哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因多態(tài)性分析

鞏養(yǎng)倉(cāng)，張雪林，吳建勇，張興平，彭凡嘉，張志剛，賀云新，梅正鼎，周德桂，邢朝柱*

(1.湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南常德415101；2.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000)

哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因多態(tài)性分析

鞏養(yǎng)倉(cāng)1，張雪林1，吳建勇2，張興平1，彭凡嘉1，張志剛1，賀云新1，梅正鼎1，周德桂1，邢朝柱2*

(1.湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南常德415101；2.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000)

【目的】研究棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的相關(guān)線粒體基因?！痉椒ā坷镁€粒體基因atpA、atp6、atp9、cob、coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ、nad3、nad6、nad9探針，對(duì)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系S、保持系F、雜種一代H進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。【結(jié)果】atpA、coxⅢ、nad3、nad6在3個(gè)材料間具有多態(tài)性。atpA、nad6基因探針與所有酶的雜交結(jié)果均顯示出多態(tài)性，且在不育系與雜種一代中表現(xiàn)一致，而在保持系中差異明顯。atpA/EcoRⅠ在3個(gè)材料中的雜交結(jié)果均顯示2條帶，其中1條2.2 kb的雜交帶在3個(gè)材料中相同，另一條在不育系和雜種一代中大小為3.2 kb，而在保持系中為4.8 kb；atpA/PstⅠ雜交結(jié)果中，在不育系和雜種一代中的條帶大小為17.0 kb，而在保持系中為10.2 kb。nad6探針與4個(gè)酶的雜交結(jié)果均為不育系和雜種一代比保持系多1～2條雜交帶。coxⅢ/EcoRⅠ在3個(gè)材料中均有1條2.5 kb的雜交帶，但在保持系與雜種一代中比不育系多1條1.7 kb的弱帶。nad3/BamHⅠ的雜交結(jié)果在不育系與保持系中表現(xiàn)一致，而在雜種一代中缺少1條9.5 kb的雜交帶?！窘Y(jié)論】推測(cè)atpA、nad6基因參與調(diào)控不育系的形成，而coxⅢ、nad3可能受到恢復(fù)系核基因的調(diào)控，在不育系育性恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮較為重要的作用。

棉花；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；線粒體基因；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

利用二倍體野生棉——哈克尼西棉(Gossypium harknessiiBrandegee)育成的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（Cytoplasmic male sterility，CMS）是首個(gè)棉花CMS品系[1]。目前已有多個(gè)哈克尼西棉三系雜交組合通過(guò)國(guó)家和省級(jí)審定，但因受恢復(fù)系來(lái)源狹窄和恢復(fù)能力不穩(wěn)定等影響，對(duì)其高優(yōu)勢(shì)組合的篩選十分困難，三系雜交種至今還未在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。因此，研究不育系形成機(jī)理，挖掘不育相關(guān)基因及其標(biāo)記，建立哈克尼西棉三系雜交棉分子標(biāo)記輔助育種體系，提高育種效率，成為高優(yōu)勢(shì)三系雜交棉選育的重要基礎(chǔ)。

很多研究[2-5]表明，線粒體基因與CMS密切相關(guān)。植物線粒體基因組在200～2900 kb[6]，包含atp、cox、nad、cob、rps、rrn、ccm等基因家族[7]。線粒體基因組功能非常復(fù)雜，存在正向或反向重復(fù)、重組重排、缺失或遷入、RNA編輯、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等，這些因素是CMS產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)[8-9]。Dewey等在T型胞質(zhì)玉米中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)CMS相關(guān)基因T-urf13，它編碼1個(gè)13 kDa的蛋白[10]，該蛋白聚集在線粒體內(nèi)膜上，參與膜孔組成[11]。在蘿卜[12]、向日葵[13]、水稻[14]、油菜[15]、辣椒[16]、小麥[17]等作物中均發(fā)現(xiàn)了與CMS相關(guān)的線粒體基因或開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）。在棉花上，王學(xué)德[18]對(duì)棉花線粒體蛋白質(zhì)和DNA分析發(fā)現(xiàn)，不育系線粒體DNA缺少1個(gè)與coxⅡ基因具有同源序列的1.9 kb片段，敗育時(shí)期不育系花藥線粒體缺少1個(gè)約31 kDa的多肽。李雙雙等[19]研究發(fā)現(xiàn),在atp4下游發(fā)現(xiàn)1個(gè)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)不育系特有的orf160，全長(zhǎng)480 bp，N端與atp6序列部分同源，C端序列與核序列部分同源，其編碼的159個(gè)氨基酸序列，與膜蛋白、細(xì)胞周期蛋白具有部分同源性。黃晉玲[20]對(duì)晉A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系線粒體基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析結(jié)果顯示，atp6和coxⅡ基因在兩系間存在差異。張曉等[21]對(duì)棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系104-7A與其保持系線粒體基因的RFLP分析顯示，atpA、atp9、ccmB、nad1bc、nad6、nad7c、rrn18等基因表現(xiàn)出了多態(tài)性。本課題組前期對(duì)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系[22]研究發(fā)現(xiàn)，atpA、nad6、coxⅢ基因表現(xiàn)出多態(tài)性。有研究[23-25]認(rèn)為，相關(guān)線粒體基因與核基因的共同作用影響細(xì)胞質(zhì)雄性不育的表達(dá)及育性恢復(fù)。雜種一代是CMS系與其恢復(fù)系的雜交后代，其線粒體基因來(lái)源于CMS系。本研究把雜種一代作為試驗(yàn)材料，與CMS系、保持系一并進(jìn)行RFLP多態(tài)性分析，研究可能參與棉花CMS形成的線粒體基因，為棉花CMS形成的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系S、保持系F及雜種一代H，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。不育系S來(lái)源于原始的哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)不育系DES-HAMS277，是以保持系F作父本經(jīng)多代嚴(yán)格授粉、性狀鑒定和多年株系選育而成，性狀穩(wěn)定。保持系F經(jīng)多年多代封花自交，株系篩選，性狀穩(wěn)定。雜種一代H是利用多年培育的恢復(fù)系與不育系S配制的雜交組合，可育度100%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總DNA提取。參考宋國(guó)立等[26]的方法提取試驗(yàn)材料葉片總DNA，并用RNase A對(duì)DNA進(jìn)行純化、干燥，溶于滅菌水，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度并稀釋?zhuān)?個(gè)材料濃度一致。

1.2.2引物設(shè)計(jì)。選擇10個(gè)線粒體基因atpA、atp6、atp9、cob、coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ、nad3、nad6、nad9，通過(guò)文獻(xiàn)查詢(xún)與軟件設(shè)計(jì)，針對(duì)每個(gè)基因選擇1對(duì)高特異性引物（表1），引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3線粒體基因片段擴(kuò)增。分別以S、F、H的總DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol· L－1each dNTP）0.4 μL，F(xiàn)wd primer（10 μmol·L－1）1 μL，Rev primer（10 μmol·L－1）1 μL，MgCl2（25 mmol·L－1）1.6 μL，TaqDNA polymerase（5×106U·L－1）0.2 μL，ddH2O 11.8 μL。擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃1 min，28個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。分離、回收保持系的擴(kuò)增特異條帶，連入pGEM-T easy vector，經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)分析。

表1 線粒體基因擴(kuò)增引物Table 1 Primer sequence for mitochondrial genes

1.2.4探針標(biāo)記。以連入基因片段的菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上，反應(yīng)體系放大為50 μL。回收特異條帶，測(cè)定回收基因片段濃度，采用地高辛標(biāo)記，操作參照“DIG high prime DNA labeling and detection starter kitⅠ”說(shuō)明書(shū)，每個(gè)基因探針制備10 μL，37℃孵育24 h，完成探針標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)記探針與試劑盒提供的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣各取1 μL，分別稀釋成1000、10、3、1、0.3、0.1、0.03和0.01 μg·L－18個(gè)質(zhì)量濃度梯度，依次點(diǎn)在尼龍膜上，1200 kJ紫外交聯(lián)3 min，超純水漂洗后，馬來(lái)酸平衡2 min，封閉30 min，抗體反應(yīng)30 min，洗滌2次，顯色，檢測(cè)探針標(biāo)記效率。根據(jù)標(biāo)記效率結(jié)果確定各探針用于Southern雜交的稀釋倍數(shù)。

1.2.5DNA酶切與分離。選擇限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、bsp143Ⅰ、EcoRⅠ、HindⅢ、HinfⅠ、PstⅠ、SacⅠ消化總DNA。根據(jù)擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果，結(jié)合酶切位點(diǎn)分析，針對(duì)每個(gè)探針選擇4種限制性?xún)?nèi)切酶（表2）。根據(jù)酶切效率試驗(yàn)結(jié)果，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SacⅠ反應(yīng)體系使用200 U，反應(yīng)時(shí)間12 h；bsp143Ⅰ和HinfⅠ反應(yīng)體系使用60 U，反應(yīng)時(shí)間4 h。酶切完成后，向各反應(yīng)體系中加入2.5 V的無(wú)水乙醇，置于－20℃0.5 h沉淀酶切產(chǎn)物，1×104r·min－1離心15 min，收集沉淀，真空干燥，溶于25 μL TE（Tris-EDTA）緩沖液中。酶切產(chǎn)物分離用0.5×TBE緩沖液制備12 g·L－1的瓊脂糖凝膠，上樣體系30 μL：25 μL酶切產(chǎn)物、5 μL上樣緩沖液 （溴酚藍(lán)為指示劑），電泳電壓2～3 V·cm－1，待溴酚藍(lán)跑出點(diǎn)樣孔約8 cm時(shí)停止電泳。熒光燈下檢測(cè)、拍照，切除Marker泳道和點(diǎn)樣孔。

表2 各探針對(duì)應(yīng)選擇的限制性?xún)?nèi)切酶Table 2 Restriction enzymes for each probe

1.2.6Southern雜交。參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)第六章方案8的操作方法[27]，將凝膠分離的酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間22 h左右。將轉(zhuǎn)移后的凝膠和緊貼尼龍膜的濾紙用EB染色檢驗(yàn)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)膜是否徹底。按照 “DIG high prime DNA labeling and detection starter kitⅠ”說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Southern預(yù)雜交、雜交、顯色、拍照。參照切除的Marker，確定顯色條帶大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增結(jié)果分析

以總DNA為模板，10對(duì)基因引物在3個(gè)材料中均擴(kuò)增出了單一條帶（圖1），回收保持系F的特異條帶，利用BLASTN V2.3.1+程序?qū)y(cè)序結(jié)果在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，這些片段與哈克尼西棉線粒體序列（JX944506.1）的一致性超過(guò)99%（表3），說(shuō)明選擇設(shè)計(jì)的引物特異性高，基因片段均被有效擴(kuò)增。

圖1 線粒體基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification for mitochondrial genes

表3 擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)哈克尼西棉線粒體基因序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Sequence alignment between PCR amplification and mitochondrial sequence of G.harknessiiBrandegee in NCBI database

2.2 探針標(biāo)記效率分析

探針標(biāo)記效率檢測(cè)結(jié)果表明，所有探針標(biāo)記效率都與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣相當(dāng)或者高于對(duì)照 （圖2），說(shuō)明探針標(biāo)記效率較高。比對(duì)標(biāo)記探針與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣樣點(diǎn)顯示亮度認(rèn)為，用于Southern雜交時(shí)，探針cob、coxⅠ稀釋30倍，探針atpA、coxⅡ、coxⅢ、nad6、nad9稀釋 10倍，探針atp6、atp9、nad3不稀釋。

2.3 Southern雜交結(jié)果分析

EB染色檢驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)膜徹底。Southern雜交結(jié)果顯示，10個(gè)基因探針都顯示了雜交信號(hào)。在40個(gè)探針／酶組合雜交結(jié)果中，30個(gè)探針／酶顯示較強(qiáng)的雜交信號(hào)，6個(gè)探針／酶雜交信號(hào)較弱，4個(gè)探針／酶沒(méi)有雜交信號(hào)；16個(gè)探針／酶顯示多個(gè)雜交信號(hào)，10個(gè)探針／酶在3個(gè)材料間表現(xiàn)出多態(tài)性（表4）。

圖2 探針標(biāo)記效率檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Probe labeling efficiency detection

不育系、保持系與雜種一代的雜交結(jié)果主要分為 4種類(lèi)型：（1）3個(gè)材料無(wú)差異類(lèi)型：atp6、cob、coxⅠ、coxⅡ、nad9所有的探針／酶組合，其條帶大小、亮度在3個(gè)材料間高度一致，說(shuō)明這些基因是哈克尼西棉線粒體中非常保守的基因，能夠穩(wěn)定遺傳。根據(jù)雜交結(jié)果和酶切位點(diǎn)分析，這5個(gè)基因在3個(gè)材料中均表現(xiàn)為單拷貝。因atp6探針序列內(nèi)含有2個(gè)相隔81 bp的HindⅢ酶切位點(diǎn)，atp6/HindⅢ表現(xiàn)為2條雜交帶。在內(nèi)切酶HindⅢ作用下，探針cob雜交結(jié)果除顯示1條1.2 kb的主帶外，還在3.0 kb處有1條弱帶；在內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ作用下，探針coxⅠ雜交結(jié)果除顯示1條主帶外，還分別在1.4 kb、18.0 kb出現(xiàn)1條弱帶，且3個(gè)材料表現(xiàn)一致，基因組中可能存在部分同源序列。（2）不育系與雜種一代一致、與保持系存在差異類(lèi)型：atpA、nad6基因在3個(gè)材料中均表現(xiàn)為多拷貝，且所有的探針／酶組合雜交結(jié)果均存在差異條帶 （圖 3）。at-pA/EcoRⅠ雜交結(jié)果中，1條2.2 kb的條帶在3個(gè)材料中相同，另一條差異條帶在保持系中為4.8 kb， 在不育系和雜種一代中為 3.2 kb；atpA/HindⅢ差異條帶在保持系中為11.0 kb，在不育系和雜種一代中為14.8 kb；atpA/PstⅠ雜交結(jié)果中，差異條帶在保持系為10.2 kb，在不育系和雜種一代中為17.0 kb；atpA/SacⅠ雜交結(jié)果中，保持系比不育系及雜種一代缺失1條大小2.8 kb的條帶。nad6探針與所有酶的雜交結(jié)果均表現(xiàn)為保持系比不育系及雜種一代缺失 1～2條帶，nad6/EcoRⅠ缺失7.5 kb、1.3 kb條帶，nad6/HindⅢ缺失12.0 kb、2.8 kb條帶，nad6/HinfⅠ缺失1.0 kb條帶，nad6/PstⅠ缺失15.0 kb、9.2 kb條帶。這表明atpA、nad6基因在后代與母系中能夠穩(wěn)定地遺傳，而在父系中存在一定的差異。atp9表現(xiàn)為單拷貝，在EcoRⅠ消化作用下，3個(gè)材料的雜交結(jié)果均顯示了大小相同的雜交帶（4.3 kb），但保持系的條帶亮度明顯高于不育系及雜種一代。（3）保持系與雜種一代一致、與不育系存在差異類(lèi)型：coxⅢ基因在3個(gè)材料中均表現(xiàn)為單拷貝，coxⅢ/EcoRⅠ在3個(gè)材料中的雜交結(jié)果均顯示1條2.5 kb的主帶，且在保持系與雜種一代中還顯示1條1.7 kb的弱帶（圖3）。（4）不育系與保持系一致、與雜種一代存在差異類(lèi)型：nad3基因在3個(gè)材料中表現(xiàn)為多拷貝，且具有多態(tài)性 （圖3）；nad3/BamHⅠ的雜交信號(hào)顯示：在20.5 kb處，3個(gè)材料均有較強(qiáng)的雜交信號(hào)；13.0 kb處，不育系與保持系有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，雜種一代的雜交信號(hào)很弱；9.5 kb處，不育系與保持系的雜交信號(hào)較強(qiáng)，而雜種一代沒(méi)有雜交信號(hào)。

3 討論

應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)尋找細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因，是目前最為常用的方法。作為傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)，RFLP結(jié)果可靠性強(qiáng)，是分析線粒體基因差異應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。本研究利用該技術(shù)篩選出了哈克尼西棉不育相關(guān)線粒體差異基因，而且在不育系、保持系、雜種一代3個(gè)材料間具有多態(tài)性，為棉花不育系相關(guān)線粒體基因的深入研究提供了重要基礎(chǔ)信息。但是這些差異是相對(duì)較為穩(wěn)定的DNA序列差異，且對(duì)差異序列的定位尚不精細(xì)，也尚未研究其在棉花中的時(shí)空表達(dá)差異，因此，需要對(duì)其進(jìn)一步研究。一方面，可通過(guò)測(cè)定側(cè)翼序列，尋找差異位點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的分子標(biāo)記，用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的改良及鑒定，輔助新品種選育；另一方面，可對(duì)差異基因進(jìn)行表達(dá)分析，進(jìn)一步揭示其與棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系。

表4 RFLP結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Summary of RFLP patterns

圖3 線粒體基因atpA、coxⅢ、nad3、nad6 Southern雜交結(jié)果Fig.3 Southern blot results of mitochondrial geneatpA,coxⅢ,nad3 andnad6

由線粒體基因組復(fù)制而引起的內(nèi)部重組或重排是序列獲得和缺失的主要原因，其中一些重組造成異常的ORF，這些ORF常與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)。此外，植物線粒體基因產(chǎn)生功能蛋白通常需要RNA編輯過(guò)程，如果這種編輯發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄本的變異，如轉(zhuǎn)錄本的提前終止或不能表達(dá)，導(dǎo)致基因的功能缺陷或喪失等，這也是造成不育的原因之一。線粒體作為植物的能量細(xì)胞器，在花粉發(fā)育中起至關(guān)重要的作用。線粒體atpA基因編碼腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）合酶亞基基因，ATP合酶參與線粒體膜上的腺苷二磷酸（Adenosine diphosphate，ADP）與Pi生成ATP，是能量形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。nad6基因是線粒體內(nèi)還原型輔酶Ⅰ（Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶亞基基因，NADH脫氫酶是1種氫傳遞體，把NADH轉(zhuǎn)變成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），釋放出游離的H+，在植物呼吸鏈中具有重要的作用[28]。atpA、nad6基因是植物線粒體序列突變相對(duì)較為活躍的基因[29-31]，如水稻線粒體35個(gè)蛋白的編碼基因存在26個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其中nad6基因含有11個(gè)[32]。本研究結(jié)果中，不育系的atpA基因與nad6基因序列與保持系存在差異，這種差異可能導(dǎo)致ATP合酶、NADH脫氫酶亞基氨基酸組成序列或結(jié)構(gòu)的變化，制約酶的功能發(fā)揮，從而影響花粉發(fā)育過(guò)程中的能量供應(yīng)而導(dǎo)致敗育。由于核質(zhì)互作效應(yīng)，細(xì)胞色素氧化酶亞基基因coxⅢ與NADH脫氫酶亞基基因nad3有可能在恢復(fù)系核基因的調(diào)控下發(fā)生堿基改變，導(dǎo)致雜種一代coxⅢ、nad3基因與不育系存在差異。推測(cè)coxⅢ、nad3基因在雜種一代基因表達(dá)和生理代謝過(guò)程中有可能參與調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的功能修復(fù)，從而恢復(fù)雜種一代育性。當(dāng)然，花粉發(fā)育是1個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，涉及到特定基因的時(shí)空表達(dá)和多基因的調(diào)控，任何1個(gè)基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化都可能引起花粉發(fā)育異常而導(dǎo)致雄性不育。因此，在棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的敗育機(jī)制和育性恢復(fù)機(jī)理方面，還需要開(kāi)展更深入、更廣泛、更系統(tǒng)的分子生物學(xué)研究。

4 結(jié)論

據(jù)對(duì)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系、雜種一代的多態(tài)性研究推測(cè)，線粒體基因atpA、nad6、coxⅢ、nad3與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)，atpA、nad6基因可能參與調(diào)控不育系的形成過(guò)程，coxⅢ、nad3基因可能受到恢復(fù)系核基因的調(diào)控，在不育系育性恢復(fù)機(jī)制中發(fā)揮較為重要的作用。

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Polymorphism Analysis of Mitochondrial Genes Associated Cytoplasmic Male Sterility in Cotton(Gossypium harknessiiBrandegee)

Gong Yangcang1,Zhang Xuelin1,Wu Jianyong2,Zhang Xingping1,Peng Fanjia1,Zhang Zhigang1,He Yunxin1, Mei Zhengding1,Zhou Degui1,Xing Chaozhu2*
(1.Hunan Cotton Research Institute,Changde,Hunan415101,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology/Institute of Cotton Research of the Chinese Academy of Agricultural Sciences,Anyang,Henan455000,China)

[Objective]Cytoplasmic male sterility (CMS)is closely associated with the mitochondrial genome.The aim of this study was to identify CMS-related mitochondrial genes in cotton.[Method]Ten mitochondrial gene probes(i.e.,atpA,atp6,atp9,cob,coxI,coxII,coxIII,nad3,nad6,andnad9)were used to analyze restriction fragment length polymorphisms in aGossypium harknessiiBrandegee cytoplasmic male sterile line(S),maintainer line(F),and hybrid(H).[Result]Ten probe/enzyme combinations for four probes(i.e.,atpA,coxIII,nad3,andnad6)revealed polymorphisms among lines S,F,and H.All enzyme digestions for two probes(i.e.,atpA andnad6)displayed the polymorphisms in three lines,with the same patterns for lines S and H.ForatpA,theEcoR I digestion revealed two fragments in the three lines.The 2.2 kb fragment was common to all three lines,while the second fragment was 3.2 kb in lines S and H,but 4.8 kb in line F.TheatpA/PstI combination produced a 17.0 kb fragment in lines S and H,but a 10.2 kb fragment in line F.Fornad6,one or two additional fragments of the same length were detected in lines S and H,while line F had more than two additional fragments.WithcoxIII as a probe,theEcoR I digestion resulted in a 2.5 kb fragment in three lines,as well as a 1.7 kb fragment in lines F and H,but not in line S.With thenad3 probe,the same patternswere observed for lines S and F,while the pattern for line H differed because of a lack of a 9.5 kb fragment.[Conclusion]BothatpA andnad6 are involved in regulating the development of CMS,whilecoxIII andnad3 may be regulated by nuclear genes to help restore fertility in cytoplasmic male sterile lines.

cotton;cytoplasmic male sterility;mitochondrial genes;restriction fragment length polymorphism

S562.03

A

1002-7807（2017）04-0327-09

10.11963/1002-7807.gycxcz.20170630

2016-07-04

鞏養(yǎng)倉(cāng) （1981―），男，副研究員，碩士，mksgyc@163.com。*通信作者：chaozhuxing@126.com

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育（2014ZX08005001-007）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃——棉花種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用（2013BAD01B03-05）