis and serum of the Nano groups were inhibited in dose-dependent manner. Compared with the same dose of micron group,the above results of the Nano group were more serious. Conclusion:Taking orally with food grade Nanosilicon for a long time,the poison may accumulate in the body's liver,kidney,testis and other tissues,leading to different histopathological damages and affect their functions.

food additives;Nanosilicon dioxide;ICP-OES;ALT;AST

2016-12-29

劉嘉祺(1994-)，女，本科，主要從事肺纖維化研究，E-mail:13315559650@163.com。

*通訊作者:郝小惠(1971-)，女，碩士，教授，主要從事肺纖維化研究，E-mail:haoxiaohui2005@163.com。

河北省科學技術研究與發(fā)展計劃項目(10276116D)；唐山市老年醫(yī)學科技創(chuàng)新團隊(15130212C)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)13-0292-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.054