酶解水牛奶制備抗凝血肽的工藝研究

苗艷麗,陳紹紅,余廣仁,楊麗紅,馮煥煥,鄺嘉文,張兆霞,*

(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣東湛江 524088)

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酶解水牛奶制備抗凝血肽的工藝研究

苗艷麗1,陳紹紅2,*,余廣仁1,楊麗紅1,馮煥煥1,鄺嘉文1,張兆霞1,*

(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣東湛江 524088)

目的:本文以新鮮水牛奶為原料,研究木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶復(fù)合酶解、混合酶解水牛奶的作用,比較不同水解方式的作用效果;并采用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定水解液抗凝血活性。方法:分別進(jìn)行三種蛋白酶單因素水解實(shí)驗(yàn),確定各種酶的最適水解條件;在此基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)合酶解與混合酶解實(shí)驗(yàn),測(cè)定水解度和抗凝血活性。結(jié)果:木瓜蛋白酶的最適水解條件為:水解溫度60 ℃、水解時(shí)間 2.0 h、pH5.0、料水比1∶2(v/v)、酶用量 6000 U/(mL底物);中性蛋白酶的最適條件為:水解溫度40 ℃、水解時(shí)間 3.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH6.0、酶用量 6000 U/(mL底物);堿性蛋白酶的最適條件為:水解溫度50 ℃、水解時(shí)間 4.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH8.0、酶用量6000 U/(mL 底物)。復(fù)合酶解法制備的水解液其抗凝血活性均高于混合酶解,最高抗凝血活性為52.0 ATU/mL。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下,加酶組合為“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-堿性蛋白酶”的復(fù)合酶解制備的水解液具有最高的抗凝血活性,即52.0 ATU/mL。

水牛奶,混合酶解,復(fù)合酶解,抗凝血活性,抗凝血肽

心腦血管疾病已成為我國(guó)發(fā)病率、致死率最高的疾病,其中大部分疾病與血栓相關(guān)[1-2]。而臨床上使用的肝素、香豆素、鏈激酶、尿激酶等物質(zhì)易引發(fā)出血等副作用。近些年來從水蛭、蜱蟲、鉤口線蟲、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物質(zhì)具有良好的抗凝血效果,但毒副作用大[3-5]。來源于酪蛋白、大豆蛋白、花生、蛋清等食品原料的抗凝血活性肽,因其可以被人體消化和吸收,能有效地進(jìn)入凝血系統(tǒng),進(jìn)而發(fā)揮作用,具有較高的安全性等特點(diǎn)[6],已經(jīng)成為當(dāng)前多肽類藥物和保健食品的研究熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白分子中含有若干具有抗凝血酶活性的肽段——抗凝血肽[7-8],在合適的工藝條件下水解酪蛋白,可獲得功能與水蛭素類似的抗凝血肽。前期我們已經(jīng)利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行酪蛋白多酶混合水解,發(fā)現(xiàn)水解后的產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗凝血活力[9]。牛奶中酪蛋白占總蛋白總量的80%,而且水牛奶中的酪蛋白含量高于普通牛奶,采用合適的蛋白酶酶解之后制備具有抗凝血活性的小肽類物質(zhì),制備工藝條件簡(jiǎn)單,可以節(jié)約分離純化酪蛋白的大量成本和勞動(dòng)力。目前,國(guó)內(nèi)外以富含蛋白質(zhì)的常規(guī)食材為原料制備抗凝血活性肽的研究還處于起步階段[8-12],其中劉恭等以牦牛乳酪蛋白為原料,采用胰蛋白酶酶解酪蛋白制備抗凝血肽[8];本人以酪蛋白為原料,采用混合酶解法制備了有較高活性的抗凝血肽[9];胡永倩等以花生分離蛋白為研究對(duì)象,通過酶法制備花生肽,并分析了高抗凝花生肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)[10]。

本實(shí)驗(yàn)旨在已有的工作基礎(chǔ)上,以富含蛋白質(zhì)的常規(guī)食材——水牛奶為原料,通過生物化學(xué)加工方法處理后,制備具有抗凝血活性的小肽類物質(zhì),為后期開發(fā)以其作原料的防治血栓性疾病的口服小肽類藥物或功能性食品提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)用酶解法水解食物蛋白,制備具有抗凝血活性的小肽類物質(zhì),產(chǎn)品本身具有綠色屬性,而且所需原材料來源豐富、成本低、制備工藝條件簡(jiǎn)單。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝血酶對(duì)照品 湖南一格制藥有限公司,批號(hào)140701-2,2000 NIH/瓶;酪蛋白(化學(xué)純) 國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(Pa)6×105U/g、中性蛋白酶(NP)2×105U/g、堿性蛋白酶(AP)4×105U/g 廣西龐博公司,食品級(jí);牛血纖維蛋白原 美國(guó)Biosharp公司,進(jìn)口分裝;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

THZ-82恒溫振蕩器 國(guó)華器械;CR22G高速冷凍離心機(jī) HITACHI公司;HH-6型三用電熱恒溫水箱 金壇市富華儀器有限公司;EL200電子天平 日本島津公司;JH-752型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;PHS-2F pH計(jì) 上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶活力測(cè)定 蛋白酶活力定義為1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)在最適條件下,每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg酪氨酸所需要的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位U。生成的酪氨酸量用紫外光譜法測(cè)定。3種蛋白酶使用前測(cè)定其實(shí)際活力,活力測(cè)定參照任清[13]的方法并有改動(dòng),具體測(cè)試過程如下。

1.2.1.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用100 μg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,于275.0 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 蛋白酶活力的測(cè)定 待測(cè)酶液的制備：稱取酶粉(0.5±0.0002) g,精確至0.000 1 g,用少量該酶的最適pH最接近的緩沖溶液溶解,移入100 mL容量瓶中,用最適pH緩沖溶液定容至刻度,搖勻。冷藏，用于酶水解和酶活力測(cè)定。

測(cè)定步驟:先將酪蛋白溶液放入40 ℃恒溫水浴預(yù)熱5 min。然后按下列步驟操作:試管A(空白)→加蒸餾水1.00 mL→加三氯乙酸2.00 mL→40 ℃,加熱5 min→加酪蛋白溶液1.00 mL→40 ℃,加熱10 min→靜置10 min,過濾→定容10.00 mL，于275 nm波長(zhǎng)測(cè)A。試管B(四種不同的待測(cè)酶液,分別平行三份)→分別吸取1.00 mL→加酪蛋白溶液1.00 mL→40 ℃,加熱10 min→加三氯乙酸2.00 mL→40 ℃,加熱5 min→靜置10 min,過濾→定容10.00 mL于275 nm波長(zhǎng)測(cè)B。蛋白酶活力由下式計(jì)算得到:

酶活力(U/g或U/mL)=(n×c×F)/(10m)

式(1)

式(1)中,C-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的水解液中酪氨酸質(zhì)量濃度(μg/mL);n-水解液體積(mL);F-稀釋倍數(shù);10-水解時(shí)間(min);m-酶質(zhì)量(g)或體積(mL)。

1.2.2 化學(xué)成分測(cè)定 總氮量(TN):凱氏定氮法[14];氨基氮量(AN):中性甲醛滴定法[10]。

水解度(DH,%)=水解液氨基氮量(mg)×100/總氮量(mg)

式(2)

1.2.3 酶解液抗凝血活性測(cè)定

1.2.3.1 抗凝血活性試劑的配制 Tris-HCl緩沖溶液:精確稱取 0.7980 g Tris-HCl 溶于少量蒸餾水并定容于100 mL容量瓶,用稀NaOH溶液調(diào)pH至7.4。

0.5%牛血纖維蛋白原:精確稱取30 mg溶于6 mL Tris-HCl緩沖溶液。

凝血酶溶液配制[15]:凝血酶濃度用單位體積溶液中凝血酶活力單位(NIH)數(shù)量多少(NIH/mL)表示。取一定量凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品用適量生理鹽水溶解,配制凝血酶濃度分別為 20(作為基準(zhǔn)濃度,即1倍),40(即2倍)、100(即5倍)、200、400 NIH·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.2 抗凝血活性測(cè)定 用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定水解物的抗凝血酶活力[16]。取幾支7.5 mm×100 mm的小試管,各加入0.5%纖維蛋白原200 μL,再精密移取酶解液50 μL,放在37 ℃恒溫水浴鍋中5 min。取其中一支試管,滴加5倍的凝血酶溶液5 μL,迅速搖勻,若1 min內(nèi)凝固,說明酶液中含有的抗凝血活性少于0.5 ATU;重新取另一支試管,加入1倍的酶液5 μL,迅速搖勻,若1 min內(nèi)不凝,再加入1倍的酶液5 μL,直到1 min內(nèi)凝固為止。

活性用抗凝血酶活性單位(ATU)表示,含量按下式計(jì)算:

U=20C

式(3)

式(3)中,C為每50 μL待測(cè)(供試品)溶液含ATU的單位數(shù),U為每1 mL待測(cè)溶液含ATU數(shù)。

1.2.4 三種蛋白酶的單因素水解實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 原料處理 取一定量的水牛奶50 mL置于試管中,高速離心機(jī)以6000 r/min離心15 min,取出,去除上層的脂肪層,得脫脂水牛奶。牛奶脫脂后調(diào)pH至10左右煮沸10 min,放冷至室溫,用稀鹽酸或氫氧化鈉調(diào)到酶解所需pH。

按下述條件進(jìn)行酶解,水解結(jié)束后升高水解液溫度至95 ℃,保持 10 min。放冷至室溫后,以6800 r/min離心20 min,取上清液,用甲醛滴定法測(cè)定水解度。對(duì)照組所用蛋白酶先行滅活,其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)組相同。反應(yīng)完畢,放冷至室溫,6800 r/min離心15 min,取濾液作為相應(yīng)樣品管測(cè)定水解度的對(duì)照。

1.2.4.2 溫度對(duì)水解度的影響 取10.0 mL脫脂牛奶,加入6000 U/(mL底物)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或堿性蛋白酶)溶液,料水比為1∶2(v/v),將pH調(diào)為7.0,溫度分別設(shè)為40、50、60、70、80 ℃，水解3.0 h;測(cè)定水解度,確定最適水解溫度。

1.2.4.3 時(shí)間對(duì)水解度的影響 取10.0 mL牛奶,加入6000 U/(mL底物)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或堿性蛋白酶),料水比為1∶2(v/v),將pH調(diào)為7.0,60 ℃恒溫水解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h,測(cè)定水解度,確定最適水解時(shí)間。

1.2.4.4 pH對(duì)水解度的影響 取10.0 mL處理過的水牛奶,加入6000 U/(mL牛奶)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶)溶液,調(diào)pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0(堿性蛋白酶酶解時(shí)調(diào)pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0),料水比為1∶2(m/v),60 ℃水解3 h;測(cè)定水解度,確定最適水解pH。

1.2.4.5 料對(duì)比對(duì)水解度的影響 取10.0 mL處理過的水牛奶,加入6000 U/(mL牛奶)木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或堿性蛋白酶),料水比分別為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5(v/v),將pH調(diào)為5.0,60 ℃恒溫水解3.0 h,測(cè)定水解度,確定最適水解料水比。

1.2.4.6 酶用量對(duì)料水比的影響 取10.0 mL處理過的水牛奶,加入20 mL蒸餾水,加入木瓜蛋白酶(或中性蛋白酶或堿性蛋白酶),將pH調(diào)為5.0,酶用量分別為1 mL 牛奶加入2000、4000、6000、8000、10000 U木瓜蛋白酶,60 ℃恒溫水解3.0 h,測(cè)定水解度,確定最適酶用量。

1.2.5 水牛奶的混合酶解實(shí)驗(yàn) 混合酶水解是指若干種酶按一定的比例混合均勻后,在某種酶的最適水解條件下水解底物。例如由A、B兩種酶組成的混合酶解系統(tǒng),具體做法是:先了解這兩種酶的最適溫度、最適pH、最適底物濃度、最適料水比、最適反應(yīng)時(shí)間,然后進(jìn)行酶解。取一定量底物(A、B兩種酶最適底物濃度之和)在A酶的最適水解條件水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅A酶的活力,測(cè)定其水解度;取一定量底物(A、B兩種酶最適底物濃度之和)在B酶的最適水解條件水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅B酶的活力,測(cè)定其水解度。比較這兩個(gè)水解度的高低。如果一個(gè)混合酶解系統(tǒng)由3種或4種酶組成,實(shí)驗(yàn)方法與此相同,但過程要復(fù)雜一些[17]。

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶共組成9種不同混合酶組合(具體見表6)。9個(gè)250 mL具編號(hào)的錐形瓶,各加入處理過的水牛奶10.0 mL、蒸餾水20 mL,按照最適酶用量加入已預(yù)熱的2種或3種酶液,分別在木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的最適溫度、最適時(shí)間進(jìn)行水解。酶解結(jié)束后升高水解液溫度至100 ℃,保持 10 min滅酶。把酶解液置于離心機(jī)中以6800 r/min離心15 min,取上清液測(cè)定其水解度和抗凝血活性。

1.2.6 水牛奶的復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn) 復(fù)合酶水解是先按在某種酶的最適水解條件下水解底物,然后滅活,再按另一種酶在其最適條件下水解。

例如由A、B兩種酶組成的復(fù)合酶解系統(tǒng),具體做法是:先了解這兩種酶的最適反應(yīng)時(shí)間、最適料水比、最適pH、最適溫度、最適酶用量,然后進(jìn)行兩種方式酶解:取一定量底物在A酶的最適水解條件水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅A酶的活力,再在B酶的最適水解條件下水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅B酶的活力,然后測(cè)定其水解度;取一定量底物在B酶的最適水解條件水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅B酶的活力,再在A酶的最適水解條件下水解,水解完成后,升高水解液溫度至100 ℃保持10 min滅A酶的活力,然后測(cè)定其水解度。比較這兩個(gè)水解度的高低[17]。

Zhao等[18]研究酶解海參蛋白發(fā)現(xiàn)使用菠蘿蛋白酶、脘酶及堿性蛋白酶3種蛋白酶共同作用,水解效果要優(yōu)于單一蛋白酶。由于單憑一種酶有時(shí)很難達(dá)到預(yù)期效果,可選用多酶組合或復(fù)合酶系水解目標(biāo)蛋白質(zhì)[19],復(fù)合酶系的降解效果一般較好[20]。本論文采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶3種蛋白酶水解水牛奶制備抗凝血小肽。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶共組成12種不同的復(fù)合酶組合(具體見表7)。12個(gè)250 mL具編號(hào)的錐形瓶,各加處理過的水牛奶10.0 mL、蒸餾水20 mL和二酶、三酶復(fù)合組合中的第一種酶,在該酶的最佳工藝條件下進(jìn)行水解。水解完成后,滅酶,依次加入第二種、第三種酶,操作同前者。反應(yīng)完成后,以6800 r/min離心15 min,取上清液測(cè)水解度和抗凝血活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,且方程決定系數(shù)(R2=0.997)較高,說明該曲線擬合程度比較好。

表3 水解pH對(duì)水解度的影響Table 3 Effect of pH on hydrolysis degree

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of tyrosine

2.2 三種蛋白酶單因素水解實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)酶解效果的影響 水解溫度對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解度影響如表1。

表1 水解溫度對(duì)水解度的影響Table 1 Effect of temperature on hydrolysis degree

由表1可以看出隨著溫度的不斷升高,木瓜蛋白酶對(duì)水牛奶的水解度也不斷增加,當(dāng)溫度在60 ℃的時(shí)候,水解度達(dá)到最高點(diǎn);可當(dāng)溫度高于60 ℃,由于溫度過高從而降低了酶的活性,相應(yīng)水解度也降低,因此木瓜蛋白酶的最適溫度為60 ℃。同理得出中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適溫度均是50 ℃。

2.2.2 時(shí)間對(duì)水解度的影響 水解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解度影響如表2。

表2 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Table 2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

如表2可見,在1.0～3.0 h之間,酶的水解度變化最大,之后水解度變化小。由于酶具有專一特性,隨時(shí)間延長(zhǎng),溶液中能被水解的特定蛋白質(zhì)的量減少,導(dǎo)致水解時(shí)間雖長(zhǎng),但水解度增加不明顯;另外，考慮到生產(chǎn)效率,所以木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)時(shí)間確定為2.0 h。同理確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適反應(yīng)時(shí)間分別是3.0、4.0 h。

2.2.3 pH對(duì)酶解效果的影響 水解pH對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解度影響如表3。由表3明顯的可以看到,當(dāng)pH從4.0逐漸增加到5.0的時(shí)候,水解度不斷增加;且在pH5.0時(shí)水解度達(dá)到最大值,當(dāng)pH超過5.0時(shí),水解度明顯下降;表明過高或過低的pH都會(huì)抑制木瓜蛋白酶的活性,使其水解度下降;因此木瓜蛋白酶最適pH為5.0。同理確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適pH分別是6.0和8.0。

2.2.4 料水比對(duì)酶解效果的影響 水解料水比對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解度影響如表4。

表4 水解料水比對(duì)水解度的影響Table 4 Effect of ratio of material to water on hydrolysis degree

表4可見隨著料水比逐漸增加,水解度也是逐漸增大的。原因是加水充足,酶與底物充分接觸,有利于酶促反應(yīng)。但如果加水量過大,酶濃度降低,與底物接觸的單位酶量減少,不利于酶促反應(yīng),而且在1∶2(v/v)時(shí)水解度達(dá)到最高,因此最佳料水比選1∶2(v/v)。同理確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適料水比均為1∶2(v/v)。

2.2.5 酶用量對(duì)酶解效果的影響 水解酶用量對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解度影響如表5。由表5可以看到隨著酶用量的增大,水解度是在不斷增加的,在2000～6000 U/mL底物間增幅是最大的,用量超過6000 U/mL底物的時(shí)候其水解度增加不明顯,從生產(chǎn)工藝上講,雖說水解度越大越好,可是增加的幅度不大,耗時(shí)耗能不經(jīng)濟(jì),因此最適的酶用量為6000 U/(mL底物)；同理確定中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適酶用量均為6000 U/(mL底物)。

表5 水解酶用量對(duì)水解度的影響Table 5 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree

從表1～表5可知,木瓜蛋白酶的最適水解條件為:水解溫度60 ℃、水解時(shí)間 2.0 h、pH5.0、料水比1∶2(v/v)、酶用量 6000 U/(mL 底物);中性蛋白酶的最適條件為:水解溫度40 ℃、水解時(shí)間 3.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH6.0、酶用量6000 U/(mL底物)。堿性蛋白酶的最適條件為:水解溫度50 ℃、水解時(shí)間4.0 h、料水比1∶2(v/v)、pH8.0、酶用量6000 U/(mL底物)。

2.2.7 水牛奶的混合酶解實(shí)驗(yàn) 由表6的數(shù)據(jù)可見,混合酶解的組合中,組合“中性-堿性-木瓜”混合酶解液的水解液水解度較高,而且抗凝血活性最好。三種蛋白酶混合最佳加酶順序?yàn)椤爸行缘鞍酌?堿性蛋白酶-木瓜蛋白酶”,其抗凝血活性為21.0 ATU/mL。

表6 混合酶解液的水解度和抗凝血活性的測(cè)試Table 6 Mixed enzyme degree of hydrolysis and anticoagulant activity test

注:表中的各組合以第一個(gè)酶的最適條件進(jìn)行混合酶解。

2.2.8 水牛奶的復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn) 12種復(fù)合酶組合的水解度和抗凝血活性測(cè)試結(jié)果見表7。數(shù)據(jù)顯示,按照表7中的組合11的加酶順序“中性-木瓜-堿性”進(jìn)行復(fù)合酶解,其制備的水解液的水解度和抗凝血活性均最高,3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的水解度分別為:38.12%、38.30%、38.20%,平均38.20%;活性測(cè)試結(jié)果分別為:51.0、52.5、51.5 ATU/mL,平均為51.5 ATU/mL,表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表7 水牛奶復(fù)合酶解液的水解度和抗凝血活性測(cè)試Table 7 Composite enzyme degree of hydrolysis and anticoagulant activity test

而且對(duì)比表6和表7的結(jié)果,可見復(fù)合酶解液的抗凝血活性均比混合酶解液的活性高,因此,酶解水牛奶制備抗凝血肽的最優(yōu)工藝即為:“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-堿性蛋白酶”的三酶復(fù)合酶解。最佳工藝條件為:在250 mL錐形瓶中加入處理過的水牛奶10.0 mL,然后加入中性蛋白酶,在 pH6.0、料水比1∶2、溫度40 ℃、酶用量6000 U·(mL-1底物)的條件下水解3.0 h;水解完成后,滅酶;然后按6000 U·(mL-1底物)加入木瓜蛋白酶,在 pH5.0、溫度60 ℃ 水解2.0 h;水解完成后,滅酶;最后按6000 U·(mL-1底物)加入堿性蛋白酶,在pH8.0、溫度50 ℃、水解4.0 h。反應(yīng)完成后,以6800 r/min離心15 min,取上清液。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的單因素實(shí)驗(yàn),2酶和3酶的混合酶解和復(fù)合酶解,采用凝血酶滴定改進(jìn)法,對(duì)抗凝血活性進(jìn)行了檢測(cè),得到水牛奶抗凝血肽的最佳制備工藝條件為:“中性蛋白酶-木瓜蛋白酶-堿性蛋白酶”的組合進(jìn)行的三酶復(fù)合酶解,在該條件下制備的酶解液的抗凝血活力為52.0 ATU/mL。

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Study on technology conditions of preparation for anticoagulant peptidefrom buffalo milk by enzymatic hydrolysis

MIAO Yan-li1,CHEN Shao-hong2,*,YU Guang-ren1,YANG Li-hong1,FENG Huan-huan1,KUANG Jia-wen1,ZHANG Zhao-xia1,*

(1.College of Chemistry and Environment of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.College of Food Science and Technology,Modern Biochemistry Experimental Center,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Objective:Research on buffalo milk affected by the systems about mixed enzyme and composite enzyme including papain,neutral protease and alkaline protease,comparing with the result in different ways of hydrolysis. Method:First,the experiment went on with the single factor of three proteases hydrolyzing milk to explore the optimum condition of enzymatic hydrolysis. On this basis,the degree of hydrolysis was determinated through composite enzymatic hydrolysis and mixed enzyme and anticoagulant activity was determinated. Consequence:The results showed that optimum condition of papain were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=5.0,temperature 60 ℃,time 2 h,enzyme dosage 6000 u/mL. Neutral protease of were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=6.0,temperature 40 ℃,time of 2 h,enzyme dosage 6000 u/mL.Optimum condition of alkaline protease were as follows:the ratio of material to water for 1∶2,pH=8.0,temperature 50 ℃,time 4 h,enzyme dosage 6000 u/mL. Composite enzymatic hydrolysis anticoagulant activity was higher than by mixed enzymatic hydrolysis. The highest anticoagulant activity was 52 ATU/mL. Conclusion:In the experimental conditions,the degree and anticoagulant activity by composite enzymatic hydrolysis were higher than by mixed enzymatic hydrolysis. The enzymatic hydrolysis solution,which was prepared by the enzyme combination of the composite enzyme of neutral protease and papain protease and alkaline protease,had the highest anticoagulant activity,was 52.0 ATU/mL.

buffalo milk;mixed enzymolysis;composite enzymolysis;anticoagulant activity;anticoagulant peptide

2016-12-06

苗艷麗(1978-),女,博士,副教授,研究方向:中藥新產(chǎn)品的開發(fā),E-mail:myl9831@163.com。

*通訊作者:陳紹紅(1973),女,本科,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,研究方向:生物醫(yī)藥研發(fā),E-mail:csh3788@163.com。 張兆霞(1968-),女,本科,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,研究方向:資源綜合利用,E-mail:zhangzx2383300@126.com。

廣東省教育廳2015年重點(diǎn)平臺(tái)及科研項(xiàng)目(2015KTSCX057);廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校項(xiàng)目(GDOU2015050209);廣東海洋大學(xué)2015年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(CXXL2015030)。

TS252

A

1002-0306(2017)13-0107-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.020