規(guī)范化特殊染色技術對肺真菌感染性疾病病理診斷的意義

劉菲菲，李 雪，金木蘭

規(guī)范化特殊染色技術對肺真菌感染性疾病病理診斷的意義

劉菲菲，李 雪，金木蘭

目的 探討規(guī)范化特殊染色技術在肺真菌感染性疾病病理診斷中應用的意義。方法 選取2011年9月～2016年3月北京朝陽醫(yī)院最終病理診斷為肺真菌感染性疾病104例，行HE染色、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染過碘酸雪夫氏染色(PAS)及六胺銀和HE染色聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS及六胺銀，將兩種特染技術規(guī)范化比較，鏡下觀察分析結果(均為初次染色結果，不包括復染結果)，以最終病理診斷結果為標準，與臨床初診結果比較。結果 肺真菌感染性疾病確診率和真菌分型率，從低到高順序一致，為臨床初步診斷(29.8%和19.2%)、HE染色法(32.7%和32.7%)、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀(90.4%和87.5%)、HE染色聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS和六胺銀(98.1%和94.2%)。這4種方法從兩方面比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，第4種方法與前兩種比較方法差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，與第3種方法比較確診率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分型率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但全自動特殊染色法染PAS及六胺銀操作步驟更簡單，化學試劑規(guī)范化，無人工和環(huán)境因素影響，耗時短，脫片和復染張數(shù)更少。結論 HE染色法聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS和六胺銀更加規(guī)范化，有助于提高肺真菌感染性疾病的確診率和真菌分型率。

肺疾病；全自動特殊染色；規(guī)范化；真菌

隨著近年來各種高效廣譜抗生素、免疫抑制劑及抗惡性腫瘤藥物的廣泛使用，再加上器官移植、導管技術以及外科其他介入性治療的全面成熟與發(fā)展，導致因條件致病性真菌所引起的系統(tǒng)性真菌感染日益增多[1]。而肺部真菌感染占深部真菌感染的首位，50%～60%侵犯支氣管、肺[2]。但其癥狀、體征和影像學表現(xiàn)缺乏特異性，部分真菌感染病灶和炎癥、結核、腫瘤病灶難以鑒別，易誤診，從而導致治療方案的制定不夠精確[3]。因此，快速、準確的診斷出真菌類型就顯得尤為重要。但其實現(xiàn)的關鍵在于規(guī)范化、標準化病理技術的支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院2011年9月～2016年3月經(jīng)最終病理診斷確診為肺真菌感染性疾病104例。男性59例，女性45例，年齡20～82歲，中位年齡52.2歲。標本來源：支氣管黏膜活檢36例，肺穿刺活檢16例，外科手術肺活檢52例(開胸肺活檢20例，電視胸腔鏡肺活檢32例)，患者具有基礎病者占81%，以高血壓、糖尿病為主占50%以上，其次惡性腫瘤約16%，肺結核約13%，還有其它少見基礎病冠心病、哮喘、鼻竇炎、氣管炎及風濕性關節(jié)炎等。治療后好轉94例(90.4%)，完全康復3例(2.9%)，死亡7例(6.7%)。

1.2 試劑及方法 (1)常規(guī)HE染色。(2)傳統(tǒng)手工PAS染色步驟：切片脫蠟至水，入0.5%高碘酸液氧化10 min，流水沖洗2 min，蒸餾水洗2次，雪夫試劑染10～20 min，充分水洗。蘇木精對比染色1 min，分化、返藍、水洗，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固(試劑盒購自珠海貝索公司)。(3)傳統(tǒng)手工六胺銀染色法：試劑(購自北京益利公司)：①六胺銀貯備液：3%六次甲基四胺水溶液100 mL，5%硝酸銀水溶液5 mL。臨用時將兩種液體混合呈乳白色，瞬間透明。②六胺銀硼砂染色液：六胺銀貯備液25 mL，蒸餾水25 mL，5%硼砂水溶液2 mL[4]。步驟：①切片脫蠟至水，5%鉻酸水溶液氧化1 h，流水沖洗5 min。②浸入1%亞硫酸鈉水溶液1 min，除鉻酸，自來水沖洗5 min，蒸餾水充分洗滌。③置入六胺銀硼砂染色液內60 ℃溫箱1 h，至切片呈黃褐色，鏡下觀察真菌呈黑褐色為止。蒸餾水洗3次。④0.2%氯化金水溶液調色5 min，蒸餾水洗。⑤2%硫代硫酸鈉水溶液3 min，自來水洗。⑥乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固[4]。(4)全自動特殊染色法染PAS和六胺銀，均采用全自動特殊染色儀(型號NexEs，美國)，使用的PAS和六胺銀染色試劑盒(75人次)購自羅氏診斷公司，PAS時長39 min，六胺銀時長120 min，兩種染色可同時進行，時長120 min。

1.3 分析方法 (1)病理技術規(guī)范化比較：通過比較傳統(tǒng)手工特殊染色法和全自動特殊染色法在操作步驟的復雜程度、化學試劑的規(guī)范化、人工及環(huán)境因素影響、耗時、脫片和復染張數(shù)幾方面，顯示其兩者之間的差異。(2)三種組合由一名主治和一名副高級醫(yī)師進行鏡下閱片并診斷：①HE染色。②HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀。③HE染色聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS和六胺銀。結果再與臨床初診和最終病理診斷結果做比較，從肺真菌感染確診率、真菌分型率和真菌類型分布比例幾方面進行分析。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)手工特殊染色法和全自動特殊染色法規(guī)范化比較 傳統(tǒng)手工特殊染色和全自動特殊染色相比，在操作步驟復雜程度(步驟數(shù)量和掌握難易度)、化學試劑規(guī)范化(是否為商品化試劑)，人工和環(huán)境因素影響(主要是人工控溫、控時、控制染色效果及外界溫、濕度等因素)幾方面后者優(yōu)于前者，并且后者染PAS和六胺銀所需時間更短，為120 min，脫片、復染張數(shù)也較少，分別為2張(表1)。

2.2 肺真菌感染確診率和真菌分型率比較 肺真菌感染確診率和真菌分型率從低至高順序一致，均為臨床初步診斷31例和20例(29.8%和19.2%)、HE染色法34例和34例(32.7%和32.7%)(圖1)、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀94例和91例(90.4%和87.5%)、HE染色聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS和六胺銀102例和98例(98.1%和94.2%)(圖2、3)。這4種方法從兩方面比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，第4種方法與前兩種比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，與第3種比較確診率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，分型率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

2.3 真菌類型分布 最終病理診斷為肺真菌感染且分出類型者共100例，前3位是曲霉菌60例(60.0%)、隱球菌21例(21.0%)、毛霉菌17例(17.0%)。順序相同者為HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀91例，曲霉菌55例(60.4%)、隱球菌20例(22.0%)、毛霉菌14例(15.4%)，HE染色聯(lián)合全自動特殊染色法染PAS和六胺銀98例，曲霉菌58例(59.2%)、隱球菌21例(21.4%)、毛霉菌17例(17.4%)。順序不同者為臨床初步診斷20例，曲霉菌13例(65.0%)、毛霉菌4例(20.0%)、隱球菌2例(10.0%)，HE染色法34例，曲霉菌27例(79.4%)、毛霉菌5例(14.7%)、隱球菌2例(5.9%)(表3)。

表1 兩種特殊染色技術的規(guī)范化比較

表2 104例肺真菌感染確診病例的4種診斷方法與最終病理診斷結果的比較[n(%)]

確診率：確診例數(shù)/總例數(shù)；真菌分型率：真菌分型例數(shù)/總例數(shù)

表3 104例肺真菌感染確診病例4種診斷方法在真菌分布上與最終病理診斷結果的比較[n(%)]

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

圖1 真菌數(shù)量較多時，HE染色可以鑒別：A.曲霉菌；B.毛霉菌；C.隱球菌；D.肺孢子菌HE染色鑒別較為困難 圖2 真菌的全自動特殊染色(曲霉菌、毛霉菌)：A.曲霉菌全自動PAS染色；B.曲霉菌全自動六胺銀染色；C.毛霉菌全自動PAS染色；D.毛霉菌全自動六胺銀染色；染色更明顯，易辨別真菌結構，區(qū)分兩種類型 圖3 真菌的全自動特殊染色(隱球菌、肺孢子菌)：A.隱球菌全自動PAS染色；B.隱球菌全自動六胺銀染色；C.肺孢子菌全自動PAS染色；D.肺孢子菌全自動六胺銀染色；染色更突出，較易發(fā)現(xiàn)真菌及辨別其結構

3 討論

近年來，肺真菌感染性疾病日益增多，但臨床初診的誤診率很高，分析原因：(1)肺真菌感染缺乏特異性臨床表現(xiàn)。原發(fā)疾病的存在也會掩蓋真菌感染的臨床征象。(2)影像學上缺乏特異性。有些影像學表現(xiàn)酷似粟粒樣結核，有些真菌感染所致結節(jié)和腫塊影與腫瘤很難鑒別。(3)真菌感染病理改變主要為炎性浸潤和肉芽腫性改變，與細菌性感染和結核無明顯區(qū)別，致使病灶無特征性。(4)臨床醫(yī)師對肺真菌感染認識不足[5]。

肺活檢組織病理學檢查是確診侵襲性肺部真菌感染的金標準[6-7]。參考侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)，對臨床侵襲性肺部真菌感染的診斷標準[7]比較發(fā)現(xiàn)，只要具有組織病理學診斷即可確診。獲取方法有支氣管鏡黏膜/新生物活檢、經(jīng)支氣管肺活檢、CT引導下經(jīng)皮-胸腔針刺肺活檢、外科肺活檢[8]，實驗選取病例均由以上方法收集。有些國內文獻多報道肺真菌感染主要為念珠菌肺炎[9-10]，原因是以痰或支氣管灌洗液真菌培養(yǎng)作為診斷標準，而念珠菌為人類口腔的正常定值菌，20%～55%正常人的痰液中可以分離出念珠菌屬。在非免疫缺陷患者侵襲性肺部真菌感染卻很少見，發(fā)病率為0.2%～4.5%[10]，導致誤診。本實驗以肺組織病理為標準，與國外報道[11-12]的診斷標準和肺部真菌感染曲霉菌占首位相一致。與國內近期文獻報道的結果：肺真菌感染以曲霉菌占第1位，其次為隱球菌和毛霉菌，念珠菌肺炎少見[13]也相符合。上述文獻均支持病理學檢查是確診該病的金標準。

對非腫瘤性肺疾病，按通常診斷順序與原則，首先觀察HE染色切片，在此基礎上來決定是否需做特殊染色，六胺銀及PAS染色常用來顯示多數(shù)真菌[8]。光鏡下，HE染色曲霉菌菌絲呈淡紫色，菌絲壁淡紫藍色。也可用PAS染色，把菌絲染成品紅色，理想的方法是用六胺銀染色，可把菌絲染成棕黑色，少量的菌絲也易發(fā)現(xiàn)。HE染色也著染毛霉菌，PAS染色染色不佳，六胺銀染色能很清晰地顯示菌絲。在切片上曲霉菌和毛霉菌有時不易鑒別，特別是當毛霉菌的菌絲較狹窄，而菌絲里見到一些橫隔的情況。一般來說，曲霉菌菌絲具有二叉型分支，直徑較小，菌絲壁平行，有橫隔，用六胺銀法染色也較深[14]。隱球菌菌體HE染色呈淡紅色或不著色，菌體外有透明區(qū)。常規(guī)HE染色下隱球菌易漏診，PAS染色、GMS染色可提高陽性率[15]。肺孢子菌的HE染色見包囊壁不著色，呈透明的暈圈狀，鑒別較為困難，一般加以六胺銀染色，肺孢子菌包囊壁棕到黑色，結構顯示清楚。而白色念珠菌HE染色其芽生孢子和假菌絲呈淡藍色，兩者同時見到才可以診斷。特別是急性期或陳舊性病灶更難兼?zhèn)?，需多方法?lián)合診斷[14]。所以真菌在組織中用HE染色一般著色不佳，不留心觀察易漏診，因此需用特殊染色法顯示，最常用的是PAS和六胺銀[16]。只有當真菌數(shù)量多到一定程度時HE染色法才可以鑒別，所以漏診幾率很大，六胺銀和PAS特殊染色作為輔助診斷必不可少。

兩種實驗方法結果與最終病理診斷結果真菌類型分布順序一致，具有參考意義。從技術規(guī)范化比較可以觀察到全自動特殊染色法染PAS和六胺銀明顯優(yōu)于傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀。因為后者操作步驟復雜，對于操作者的技術要求高，化學試劑如六胺銀染色部分還需人工配制，染色過程暴露于外界，染色效果需鏡下觀察、控制。結果受人工和環(huán)境因素影響，脫片和復染數(shù)大于前者，分別超出2例和8例，易造成誤差或失誤，缺乏嚴謹性。且前者脫片的2例，同于后者，說明與組織本身有關，與實驗方法無關，側面驗證了前者結果的精準性。另外，染色效果不佳也是后者復染數(shù)多的主要原因(PAS 1張、六胺銀5張)。在傳統(tǒng)手工特殊染色法中，PAS染色步驟較簡單，影響因素較少，實驗結果相對穩(wěn)定[17]，但染色的敏感性稍不如六胺銀染色。從染色原理分析：可能是六胺銀染色中的鉻酸比PAS的過碘酸有更強的氧化能力，暴露出更多的醛基[18]。所以使得它更活躍而不易操作，如果溫度過高或者染色時間過長都會使結締組織著色太深，影響染色質量，影響結果的觀察[17]，需每隔10 min鏡下觀察染色情況，因此耗時更長而不精準，特別是染色張數(shù)較多時。同樣傳統(tǒng)手工PAS染色耗時差異也較大，較高溫度時為10 min，較低溫度(冬季)為20 min左右。這些都是導致后者用時更長的原因，如有復染更延遲了出結果的時間。

特殊染色技術在相當一段時間對病理常規(guī)染色是一種輔助，在幫助病理醫(yī)師完成病理診斷方面發(fā)揮著巨大作用[19]。但在化學試劑的購置、貯存、保管、使用、等方面存在許多問題。同時自行配置各類染色試劑，還受技術人員經(jīng)驗、技巧、能力及病理科規(guī)模，試劑使用周期等因素的影響，差別較大。而商品化試劑的使用會使特殊染色技術走向標準化、規(guī)范化，使操作變得簡單、快捷、精準。全自動特殊染色法染PAS和六胺銀使用了商品化試劑盒，不僅保證了結果的準確性，更加具有規(guī)范化和穩(wěn)定性。再聯(lián)合HE染色，對于肺真菌感染性疾病，無論從確診率還是分型率，均比傳統(tǒng)手工特殊染色法高，分別高出7.7%(8例)和6.7%(7例)。因此對該病的診斷是有意義的，有助于提高真菌感染的確診率和分型率。

隨著病理技術的發(fā)展，HE染色技術引用了全自動染色封片工作站，免疫組化染色也早已運用了全自動免疫組化染色儀，這些都為病理科實現(xiàn)標準化和質量控制提供便捷而可靠的工具，為臨床病理診斷提供有力依據(jù)，對病理實驗室的國際標準化發(fā)展接軌也起到重要作用。所以全自動特殊染色系統(tǒng)的運用也會是病理特殊染色技術發(fā)展的必然趨勢。但由于試劑成本較高，對比國內組織化學特殊染色病理收費低的情況，阻礙了其推廣和發(fā)展。而對于病理診斷它實現(xiàn)了傳統(tǒng)手工特殊染色法向標準化、規(guī)范化的轉型，提高了病理報告的精準性，縮短了發(fā)報告的時間，為臨床快速制定有效的治療方案給予了極大的幫助，值得提倡。

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Significance of standardized special staining technology for pathological diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases

LIU Fei-fei, LI Xue, JIN Mu-lan
(DepartmentofPathology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Purpose To explore the significance of the application of standardized special staining technique in pathologic diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases. Methods Final pathologic diagnosis of 104 cases pulmonary fungus infection disease in Beijing Chaoyang hospital from September 2011 to March 2016 were selected; HE staining only, HE staining combined with the traditional manual special staining method PAS and hexamine silver, and HE staining combined with automatic special staining PAS and hexamine-silver were used and compared. The two kinds of special staining technology were compared; the microscopic observation, analysis results (all the first staining results, not including the results of complex staining), the results on the basis of final pathologic diagnosis were also compared with the clinical preliminary diagnosis. Results Lung fungal infectious disease diagnosis rate and fungal classification rate, from low to high order consistence, showed that for the primary clinical diagnosis (29.8% and 19.2%), HE staining (32.7% and 32.7%), HE staining combined with traditional manual special staining method PAS and hexamine silver (90.4% and 87.5%), and HE staining combined with auto-matic special staining PAS and hexamine-silver (98.1% and 94.2%). The four methods were statistically significant on two aspects (P<0.01,P<0.01); the fourth method was significantly different from the first two (P<0.01,P<0.01). The fourth method was significantly different from the third kind of diagnosis rate (P<0.05), typing rate was no significant difference (P>0.05). But automatic special dyeing method of PAS and hexamine silver steps were more simple, with standardized chemical reagents, no artificial and environmental factors, short time-consuming, and less number of dropping-off and restaining of the section. Conclusion HE staining and its combination with automatic special staining of PAS and hexamine silver are much more standardized, and help to improve the diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases and fungal classification rate.

lung diseases; automatic special staining; standardization; fungi

首都醫(yī)科大學附屬朝陽醫(yī)院病理科，北京 100020

劉菲菲，女，技師。E-mail: suiyinglff0123@126.com 金木蘭，女，教授，博士生導師，通訊作者。Tel: (010)85231355，E-mail: kinmokuran@163.com

時間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.013.html

R 563；R 519

A

1001-7399(2017)06-0653-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.013

接受日期：2017-03-23