牛血清白蛋白與花青素納米顆粒的特性及穩(wěn)定性研究

姚惠芳，董學(xué)艷，景 浩

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

牛血清白蛋白與花青素納米顆粒的特性及穩(wěn)定性研究

姚惠芳，董學(xué)艷，景 浩*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

目的：研究牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與花青素相互作用形成的納米顆粒的特性，及其對(duì)花青素的氧化 穩(wěn)定性的影響。方法：采用掃描透射電子 顯微鏡和納米粒度儀，研究BSA與篤斯越橘花青素形成納米顆粒的表觀形態(tài)及 粒徑大小，用鹽析法測(cè)定BSA對(duì)花青素的結(jié)合量，并用自由基（DPPH自由基、ABTS+·）清除方法和胃腸模擬體系分別研究BSA對(duì)花青素氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果：BSA-花青素在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中能通過自組裝形成納米顆粒，其納米顆粒較BSA的粒徑變小，由30～35 nm減小到15～20 nm。BSA對(duì)花青素的結(jié)合量是每摩爾BSA分子上結(jié)合的花青素為10 mol。BSA-花青素納米顆粒較花青素的DPPH自由基、ABTS+·清除能力明顯增強(qiáng)。在胃模擬體系中，BSA與花青素結(jié)合對(duì)花青素穩(wěn)定性沒有顯著性影響；在腸模擬體系中，BSA與花青素結(jié)合對(duì)花青素穩(wěn)定性有顯著性影響，未結(jié)合的花青素在6 h后含量降低70%左右，而有BSA結(jié)合的花青素含量幾乎保持不變，表明BSA與花青素結(jié)合對(duì)花青素的氧化穩(wěn)定性有明顯的保護(hù)作用。

牛血清白蛋白；花青素；納米顆粒；結(jié)合量；氧化穩(wěn)定性

花青素（anthocyanin，ACN）廣泛分布于蔬菜水果中，是 以2-苯基-苯并吡喃陽(yáng)離子為基本結(jié)構(gòu)的糖基衍生物，具有和天然類黃酮化合物一樣的C6—C3—C6碳骨架和生化合成來源[1]。研究結(jié)果表明：花青素具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[4]等生物學(xué)活性。但花青素的氧化穩(wěn)定性較差，其活潑的酚羥基容易被氧化成醌類物質(zhì)[5]，降低了其生物學(xué)活性。為了克服此缺點(diǎn)，通過花青素與大分子物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)等結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)增加花青素穩(wěn)定性的目的。Jiménez-Aguilar等[6]報(bào)道，花青素與多糖結(jié)合，可以明顯延長(zhǎng)花青素降解時(shí)間，增加花青素的穩(wěn)定性。Zheng Nan等[7]報(bào)道，在pH 8.0和80℃加熱60 min的條件下，篤斯越橘中花青素提取物的吸光度及其對(duì)ABTS+·清除率明顯降低，而乳清 蛋白與篤斯越橘中花青素提取物相互作用后可以有效阻止花青素的吸光度及其ABTS+·清除率的降低。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是人們最早發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行研究的蛋白質(zhì)載體之一，主要在牛肝細(xì)胞合成釋放到血液，是血漿中含量最高的 載體蛋白。BSA蛋白樣品純度高，廉價(jià)易得；BSA能與許多內(nèi)源及外源性化合物進(jìn)行可逆的、特異性的非共價(jià)結(jié)合，從而起到重要的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)作用[8]。所以，已被廣泛應(yīng)用于制備與具有生物活性小分子相互作用的模型蛋白。已有報(bào)道，蛋白類大分子可以提高小分子的穩(wěn)定性[9]。Zhang Liangke等[10]研究表明BSA與葉 酸結(jié)合形成納米顆粒，可以減少葉酸的降解。Fang Ru等[11]研究發(fā) 現(xiàn)BSA與槲皮素相互作用形成納米顆粒，可以提高槲皮素的穩(wěn)定性。姚惠芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)BSA可以與花青素相互作用，主要是與BSA中的色氨酸殘基發(fā)生相互作用，靜電引力是其主要作用力，但是BSA與花青素相互作用后的物理形態(tài)及其對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)主要研究BSA與花青素相互作用形成的納米顆粒的特性，及其對(duì)花青素的氧化穩(wěn)定性的影響。首先運(yùn)用掃描透射電子顯微鏡和納米粒度儀研究BSA與花青素形成納米顆粒的表觀形態(tài)及粒徑大小，然后采 用鹽析法測(cè)定BSA對(duì)花青素的結(jié)合量，最后用自由基（DPPH自由基、ABTS+·）清除方法和胃腸模擬體系分別研究BSA對(duì)花青素氧化穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（第5組分，純度大于98%，分子質(zhì)量67 200D，Cat.: A-0332） 美國(guó)Amresco公司進(jìn)口分裝；篤斯越橘花青素（花青素含量為25%；進(jìn)一步經(jīng)過XAD-7樹脂柱分離純化，除去蛋白質(zhì)和多糖，得到的篤斯越橘花青素純化物，花青素含量為35%，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷占總花青素含量的78.1%） 大興安嶺華野生物工程有限公司。

P7000-25G胃蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；胰酶粉（生物純） 北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid） ammonium salt，ABTS）（純度98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度97%）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；醋酸鈾 中鏡科儀（北京）膜科技有限公司；無水乙醇溶液 北京化工廠；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

S-5500型掃描透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；銅網(wǎng) 中鏡科儀（北京）膜科技有限公司；Nano-ZS90納米粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器公司；培英THZ-C型恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；pHS-3C+型酸度計(jì) 成都市紀(jì)方舟科技有限公司；XB 220A型電子天平 德國(guó)Precisa Gravimetrics AG公司；QL-901型渦流振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

牛血清白蛋白用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配成1.5×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，將制備好的儲(chǔ)備液保存于4℃的冰箱中備用；花青素用去離子水（pH 6.3）配成1.5×10-3mol/L的儲(chǔ)備液（此處為了計(jì)算方便，統(tǒng)一使用篤斯越橘中含量最高的矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2作為花青素的近似相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行處理）。實(shí)驗(yàn)中所用的花青素溶液是現(xiàn)用現(xiàn)配的。

1.3.2 掃描透射電子顯微鏡下納米顆粒的測(cè)定

在1.5 mL離心管中，加入10 μL BSA儲(chǔ)備溶液，再加入不同量的花青素儲(chǔ)備液，配制不含花青素的溶液和花青素與BSA的濃度比值是10的溶液，加0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至1 mL。用渦流振蕩器混勻，最終BSA的濃度為1.5×10-6mol/L，室溫下靜置待用。取20 μL樣品，使銅網(wǎng)浮在樣品上6 min，濾紙吸干，待晾干后，使銅網(wǎng)浮在10 μL醋酸鈾染液上，染色10 min，濾紙吸干多余的染液自然晾干，放在干燥器中保存待用。掃描透射電子顯微鏡觀察在30 kV條件下進(jìn)行，放大倍數(shù)為350 000。

1.3.3 BSA-花青素納米顆粒粒徑及Zeta電勢(shì)的測(cè)定

在15 mL離心管中，加入1 mL BSA儲(chǔ)備溶液，再加入不同量的花青素儲(chǔ)備液，配制花青素與BSA的濃度比值是0、2、4、6、8、10的溶液，加0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至10 mL。用渦流振蕩器混勻，最終BSA的濃度為1.5×10-5mol/L。粒徑和Zeta電勢(shì)測(cè)量在25℃條件下進(jìn)行，重復(fù)3次，平衡時(shí)間2 min，累積次數(shù)100次。

1.3.4 BSA納米載體對(duì)花青素結(jié)合量的測(cè)定

在15 mL離心管中，加入1 mL BSA儲(chǔ)備溶液，再加入不同量的花青素儲(chǔ)備液，配制花青素與BSA的濃度比值分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24的溶液，加0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至10mL，用渦流振蕩器混勻。BSA的濃度為1.5×10-5mol/L。花青素的濃度分別為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36×10-5mol/L。

通過鹽析法使體系中的BSA納米顆粒形成沉淀，從而將結(jié)合在納米顆粒中的花青素和未結(jié)合的花青素分開。取制備好的各種納米顆粒溶液10 mL，緩慢加入過量硫酸銨粉末，均勻攪拌，直至體系中有未溶解的硫酸銨，再攪拌10 min，仍有未溶解的硫酸銨，靜置20 min后，取出上清液，放入離心管中，4℃、10 000×g離心30 min。取上清，用UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)上清液中花青素的含量，即游離花青素的含量（cf），而結(jié)合的花青素的量（cb）即：

式中：c即體系中加入的花青素的總量。

用UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)所有樣品上清液在528 nm波長(zhǎng)處的吸光度，即游離未結(jié)合的花青素的吸光度，然后根據(jù)花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算cf，并根據(jù)公式計(jì)算cb。重復(fù)3個(gè)樣品。

1.3.5 BSA納米載體對(duì)花青素抗氧化活性的測(cè)定

先將花青素儲(chǔ)備液用去離子水稀釋成1.5×10-5mol/L的工作液。所有待測(cè)樣品中花青素終濃度為1.5×10-5mol/L，BSA與花青素的濃度比值分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，用渦流振蕩器混勻。室溫靜置，待用。BSA的濃度分別為0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5×10-5mol/L。

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定采用孫蕾等[13]的方法，稍作改進(jìn)。簡(jiǎn)述如下，在96孔板中，每孔加入15 μL樣品溶液和60 μL 0.05 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）以及150 μL 0.15 mmol/L DPPH溶液混合反應(yīng)，室溫避光放置30 min。用無水乙醇溶液作為樣品顏色空白參比；磷酸鹽緩沖溶液為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀上于520 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。依據(jù)公式（2）計(jì)算清除率。

式中：A對(duì)照表示無水乙醇溶液的吸光度；A樣品表示樣品的吸光度；A空白表示磷 酸鹽緩沖溶液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS+·清除率的測(cè)定

ABTS+·在波長(zhǎng)630 nm處有最大吸收，根據(jù)吸收值的變化判斷被測(cè)樣品抗氧化能力的大小。實(shí)驗(yàn)方法參照Fang Ru等[14]的方法。簡(jiǎn)述如下：配制140 mmol/L ABTS儲(chǔ)存液－20℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)稀釋至14 mmol/L，并與4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液充分混勻，在室溫下放置黑暗中反應(yīng)13 h，即生成ABTS原液。將ABTS原液稀釋至吸光度為0.50±0.02，在90 μL ABTS稀釋液中加入10 μL的樣品，放置4 min后用UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)630 nm波長(zhǎng)處的吸光度。所有操作避光進(jìn)行，重復(fù)3個(gè)樣品。樣品對(duì)ABTS+·的清除率按照公式（2）進(jìn)行。

1.3.6 BSA對(duì)花青素穩(wěn)定性及釋放的測(cè)定

體外消化模型包括胃模型和腸模型，模型的設(shè)置參照美國(guó)藥典（United States Pharmacopoeia，USP）并稍作調(diào)整[15]，具體如下：1）體外胃模型（有酶）、0.32%胃蛋白酶、0.2% NaCl，用HCl調(diào)至pH 1.2；2）體外胃模型（無酶），0.2% NaCl，用HCl調(diào)至pH 1.2；3）體外腸模型（有酶），1%胰酶制劑、0.68% K2HPO4，用NaOH調(diào)至pH 7.4；4）體外腸模型（無酶），0.68% K2HPO4，用NaOH調(diào)至pH 7.4。體系中BSA濃度為1.5×10-5mol/L，花青素的濃度為0 mol/L或1.5×10-4mol/L。在恒溫?fù)u床中37℃、100r/min孵育6h，取樣時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6h，取樣后立即于528nm波長(zhǎng)處測(cè)量樣品的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA-花青素自組裝納米顆粒的形態(tài)

圖1 BSA-花青素自組裝納米顆粒的掃描透射電子顯微鏡圖像（×350 0000 000）Fig.1 STEM image of BSA-ACN self-assembled nanoparticles (× 350 000)

由圖1A可知，在水溶液中，自然的BSA分子之間相互交錯(cuò)呈現(xiàn)松散的聚集狀態(tài)。水溶液中的蛋白質(zhì)分子傾向于將親水基團(tuán)暴露在外部，疏水基團(tuán)埋藏在內(nèi)部，從而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的疏水性氨基酸超過30%時(shí)，無法將所有疏水基團(tuán)埋藏，暴露在表面的疏水基團(tuán)將促進(jìn)分子之間形成聚集[16]。由于BSA分子疏水性氨基酸的比例大于30%，因此，在疏水相互作用和氫鍵共同作用下，水溶液中天然的BSA分子之間形成聚集，呈現(xiàn)松散的狀態(tài)[17]，暴露的疏水性基團(tuán)不足以形成緊密的聚集。當(dāng)加入磷酸鹽緩沖液后，可見BSA分子聚集，形成球形顆粒，粒徑約為30～35 nm（圖1B），且顆粒呈現(xiàn)良好的分散性。加入花青素以后顆粒與B圖相比明顯減小，從30～35 nm減小到15～20 nm（圖1C）。添加花青素后粒徑減小，則說明BSA發(fā)生緊密的聚合。

2.2 BSA-花青素自組裝納米顆粒的粒徑和電勢(shì)分布

2.2.1 BSA-花青素自組裝納米顆粒的粒徑分布

圖2 BSA-花青素自組裝納米顆粒的粒徑分布Fig.2 Size distribution of BSA-ACN self-assembled nanoparticles

由圖2可知，BSA結(jié)合不同量的花青素后納米粒徑大小不同，呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，未結(jié)合花青素的BSA顆粒粒徑約為25 nm，這與電鏡結(jié)果略有不同。馬鑫等[18]研究多肽自組裝的顆粒粒徑，電鏡和粒徑儀的測(cè)定的結(jié)果分別約為50～100 nm和45～270 nm。這兩種方法的結(jié)果差異可能由于不同的樣品處理方法所致，由于電鏡制樣期間即銅網(wǎng)與樣品接觸時(shí)間內(nèi)，樣品可能發(fā)生聚合，使顆粒粒徑變大；而粒徑儀制樣期間要渦旋充分振蕩，樣品發(fā)生聚合的機(jī)率小。與結(jié)合花青素的BSA顆粒粒徑呈現(xiàn)顯著性差異，且隨著花青素濃度的增大，BSA-花青素自組裝形成的納米顆粒逐漸減小，當(dāng)加入的花青素與BSA濃度比值為10時(shí)，粒徑小于15 nm（圖2），說明結(jié)合花青素以后BSA發(fā)生了緊密的縮合。

2.2.2 BSA-花青素自組裝納米顆粒的電勢(shì)分布

圖3 BSA-花青素自組裝納米顆粒的電勢(shì)Fig.3 Zeta potential of BSA-ACN self-assembled nanoparticles

Peters[19]報(bào)道在pH值約為7的條件下，BSA分子表面電勢(shì)為－18 mV。由圖3可知，在磷酸鹽緩沖體系中沒有結(jié)合花青素的BSA的電勢(shì)為－15 mV，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Peters[19]的結(jié)果基本一致。加入少量的花青素以后，BSA-花青素自組裝后的電勢(shì)沒有明顯的變化，而是基本保持不變，當(dāng)加入的花青素與BSA的濃度比值為6時(shí)，電勢(shì)值（負(fù)）開始緩慢升高。BSA由于擁有較多的酸性氨基酸其凈電荷為負(fù)，因此自然狀態(tài)的BSA電勢(shì)為負(fù)值，當(dāng)加入花青素量較高時(shí)，電勢(shì)值出現(xiàn)升高，這可能是由于花青素帶負(fù)電荷[20]，與BSA表面的正電基團(tuán)結(jié)合，使得BSA表面的負(fù)電荷相對(duì)增加，BSA分子之間的靜電斥力增加，從而阻止了BSA分子之間的聚集，造成結(jié)合花青素的BSA的納米顆粒粒徑逐漸減小。這與粒徑分布和電鏡掃描的結(jié)果一致。

2.3 BSA納米載體對(duì)花青素的結(jié)合量

BSA納米載體對(duì)花青素的結(jié)合趨勢(shì)是：隨著花青素的增加，被結(jié)合的花青素也在增加，當(dāng)加入的花青素的濃度為3.0×10-4mol/L時(shí)（即花青素與BSA的濃度比值為20時(shí)），結(jié)合的花青素的量不再增加（圖4），這說明BSA納米載體對(duì)花青素的結(jié)合達(dá)到了飽和。每摩爾BSA分子上結(jié)合的花青素為10 mol，這可能與BSA的分子質(zhì)量較大有關(guān)，故BSA與花青素結(jié)合的量較高[21]。但比Fang Ru等[22]報(bào)告的每摩爾BSA可以結(jié)合11 mol槲皮素略低，根據(jù)相似相容性原理，可能由于BSA疏水性結(jié)合位點(diǎn)多余親水性結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致結(jié)合的疏水性的槲皮素多于親水性的花青素。本研究中運(yùn)用的硫酸銨是中性鹽，在水中解離可形成硫酸根離子和銨根離子。因此，鹽濃度對(duì)疏水相互作用和靜電引力有一定的影響。由于BSA和花青素相互作用 是發(fā)生在磷酸鹽緩沖溶液中的，磷酸鹽緩沖溶液可能會(huì)對(duì)溶液中離子變化有一定緩沖作用，但不可能完全排除鹽濃度對(duì)結(jié)合量的影響。Fang Ru等[22]報(bào)道，1mol BSA可以結(jié)合11mol槲皮素，而在本實(shí)驗(yàn)條件下，1mol BSA可以結(jié)合10mol花青素，這應(yīng)該是相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)合量。

圖4 BSA納米載體對(duì)花青素的結(jié)合量Fig.4 Binding capacity of BSA nanocarrier to Ant

2.4 BSA納米載體對(duì)花青素抗氧化活性的影響

為了考察與BSA納米載體結(jié)合的花青素的抗氧化活性是否受到影響，進(jìn)一步研究了不同濃度的BSA和與花青素結(jié)合的BSA的DPPH自由基和ABTS+·清除率，然后后者減去前者即為花青素的DPPH自由基和ABTS+·清除率。結(jié)果表明，在DPPH自由基體系中，被BSA載體結(jié)合的花青素清除DPPH自由基的能力有影響，當(dāng)BSA與花青素的濃度比值小于0.4時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率約為30%，清除DPPH自由基的能力基本沒有受到影響；當(dāng)BSA與花青素的濃度比大于0.6時(shí)影響逐漸增大，對(duì)DPPH自由基清除率約為23%（圖5A）。但總體上，BSA納米載體對(duì)花青素的DPPH自由基清除能力的影響較小。在ABTS體系中，情況基本一致，未結(jié)合的花青素對(duì)ABTS+·清除率為56%，當(dāng)BSA與花青素的濃度比大于0.4時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率約為45%（圖5B），BSA納米載體對(duì)花青素的清除ABTS+·能力有影響，但影響較小。可以看出被BSA結(jié)合后的花青素的自由基 清除率有所下降，推測(cè)這可能與5-OH形成氫鍵有關(guān)。花青素的酚羥基是起抗氧化作用的重要基團(tuán)，A環(huán)上的5-OH是重要的抗氧化基團(tuán)[23]，因此，5-OH的屏蔽必然會(huì)導(dǎo)致抗氧化作用的降低，因而導(dǎo)致花青素的自由基清除率降低。

圖5 BSA納米載體結(jié)合的花青素的抗氧化活性（nn== 33）Fig.5 DPPH radical and ABTS＋· scavenging activities of unboundAnt and Ant bound to BSA nanocarrier (n= 3)

2.5 BSA納米載體對(duì)花青素穩(wěn)定性及釋放的影響

González-Barrio等[24]報(bào)道花青素在回腸內(nèi)分解后的含量降為40%，從而失去其特征吸收[10]。花青素在腸道體系很不穩(wěn)定，易氧化形成醌類。因此，可根據(jù)吸光度的變化分析花青素穩(wěn)定性的變化。

無論是結(jié)合的還是未結(jié)合的花青素，在胃模型pH 1.2中很穩(wěn)定，在6 h內(nèi)花青素的量幾乎未發(fā)生變化，同樣的有沒有胃蛋白酶的存在對(duì)花青素的穩(wěn)定性也沒有什么影響（圖6A）。這與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的花青素在酸性條件下穩(wěn)定相一致。在腸模型pH 7.4中花青素很不穩(wěn)定，未結(jié)合的花青素在pH 7.4（無酶）的條下很不穩(wěn)定，其含量在6 h已經(jīng)降低70%左右（圖6B），這種含量降低是由于花青素被溶在水中的O2氧化，并生成了一種醌類物質(zhì)，醌不再具備花青素的各種性質(zhì)，如抗氧化性以及各種光譜特征，因此，在同樣的測(cè)試條件下無法被檢測(cè)[26]。同樣是pH 7.4（無酶）的條件，被BSA結(jié)合的花青素在經(jīng)過6 h后，含量基本沒什么變化?？梢夿SA納米載體對(duì)花青素有較好的保護(hù)作用。同樣，未結(jié)合和結(jié)合的花青素在有胰酶的體系中，呈現(xiàn)出與不含胰酶的體系不同的變化趨勢(shì)。未結(jié)合的花青素在有胰酶的體系中，經(jīng)過6 h后含量有降低，但是減少量小于20%，這說明可能是體系中的胰酶對(duì)花青素也有保護(hù)作用，但通過比較發(fā)現(xiàn)，胰酶對(duì)花青素的保護(hù)作用沒有BSA納米載體的保護(hù)作用完全，仍有近20%的減少量。例如，無胰酶有BSA載體的體系的花青素的保留量要明顯高于同時(shí)具有胰酶和BSA載體的體系和有胰酶無BSA載體的體系的花青素保留量。這可能是由于體系中胰酶的量很大，BSA的量較少，BSA可以很快被胰酶酶解從而不存在，對(duì)花青素的保護(hù)作用減弱。因此，有胰酶有BSA載體的體系中的花青素和有胰酶無BSA載體的體系中的花青素呈現(xiàn)基本相同的變化趨勢(shì)。由此可見，在腸模擬體系中，花青素被載體結(jié)合后氧化速率可以明顯的降低。由于只有游離狀態(tài)的花青素才易于被氧化，因此，這個(gè)趨勢(shì)也是BSA載體對(duì)結(jié)合的花青素的釋放趨勢(shì)，也就是說，BSA納米載體對(duì)花青素在中性條件下有很好的緩釋作用。

圖6 BSA納米載體包埋花青素在體外消化模型中的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of anthocyanin with or without BSA in SGF and SIF models

3 結(jié) 論

篤斯越橘花青素與BSA在磷酸鹽緩沖液中自組裝相互作用可形成納米顆粒，粒徑約為15～20 nm。每摩爾BSA分子可以結(jié)合10 mol花青素分子，BSA納米載體能夠顯著提高花青素的抗氧化活性，在中性條件下，BSA納米載體可以提高花青素的穩(wěn)定性，并且有很好的緩釋作用。

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Characteristics of Bovine Serum Albumin-Anthocyanin Bioactive Nanoparticles

YAO Hui-fang, DONG Xue-yan, JING Hao*
(Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The nanoparticle formation between bovine serum albumin (BSA) and anthocyanin (ACN) was characterized using scanning transmission electron microscope (STEM) and nanoparticles size analyzer. The anthocyanin-binding capacity of BSA was studied by ammonium sulfate salting-out method. DPPH and ABTS radical scavenging capacities and release characteristics in both simulated intestinal fluid (SIF) and simulated gastric fluid (SGF) systems were investigated for oxidation stability of BSA-bound anthocyanin system. The results showed that both BSA and anthocyanin-bound BSA could be self-assemble and form nanoparticles in phosphate buffer (pH 7.4), and the particle size (15–20 nm) of the anthocyaninbound BSA was smaller than that of the BSA (30–35 nm). The molar binding ratio between BSA and antocyanin was 1:10. The DPPH radical and ABTS+· scavenging abilities of BSA-bound anthocyanin were significantly stronger than those of unbound anthocyanin. There was no significant difference in stability between unbound anthocyanin and BSA-bound anthocyanin in SGF system, while significant difference in SIF system was observed. The content of unbound anthocyanin decreased by approximately 70% after 6 hours; however, no significant change was observed for BSA-bound anthocyanin. BSA revealed remarkable stabilizing effect on anthocyanin oxidation.

bovine serum albumin; anthocyanin; nanoparticles; binding capacity; oxidation stability

TS201.4

A

1002-6630(2014)01-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201401001

2013-01-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171676）

姚惠芳（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榈鞍着c天然活性小分子物質(zhì)的相互作用的制備和應(yīng)用。E-mail：yaohuifang_1987@163.com

*通信作者：景浩（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿訝I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn