小麥莖稈截面參數顯微圖像測量系統(tǒng)

徐勝勇 段宏兵 李東臣 王令強 劉生銳 王怡田

(1．華中農業(yè)大學工學院，武漢430070;2．華中農業(yè)大學植物科學技術學院，武漢430070)

小麥莖稈截面參數顯微圖像測量系統(tǒng)

徐勝勇1段宏兵1李東臣1王令強2劉生銳1王怡田1

(1．華中農業(yè)大學工學院，武漢430070;2．華中農業(yè)大學植物科學技術學院，武漢430070)

小麥的抗倒性與其莖稈截面顯微結構密切相關，莖稈微觀結構的觀測和分析對小麥遺傳育種具有重要意義。研究了一種顯微圖像測量系統(tǒng)，用于精確測量小麥莖稈截面的主要參數。使用計算機、圖像采集室、光學顯微成像系統(tǒng)等搭建了硬件平臺，并開發(fā)了算法軟件。系統(tǒng)針對莖稈截面的顏色和結構特點，對顯微圖像進行預處理得到髓腔、厚壁的輪廓，再進行橢圓擬合以計算截面整體、髓腔和厚壁的幾何參數。根據維管束結構的一致性，提出了一種具有尺度、平移和旋轉不變性的模板匹配方法，用于在目標圖像中識別維管束并統(tǒng)計數量。實驗表明該自動化測量系統(tǒng)具有高通量和高精確度的優(yōu)點，在作物重要資源的挖掘和群體遺傳等研究中具有重要的價值。

小麥莖稈;顯微圖像;測量系統(tǒng);高通量;模板匹配

引言

在小麥生育中后期，局部或大面積的倒伏嚴重影響小麥成熟，降低產量和品質。小麥的抗倒性是目前研究中的難點和熱點。越來越多的研究表明，作物莖稈的力學特性與其截面顯微結構密切相關［1］。小麥莖稈機械組織細胞層數、厚度，維管束數目、面積以及髓腔大小與抗倒性密切相關［2］。決定玉米莖稈抗壓強度的主要因素為纖維素含量、木質素含量和單位面積維管束個數［3］。馮素偉等［4］從小麥的外部形態(tài)、內部顯微結構及生理性狀等方面綜合分析小麥莖稈的抗倒伏性，結果發(fā)現稈壁較厚，莖稈截面積較大的小麥品種抗倒性較強。王健等［5］對3種不同品種的小麥莖稈顯微結構進行了分析，認為莖稈外徑和壁厚之比、厚壁組織比例、單位面積上大維管束平均數目和纖維素含量是影響小麥品種莖稈機械強度的4個主要因素。秸稈理化結構特性不僅與倒伏性能及其綜合利用有關，而且其維管束系統(tǒng)擔負輸送水分、無機鹽和有機養(yǎng)料的重要作用，影響產量、品質和養(yǎng)分利用效率等重要農藝性狀，重要性不言而喻。但這些莖稈相關性狀分析費時費力，嚴重制約了其遺傳改良的研究，急切需要高通量、平行性好、精確度高的自動化分析系統(tǒng)。

當前，使用顯微圖像分析技術研究微觀結構已成為趨勢。何春霞等［6］使用Hitachi S-4800型掃描電鏡(日本日立株式會社)對3種表面處理和未處理的麥秸稈試樣表面形貌進行觀察，探討酸、堿、水熱處理對麥秸稈微觀結構的影響。李勇等［7］將脫模方法與顯微圖像處理結合，實現了微小孔內部輪廓的尺寸形狀測量。顯微圖像分析在生物、農業(yè)等領域被廣泛應用于特殊細胞的識別，魯勁松等［8］設計的全自動分析儀可以對細胞DNA指數進行測量，并識別和統(tǒng)計突變細胞。張榮標等［9］對采集的圓褐固氮菌微視圖像進行預處理和特征提取，并運用支持向量機(SVM)進行識別、分類和計數，獲取圓褐固氮菌的濃度。對植物莖稈微觀結構的測量和分析也被研究，如PIECZYWEK等［10］比較了3種不同的基于顯微圖像分析的植物組織的5種幾何參數提取方法，使用這些參數化可以建立模擬生物細胞結構的機械特性模型。TING等［11］使用X射線斷層掃描儀獲取蘋果的孔隙率和薄壁組織的結構分布的二維和三維圖像，根據圖像的形態(tài)和紋理特征研究了不同品種蘋果的微觀組織結構、機械強度、口感的差異。劉杏娥等［12］使用LEICA CW4000自動成像系統(tǒng)，采用顯微圖像分析方法對撐綠雜交竹主要解剖特征進行研究，測量了纖維長度、腔徑、雙壁厚、長寬比、壁腔比及腔徑比的平均值等多種參數。DEVAUX等［13］使用番茄切片的顯微圖像，提取和分析果皮組織的紋理和尺寸信息，根據細胞長度統(tǒng)計信息番茄的遺傳特性。MUSSEA等［14］對成熟度不同的番茄進行磁共振成像(MRI)，獲取不同的圖像類型以研究宏觀和微觀結構變化，識別番茄的空氣空間、果皮中的氣泡、核心、胎盤等以判定果實的成熟度。實用化的顯微圖像分析軟件系統(tǒng)也被開發(fā)，如DHONDT等［15］開發(fā)的轉基因擬南芥葉片圖像分析軟件，可以在線跟蹤觀察和分析葉片的尺寸、脈絡、管道等性狀。PIECZYWEK等［16］計算顯微圖像中目標的面積、周長、圓形度、形狀粗糙度等參數，并開發(fā)了用于蘋果組織的細胞和細胞間隙的自動分類軟件。小麥的宏觀表型性狀提取經常被研究，如SIRAULT等［17］使用小麥葉片橫截面的骨架圖像計算平均曲率以描述葉片的卷曲度，以此建立葉片的卷曲傾向和基因變異的規(guī)律。但目前在小麥的秸稈顯微分析方面，缺乏全面而實用的植物莖稈截面顯微圖像分析軟件。

本文研究一種小麥莖稈截面圖像分析系統(tǒng)，基于數字圖像處理技術獲取莖稈截面顯微結構的主要幾何參數，包括莖稈截面的整體寬度、厚壁尺寸、髓腔尺寸和大維管束的數量。該測量系統(tǒng)可為客觀準確地分析小麥的顯微結構與抗倒性之間的關系提供基礎參數。

1 材料和方法

1.1 小麥莖稈截面電子顯微圖像

小麥、水稻等作物莖稈的二級結構可以看作是由許多不同的組織構成的中空管狀結構，如圖1所示為小麥莖稈截面的電子顯微圖像(放大20倍)，主要結構包括厚壁機械組織 (Sclerenchyma mechanical tissue)、小 維 管 束 (Small vascular bundle)、大維管束(Big vascular bundle)、基本薄壁組織(Parenchyma cells)和髓腔(Medullary cavity)。莖稈截面可以分為兩部分:由厚壁機械組織和小維管束構成的緊密層;由薄壁組織和大維管束構成的稀疏層。這兩部分對小麥莖稈的力學特性貢獻不同。在緊密層中厚壁機械組織和小維管束的細胞直徑較小、密度高、排列整齊，特別是細胞壁加厚、木質化程度高，這些特點對莖稈的支撐、彎折的物理特性起著決定作用。大維管束和薄壁組織構成的疏松層是莖稈的主要組成部分，其中薄壁細胞占莖稈橫截面比例最大，在60%～80%之間，這些細胞的特點是直徑大、細胞壁薄，起著連接維管束和厚壁機械組織的作用。本文將使用圖像處理技術對莖稈顯微圖像中的主要組織結構參數進行精確測量。

圖1 小麥莖稈橫截面模型Fig．1 Model of cross-section in wheat stem

1.2 顯微圖像測量系統(tǒng)整體結構

測量系統(tǒng)結構示意圖如圖2所示。測量系統(tǒng)硬件包括實驗平臺、光學顯微鏡成像系統(tǒng)(本文中使用Coosway CSW-T1000A型顯微測量顯示系統(tǒng)，分辨率為4 140像素×3 096像素)、計算機(i5 4200M 2.5 GHz、8 G DDR3內存、250 G三星固態(tài)硬盤、NVIDIA GeForce GT 755M顯卡)和恒光源圖像采集室。圖像采集室是一個帶側門的箱體，頂部安裝有LED燈用于產生穩(wěn)定的光照條件。光學顯微鏡通過儀器支架固定在采集室的頂部，鏡頭垂直向下對準標本。實驗員將制作好的莖稈標本放置于升降平臺上，啟動計算機驅動相機，調節(jié)相機鏡頭使之對焦清晰。軟件系統(tǒng)結構圖如圖2b所示，軟件系統(tǒng)提供了硬件設備的連接和控制功能、人機界面和算法軟件，軟件配置為Windows 10 專 業(yè) 版、VS2013 旗 艦 版 和OpenCV3.1.0。在人機界面中連接和控制相機工作，拍攝標本的顯微圖像，并保存為bmp格式文件。顯微圖像分析結果被保存為txt文件或輸出到人機界面的顯示窗口。

圖2 測量系統(tǒng)結構示意圖Fig．2 Structure diagram of themeasurement system

1.3 信息測量軟件模塊

1.3.1 整體和髓腔尺寸

顯微圖像處理中的度量單位是像素，需要轉換為物理尺寸單位，本文中為微米(μm)。使用C++編寫人工交互的標定程序，標定程序執(zhí)行流程為:手動輸入標尺物理長度L(本文中為500μm);手動選取包含標尺的矩形框，算法將自動檢測區(qū)域中的直線段，最長直線段的像素個數為N0;尺寸標定參數自動被計算并存儲，計算公式為

式中 C——尺寸轉換因子，μm/像素，文中計算值為1.37μm/像素

圖3 計算髓腔和整體尺寸的流程圖Fig．3 Flow chart of geometric dimensioning calculation ofmedullary cavity and entirety

莖稈的整體亮度低于背景屏，且處于圖像的中心。因此，以圖像中心點定義一個邊長為40像素的正方形子圖像，計算灰度平均值再乘以0.9，作為圖像分割的閾值。如圖3所示為整體和髓腔尺寸計算的算法流程圖及分步結果。彩色的電子顯微圖像被轉換為灰度圖像，且經過中值濾波去除孤立的噪聲點，并平滑輪廓的邊緣。經過固定閾值分割之后得到一幅二值圖像，髓腔區(qū)域完全被分離出來。使用Canny算子檢測二值圖像的邊緣并搜索二值圖像中的輪廓并統(tǒng)計輪廓的長度。顯然，髓腔和莖稈截面邊緣是長度最大的2個輪廓，以此特性篩選出對應的輪廓。髓腔和截面邊緣都近似于一個橢圓，對長度最大的2個輪廓使用最小二乘法擬合橢圓，將最逼近髓腔和截面邊緣的橢圓求出［18］。最后，根據擬合橢圓的參數，長短軸最大的橢圓用于計算整體尺寸，長短軸次之的橢圓用于計算髓腔尺寸。

1.3.2 厚壁厚度

維管束與厚壁組織的整體灰度值接近且緊鄰厚壁組織，同時薄壁組織之間存在的間隔組織的灰度值也較小，如果直接進行閾值分割，某些維管束和間隔組織將被錯誤地分割為厚壁組織，形成內側的突起，降低厚壁厚度的檢測精度，如圖4紅色箭頭指向的小圖所示。厚壁厚度的算法流程與分步結果如圖4所示。先對圖像使用尺寸為5像素×5像素的中值濾波模板，消除孤立的小區(qū)域噪聲;再使用尺寸為21像素×21像素的中值濾波模板，模糊圖像以消除間隔組織形成的條紋。使用自適應閾值分割轉換為二值圖像［19］，厚壁組織被分割為黑色區(qū)域，同時粘連有一些維管束區(qū)域，形成一些突起。定義一個較大的結構元素(尺寸為16像素×16像素、形狀為橢圓)對二值圖像進行“開”操作，割斷厚壁內側的大部分突起。繼而檢測圖像中的輪廓，而厚壁內外側邊緣形成的2條輪廓具有最大長度，依據此規(guī)律對輪廓進行篩選，僅保留最長的2條輪廓。厚壁的內外側邊緣都接近于一個橢圓，使用最小二乘法擬合橢圓。厚壁厚度的計算公式為

式中 a1、a2、b1、b2——長短軸最大的2個擬合橢圓的長短軸長度

圖4 計算厚壁厚度的流程圖Fig．4 Flow chart of depth calculation of sclerenchyma

1.4 基于模板匹配的維管束數量統(tǒng)計

大維管束作為小麥莖稈的重要單元分布在薄壁細胞中，里面由韌皮部、木質部、導管、篩管組成，外面由部分厚壁細胞包圍。同類作物的維管束結構非常相似，如小麥莖稈的維管束，從宏觀上觀察其外形是圓形，中心區(qū)域有3個小氣泡，被網狀薄壁組織環(huán)繞。模板匹配是一種常用的模式識別方法，用于在待檢圖像I(x，y)(分辨率為M像素×N像素)中識別出與基準模板圖像(分辨率為m像素×n像素)相似度高的區(qū)域［20］。模板匹配適用于具有固定結構的維管束的識別。模板匹配算法中，歸一化平方差匹配法具有很好的匹配速度和精度，該算法對相似度的描述為

R(x，y)——兩幅圖像的相似度

R(x，y)越小，表示差異越小，匹配程度越高。

維管束的結構相似，但大小、姿態(tài)各不相同。為此提出了一種自適應模板匹配方法，即從一幅顯微彩色圖像中截取一個包含維管束的矩形子圖像，作為模板基準圖像，再對模板圖像進行旋轉和縮放，構成一個模板圖像集合，再進行模板匹配。算法原理與分步結果如圖5所示。詳細步驟如下:

(1)創(chuàng)建模板圖像集合

圖5 維管束數量統(tǒng)計流程圖Fig．5 Flow chart of count of vascular bundle

(2)進行模板匹配

①使用第1幅模板對待檢圖像進行模板匹配，從I(x，y)的原點(0，0)開始，切割一塊從(0，0)至(m，n)、尺寸為 m像素 ×n像素的臨時圖像，用式(3)計算相似度，記為f(0，0);切割從(0，1)至(m，n+1)的臨時圖像，計算相似度，并記為f(0，1);重復，直至得到f(M－m，N－n)。②創(chuàng)建一個空白圖像G(x，y) (分辨率為M像素×N像素，每個像素點的灰度設置為255)，對全部相似度構成的集合{f(0，0)，…，f(M－m，N－n)}按像素大小進行排序，取匹配程度最高的H個f(H取值一般為8～10)，將G(x，y)中對應的像素坐標的灰度置為0。③使用第2幅模板對圖像I(x，y)進行匹配，重復步驟①～③。

(3)維管束數量統(tǒng)計

①將G(x，y)中灰度為零的像素點擴展成一個實心圓(半徑一般為3～5像素)，將相距較近的最佳匹配點聚集為一個連通域，對應于一個大維管束。②檢測連通域的個數，即為維管束數量。

2 實驗結果與分析

2.1 幾何參數測量實驗

為評價本文算法的有效性和準確性，測量了10個小麥莖稈顯微圖像樣本，將人工測量結果與本文算法測量結果進行比較。使用畫圖工具打開顯微圖像，以30°為間隔在莖稈截面上選取測量點，取12次的平均值作為真實值，計算莖稈的髓腔尺寸、整體尺寸和厚壁厚度。使用均方根誤差(RMSE)和平均相對誤差(MRE)來描述測量精度。R2是決定系數，實驗結果如表1所示。從結果看，髓腔尺寸的RMSE和MRE分別為20.85像素(28.56μm)和 6.0%;整體尺寸的RMSE和MRE分別為20.63像素(28.26μm)和1.8%;厚壁厚度的RMSE和MRE為5.43像素(7.44μm)和14.3%。結果表明，本文的自動測量系統(tǒng)具有較高的精度。厚壁厚度測量結果誤差較大，歸因于粘連在厚壁上的小維管束未被徹底分離，在厚壁內側形成突起而導致測量結果偏大。

表1 幾何尺寸測量結果Tab．1 Results of geometric dimensioningmeasurement

2.2 維管束數量識別實驗

維管束的識別是自動測量系統(tǒng)的難點。模板圖像集合中的每一個模板都要與待檢圖像進行模板匹配，因此模板圖像的數量(由模板式樣、縮放級數、旋轉角3種因素共同決定，見1.4節(jié))直接影響算法的執(zhí)行速度。此外，模板匹配是逐個像素進行的，圖像的分辨率對算法的執(zhí)行速度影響很大。人工統(tǒng)計10幅顯微圖像中維管束的總數量為243個。為了直觀地展示不同因素對算法性能的影響，以圖像分辨率為518像素×387像素(原圖像的1/8)、模板式樣為1、縮放級數為7、旋轉角為2°時，10幅測試圖像的平均真實執(zhí)行時間(9.5 s)為基準時間，將算法執(zhí)行時間除以9.5 s得到耗時比。實驗中，算法的執(zhí)行時間包含了圖像壓縮時間。以下實驗結果均是在僅改變某一個參數、其他參數不變的條件下獲得的:

(1)模板數量對算法性能的影響

從顯微圖像的不同位置處人工截取包含維管束的矩形子圖像，得到多個不同式樣的模板圖像。實驗結果如圖6a所示，模板式樣的增加對算法準確率的提升基本沒有作用，但耗時會同比例增加。由此可見，對于同一個品種的農作物，只需一個模板式樣即可保障維管束數量的識別準確率。

實驗中設定的縮放比例變化幅度為0.1。測試了12級縮放(縮放比例為0.4～1.5)到1級縮放(不縮放)對性能的影響，結果如圖6b所示。實驗結果表明，縮放級數和算法耗時成近似的正比例關系，級數越大，耗時越長?？s放級數大于7時，檢測精度保持100%不變;縮放級數小于7(縮放比例為0.6～1.2)時，檢測精度下降。

實驗中設定旋轉角變化幅度為0.5°，按此變化幅度，旋轉角從0.5°起，依次遞增至6°，測試了12級角度變化對性能的影響，結果如圖6c所示。實驗結果表明，旋轉角和算法耗時成反比例關系，旋轉角越大，耗時越短。旋轉角小于2°時，識別率保持不變;旋轉角大于2.5°時，識別準確率開始下降;旋轉角大于3°時，識別準確率急劇下降。

圖6 維管束數量統(tǒng)計實驗結果Fig．6 Results of vascular bundle counting

(2)圖像分辨率對算法性能的影響

圖像壓縮率指經過重采樣，圖像的長和寬分別降低為原來的百分比。測試了不同圖像壓縮率下本文算法的執(zhí)行時間，結果如圖6d所示。實驗結果顯示，算法耗時與圖像分辨率有近似的平方正比例關系，分辨率降低，耗時平方減少;但圖像分辨率過低，識別率會急劇下降，這是因為圖像壓縮之后維管束細節(jié)變得模糊，匹配錯誤顯著增大。

3 結束語

以小麥為例研究了莖稈顯微圖像的幾何參數測量問題。針對小麥莖稈中各種組織的結構和顏色等特征，設計了針對性的圖像處理算法，實現了對髓腔大小、整體尺寸和厚壁厚度等關鍵參數的精確測量。使用該自動測量系統(tǒng)，10幅圖像測量時間為145 s，每幅圖像平均耗時14.5 s。技術人員對10幅圖像進行人工測量約需45min，每幅圖像平均耗時270 s。因此，本算法的效率是手動測量方法的18倍。在自動測量中，通?；ㄙM大約2 s來手動讀入圖像，剩余時間是計算機的計算時間。如果需要進行大量的顯微圖像測量，可以對待檢圖像進行統(tǒng)一命名并修改程序，使得測量可以連續(xù)進行以節(jié)省時間。對于維管束數量的統(tǒng)計，提出了一種改進的模板匹配算法精確有效地識別出維管束的位置和數量。模板匹配算法的執(zhí)行耗時與模板數量和待檢圖像分辨率密切相關，適當地壓縮圖像分辨率，可以保證識別精度的同時大幅提高計算速度。模板圖像集合的創(chuàng)建中，縮放級數過小或旋轉角過大，都將導致檢測的維管束數量大于實際值，這是因為此時匹配成功的像素點過少，二值結果圖像中存在孤立的連通域被錯誤檢測為維管束。使用較大的縮放級數和較小的選擇角度，可以保障算法對維管束的尺寸和角度變化的適應性。

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Measurement System for Parameters of Wheat Stem Section Based on Microimage Processing

XU Shengyong1DUAN Hongbing1LIDongchen1WANG Lingqiang2LIU Shengrui1WANG Yitian1
(1．College of Engineering，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China 2．College of Plant Science＆Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

Lodging resistance of wheat is closely related to its stem section microstructure．Observation and analysis of stem microstructure are of great significance for the genetic breeding．Amicroscopic image measurement system was studied，which could be utilized to measure the main parameters of the wheat stem section accurately．The equipment including computer platform，image acquisition box and electronic microscopy imaging system etc．was used to build the hardware platform and the algorithm software was developed．According to the characteristics of the stem structure and color，the contours of both mechanical tissue andmedullary cavity were obtained using image processing procedures．After then the geometrical parameters of the whole section，medullary cavity and sclerenchyma were calculated by the ellipses fitting．Based on the uniformity of the vascular bundle structure，an original template matchingmethod was proposed．Thismethod was invariant to scaling，translation and rotation，which was used to identify and count the vascular bundle in the target image．It showed that this automated measurement system was of high throughputand high precision．The system will play an important role in both the screening of important crops resources and population genetic research．

wheat stem;microimage;measurement system;high throughput;templatematch

TP391.41

A

1000-1298(2017)07-0046-07

2016-11-16

2016-12-14

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(2662015PY078、2662015PY009)、國家自然科學基金項目(61503146)和國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(201510504059)

徐勝勇(1980—)，男，講師，博士，主要從事計算機視覺和農業(yè)機器人研究，E-mail:xsy@mail．hzau．edu．cn

段宏兵(1969—)，男，副研究員，博士，主要從事種植與收獲機械研究，E-mail:duanhb@mail．hzau．edu．cn

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．006