綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA表觀遺傳變化的甲基化敏感擴增多態(tài)性分析

錢森和，洪亮，魏明，林毅，蔡永萍

(1.安徽工程大學生化學院，安徽蕪湖241000；2.安徽農業(yè)大學生命科學學院，合肥230036)

綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA表觀遺傳變化的甲基化敏感擴增多態(tài)性分析

錢森和1,2，洪亮2，魏明1，林毅2，蔡永萍2

(1.安徽工程大學生化學院，安徽蕪湖241000；2.安徽農業(yè)大學生命科學學院，合肥230036)

【目的】分析綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA甲基化狀態(tài)差異?！痉椒ā坷?組限制性內切酶EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ對綠絮棉1號纖維基因組甲基化位點進行識別和切割，并采用甲基化敏感擴增多態(tài)性引物對切割產物進行擴增，分析基因組內5'-CCGG-3'位點的甲基化狀態(tài)；同時對擴增的差異片段進行測序，分析其生物學功能?！窘Y果】66對甲基化敏感擴增多態(tài)性引物共擴增出4112個條帶；平均每個樣品共擴增出822.4個帶型，平均每對引物擴增出12.46個片段。隨著綠色棉纖維的發(fā)育，甲基化條帶總數(shù)、甲基化條帶比率、全甲基化條帶百分比均逐漸升高；其中，開花后10、15、20和25 d時甲基化條帶總數(shù)分別比開花后5 d時增加11.45%，13.86%，20.10%和33.13%。與開花后5 d相比，開花后10、15、20和25 d時纖維DNA發(fā)生甲基化變化位點的比例分別為3.15%，3.43%，3.65%和2.52%；而去甲基化位點的比例分別為12.87%，14.72%，13.31%和48.81%。通過測序和Blast分析表明，17個片段與已知的功能基因同源性較高，包括棉花線粒體基因組、絲氨酸蛋白酶基因和酯酶基因，且這些基因均在開花后25 d發(fā)生去甲基化。【結論】綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA發(fā)生了甲基化與去甲基化現(xiàn)象。

綠色棉；纖維發(fā)育；表觀遺傳；甲基化敏感擴增多態(tài)性分析

綠色棉是實行商業(yè)化應用的天然彩色棉兩大色系中的1種，其纖維細胞分化突起與白色棉相同，但突起時間較遲，早期伸長較慢，且較早就停止伸長，從而造成了綠色棉纖維最終長度較短[1-2]。另外，綠色棉纖維素含量低于普通白色棉，但其積累規(guī)律同樣呈不對稱的S型增長曲線[3]。天然綠色棉纖維中纖維素積累的最大增長速率低，快速增長期的積累速率低、持續(xù)時間短不利于纖維素積累[4]。由此，綠色棉纖維生長發(fā)育規(guī)律已基本明確，然而有關綠色棉纖維發(fā)育的分子機制仍缺乏深入研究。

DNA甲基化是真核生物基因組中最常見的1種DNA共價修飾方式，根據(jù)EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/Msp這2組甲基敏感性限制性內切酶對基因組甲基化位點的識別和切割差異，可以對基因組范圍內5'-CCGG-3'位點的甲基化程度及其狀態(tài)進行分析[5]。DNA甲基化在植物基因表達、基因沉默、細胞分化、系統(tǒng)發(fā)育中起重要的調節(jié)作用[6-7]。在植物生長周期中，隨著遺傳和環(huán)境變化而發(fā)生的不同發(fā)育反應，主要取決于基因的不同轉錄表達，而DNA甲基化水平和模式的變化是基因轉錄表達調控的1種重要方式[8]。另外，在植物不同組織之間以及不同發(fā)育時期，DNA甲基化水平和模式存在一定的差異。例如，利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）技術研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥子葉、葉片和花的DNA甲基化水平和模式均存在一定差異[9]；水稻幼苗與成長植株之間DNA甲基化情況也不盡相同[10]。綠色棉纖維同樣是高度特化的植物細胞，其發(fā)育是多基因表達調控的復雜過程，并且會涉及特異蛋白的合成和特異基因的選擇性表達[11]。然而，目前有關綠色棉纖維發(fā)育的分子機制報道較少。因此，本試驗以綠色棉纖維為材料，采用MSAP技術研究綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA甲基化水平和模式的變化規(guī)律；并通過特異表達片段的分離與鑒定，探索這些片段與已知功能基因的同源性，揭示綠色棉纖維發(fā)育的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

本試驗材料為綠色棉品種綠絮棉1號，2013年種植于安徽農業(yè)大學農場（安徽省合肥市大楊鎮(zhèn)），行距100 cm，株距50 cm，常規(guī)田間管理。在盛花期對當日開花棉鈴進行掛牌，掛牌后第5天起，每隔5 d取樣1次，直至第25天。每次取樣后立即放入液氮罐中帶回實驗室，并轉入到－70℃冰箱保存，用于MSAP分析。

主要試劑有dNTPs、RNA酶、Taq酶，均購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶MspⅠ、HpaⅡ、EcoRⅠ、PMD-T載體試劑盒以及T4DNA連接酶，均購自Takara公司；引物序列見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花纖維基因組提取。采用改良后的CTAB法[12]，提取棉花纖維DNA。將提取后的DNA加入30 μL的ddH2O溶解，并加入10 mg· mL－1RNA酶進行純化。提純后的DNA，分別采用核酸濃度測定儀和1%（質量分數(shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質量，之后保存于－70℃冰箱中以備用。

1.2.2DNA酶切與連接。采用分步酶切法，即先用EcoRⅠ對纖維DNA模板進行酶切，再將酶切產物分別用HpaⅡ和MspⅠ酶切。①EcoRⅠ酶切反應體系：500 ng的DNA模板，10 U的EcoRⅠ(Thermo)，2 μL的10×bufferEcoRⅠ [500 mmol· L－1Tris-HCl（pH 7.5），1000 mmol·L－1NaCl，100 mmol·L－1MgCl2，0.2%（質量分數(shù)）Trition X-100，1 mg·mL－1BSA]，加ddH2O至20 μL，反應混合液于37℃溫浴12 h，之后于65℃水浴中變性20 min。②HpaⅡ和MspⅠ酶切反應體系：20 μL上述酶切產物，10 UHpaⅡ (或MspⅠ)，3 μL 10× buffer Tango[330 mmol·L－1Tris-Ac（pH 7.9），100 mmol·L－1Mg-Ac，660 mmol·L－1K-Ac，1 mg· mL－1BSA]，加ddH2O至30 μL，反應混合液于37℃溫育12 h，之后于 65℃（HpaⅡ）或80℃（MspⅠ）水浴中變性20 min，備用。③反應體系（40 μL）：上述雙酶切產物30 μL，T4DNA連接酶（Thermo）1 μL，EcoRⅠ-adapterⅠ和EcoRⅠ-adapterⅡ接頭引物各 1 μL，HpaⅡ/MspⅠ-adapterⅠ和HpaⅡ/MspⅠ-adapterⅡ接頭引物各1 μL，10×T4DNA Ligase buffer 4 μL，Nuclease-free water 1 μL；反應液于22℃連接12 h，連接后的產物稀釋10倍，備用。

表1 MSAP的接頭和引物序列Table 1 Sequences of adaptors and primers for MSAP

1.2.3聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）。預擴增引物為E0和H0的組合。預擴增反應體系25 μL，包括EasyTaq10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，EasyTaqfor PAGE 0.25 μL，E01.5 μL，H01.5 μL，Nuclease-free water 16.25 μL，連接產物1.0 μL。預擴增PCR反應程序為95℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，共20個循環(huán)。

選擇性擴增引物為E1―E11與H1―H6的組合，共成66對。選擇性擴增體系為25 μL，包括EasyTaq10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，EasyTaqfor PAGE 0.25 μL，Hi0.5 μL，Ei0.5 μL，Nuclease-free water 18.95 μL，預擴增產物0.3 μL。選擇性擴增PCR反應分為2步，第1步為：95℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，共20個循環(huán)，每循環(huán)下降0.7℃；第2步為：95℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共23個循環(huán)。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。對1×TBE電泳緩沖液預電泳20 min后，將選擇性PCR擴增產物和Loading buffer緩沖液 [0.25%（質量分數(shù)）溴酚藍，0.25%（質量分數(shù)）二甲苯青，用10 mL去離子甲酰胺溶解]按5∶1的體積比混合，每個樣品取4.0 μL上樣，100 W恒定功率電泳1.5 h。硝酸銀染色后拍照，并進行H（EcoRⅠ/HpaⅡ）和M（EcoRⅠ/MspⅠ）泳道條帶數(shù)及帶型統(tǒng)計分析。每條帶代表1個酶切識別位點，條帶的有無分別采用1和0表示。

1.2.5MSAP差異片段的回收、測序和功能分析。切下差異條帶后，放入0.5 mL的PCR管中，加入20 μL ddH2O，并于沸水浴中煮15 min，以溶解于水中DNA作為模板進行二次PCR擴增。擴增產物加10 μL 6×Loading buffer，然后采用1%（質量分數(shù)）的瓊脂糖電泳分離條帶，并在紫外燈下割膠回收，膠回收采用上海生工膠回收試劑盒；膠回收的產物連接入T-Vector后轉化入E.coliDH5α，經(jīng)藍白斑篩選后，挑取陽性克隆，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h，菌液渾濁后送上海生工有限公司進行測序。對獲得的序列，在NCBI（National center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫中利用BLASTX和BLASTN在線程序進行同源性分析，推測其可能的功能。

2 結果與分析

2.1 綠色棉纖維總DNA樣品的電泳檢測

由表2可知，提取的各時期纖維總DNA純度較高，OD260/OD280值均在1.8左右。從其DNA電泳結果（圖1）可以看出，各樣品均得到了較完好的總DNA，未發(fā)現(xiàn)降解現(xiàn)象；另外，DNA的電泳條帶銳利，且蛋白質和RNA殘留較少，說明總DNA的純度較高。

2.2 不同時期棉纖維DNA甲基化水平變化

同裂酶HpaⅡ和MspⅠ均能夠識別DNA序列中的5'-CCGG-3'位點，然而對DNA序列內該位點甲基化的敏感性不同。樣品DNA經(jīng)過EcoRⅠ/Msp和EcoRⅠ/HpaⅡ酶切后的產物會有4種結果，但在PAGE膠上往往只能顯示出3種（圖2），其中，第1類（TypeⅠ）代表5'-CCGG-3'位點沒有發(fā)生甲基化，即均有帶；第 2類（TypeⅡ）代表5'-CCGG-3'位點發(fā)生半甲基化，即前者有帶而后者沒有帶；第3類（TypeⅢ）代表5'-CCGG-3'位點發(fā)生全甲基化，即前者無帶而后者有帶。

表2 不同發(fā)育時期綠色棉纖維總DNA提取質量的紫外檢測結果Table 2 The result of ultra-violet analysis on fiber DNA of green cotton during different development stages

圖1 綠色棉纖維總DNA的凝膠電泳結果Fig.1 Gel electrophoresis of DNA isolated from fiber for green cotton

圖2 綠色棉纖維MSAP聚丙烯酰胺分析膠帶型及其DNA甲基化模式Fig.2 The result of MSAP and DNA methylation patterns for fiber of green cotton

采用66對MSAP選擇性擴增引物對不同時期綠色棉纖維DNA樣品進行MSAP的PCR擴增分析結果見表3。從中可以看出，開花后10 d MSAP擴增的總帶數(shù)較多，開花后15 d、20 d和25 d次之，且條帶數(shù)相近，而開花后5 d的條帶數(shù)最少。對甲基化條帶總數(shù)分析可知，從開花后5 d到25 d，甲基化條帶總數(shù)逐漸增多，開花后10 d、 15d、20 d和 25 d比開花后 5 d時分別增加11.45%，13.86%，24.10%和33.13%。

在綠色棉纖維發(fā)育的上述5個時期中，未發(fā)生甲基化（TypeⅠ型）帶數(shù)最多，全甲基化（TypeⅢ型）帶數(shù)次之，半甲基化（TypeⅡ型）帶數(shù)最少；且開花后10 d、15 d、20 d和25 d的半甲基化帶數(shù)比開花后 5 d分別增加 11.86%，16.95%，25.42%和30.51%；其全甲基化條帶比開花后5 d分別增加11.2%，12.14%，23.36%和34.58%。另外，隨著綠色棉纖維發(fā)育進程的推進，綠色棉纖維甲基化條帶比例、全甲基化條帶百分比均逐漸增加，說明纖維發(fā)育的過程（開花后5～25 d）中，DNA發(fā)生甲基化的位點數(shù)逐漸增多。

表3 綠色棉纖維發(fā)育過程DNA甲基化水平的變化Table 3 Changes of DNA methylation levels and patterns during different development stages for green cotton

2.3 不同時期棉纖維DNA甲基化狀態(tài)變化

與開花后5 d相比，其他時期綠色棉纖維DNA甲基化敏感性擴增共呈現(xiàn)出11種帶型 （表4和圖3），這11種帶型分為2大類：單態(tài)性和多態(tài)性。單態(tài)性是指與開花后5 d相比，其他時期（開花后10～25 d）的帶型無變化，即纖維發(fā)育整個時期都具有相同的帶型（A型），說明綠色棉纖維發(fā)育整個時期基因組DNA的5'-CCGG-3'位點的甲基化狀態(tài)沒發(fā)生變化；其中，A型又分為3類，A1型為無甲基化，A2為半甲基化，A3為全甲基化。多態(tài)性是指與開花后5 d相比，其他時期基因組DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變，說明在開花后 10～25 d，綠色棉纖維基因組 DNA的5'-CCGG-3'位點的甲基化狀態(tài)與開花后5 d相比發(fā)生了變化，這種多態(tài)性又分為2類，即甲基化（B型）和去甲基化（C型）。其中，B型中的B1和B2是重新甲基化 （開花后5 d時M和H泳道都有條帶，而其他時期只有M或H泳道有條帶），B3和B4是超甲基化（開花后5 d時只有H或M有條帶，而其他時期H和M均無條帶），B型說明與開花后5 d相比，其他時期纖維基因組DNA發(fā)生甲基化水平升高變化；C型包括C1、C2、C3和C4，是去甲基化類型，C型甲基化狀態(tài)與B型相反，說明與開花后5 d相比，其他時期纖維基因組DNA發(fā)生了甲基化水平降低的變化。開花后5 d與其他時期的甲基化模式A、B和C以及相應的位點數(shù)見表4。

由表4可以看出，與開花后5 d相比，開花后10 d、15 d、20 d和25 d時的DNA甲基化程度未發(fā)生改變的類型（A型）分別占83.98%，81.84%，83.04%和48.67%，DNA甲基化程度升高的類型（B型）分別占3.15%，3.43%，3.65%和2.52%，甲基化程度降低類型 （C型）分別占 12.87%，14.72%，13.31%和48.81%。由此可見，隨著綠色棉纖維的發(fā)育，其多態(tài)性逐漸增多。

表4 DNA甲基化狀態(tài)變化Table 4 DNA methylation pattern of green cotton fiber

2.4 MSAP差異片段的序列分析

通過MSAP分析，對綠色棉纖維DNA的多態(tài)性甲基化變異位點進行了回收、克隆，得到了29條甲基化位點發(fā)生變異的DNA片段序列，但經(jīng)BLAST比對后表明，17條甲基化修飾序列檢索到了同源序列。這些同源序列的甲基化模式在纖維不同發(fā)育時期發(fā)生不同變化，具體見表5。

通過在Genebank網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫上的Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，這17個片段中與已知棉花相關序列同源性較高的序列有11條。其中：Seq4、Seq5、 Seq10、Seq12和Seq17同源于棉花線粒體基因組，且在開花后25 d時發(fā)生去甲基化；Seq6同源于棉花擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）標記的基因組序列克隆B；Seq8、Seq9、Seq11和Seq13同源于陸地棉NBRI_GE13671微衛(wèi)星序列的克?。籗eq14同源于陸地棉克隆ML-2甲基化敏感的多態(tài)位點的基因組序列。另外，還發(fā)現(xiàn)蛋白水解酶類基因序列（Seq3）、分離酶基因序列（Seq15）、酯酶基因序列（Seq16），且在開花后25 d去甲基化。

3 討論

DNA甲基化現(xiàn)象廣泛存在于多種生物體中，植物中有20%～30%的基因組DNA胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)[13]。DNA甲基化是植物正常生長和發(fā)育所必需的，甲基化水平過高或不足，均會導致植物表型和發(fā)育的異常[14]。棉花生長發(fā)育過程中也存在DNA甲基化現(xiàn)象，郭寧等[15]通過乙烯利處理棉花子葉，并對其基因組進行MSAP擴增，每個樣品平均擴增出855個帶型，平均每對引物擴增出 12.95個片段。本研究中，采用 66對MSAP引物對綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA進行PCR擴增，共擴增出4112個條帶；每個樣品平均擴增出822.4個帶型，平均每對引物擴增出12.46個片段，這與郭寧等[15]結果相近；說明DNA甲基化同樣發(fā)生于綠色棉纖維發(fā)育過程中。

圖3 綠色棉纖維MSAP擴增結果Fig.3 The result of MSAP for green cotton

植物DNA甲基化不僅具有組織特異性，而且還具有時空性[16]。同一組織的不同發(fā)育階段，基因組DNA甲基化水平和模式有所不同；在番茄果實成熟過程中，CG甲基化水平逐漸降低[17]；而毛竹基因組DNA甲基化水平隨生理年齡的增加呈上升趨勢[18]。另外，植物DNA甲基化水平和模式受到外界脅迫的影響，乙烯利處理后棉花子葉的甲基化水平和甲基化模式以及甲基化多態(tài)性均發(fā)生了改變[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著綠色棉纖維的發(fā)育，其DNA發(fā)生甲基化的位點數(shù)逐漸增多，其甲基化條帶總數(shù)、甲基化條帶比例、全甲基化條帶百分比均隨著綠色棉纖維生育進程 （開花后5～25 d）逐漸升高，這與李廷春[19]對棕色棉纖維發(fā)育過程中甲基化水平和模式的變化趨勢相一致。綠色棉的纖維發(fā)育階段與白色棉相同，但綠色棉在纖維發(fā)育過程中伴隨著纖維素合成的同時，纖維色素也在不斷合成[3]；Qian等[20]研究表明，綠色棉纖維發(fā)育過程中，纖維發(fā)育基因和色素合成基因表達均發(fā)生了明顯的變化。不過，DNA甲基化是否參與了這一系列基因表達調控，還需要進一步證實。另外，綠色棉纖維的發(fā)育過程是一個纖維逐漸脫水成熟過程，在此過程中，纖維處于脫水逆境中，而DNA甲基化位點和比例增多可能參與了纖維對脫水逆境的響應。

表5 綠色棉DNA甲基化多態(tài)性序列BLAST比對結果Table 5 BLAST result of the DNA methylation polymorphic sequences for green cotton

表5 （續(xù)）Table 5 （Continued）

DNA甲基化水平和模式的變化與基因沉默、基因表達等調控密切相關；常染色質中啟動子區(qū)高度甲基化往往會導致基因沉默，而活躍的基因表達常與DNA去甲基化相關聯(lián)[21-22]。研究表明，CG和非CG甲基化都缺失的植株當代均不能生存，其發(fā)育過程中出現(xiàn)胚細胞分裂和極性的異常，從而導致死亡[22]。破壞胞嘧啶甲基化的擬南芥植株雖然能夠維持生長，但形態(tài)卻發(fā)生明顯的變異[23]。本研究表明，綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA發(fā)生甲基化以及去甲基化現(xiàn)象，可能是其基因表達調控方式之一。

郭寧等采用MSAP技術篩選出了部分與乙烯脅迫誘導相關的基因片段，如果膠甲酯酶基因、乙醇脫氫酶基因A、膜結合轉錄因子肽酶等，這些基因可能與乙烯利誘導棉花子葉的衰老過程有關[15]。本研究篩選出了棉花線粒體基因組基因、絲氨酸蛋白酶基因、酯酶基因等序列。其中，線粒體通過生物氧化為細胞提供能量，也是真核細胞內自由基生成及調控細胞凋亡的關鍵細胞器[25]；絲氨酸蛋白酶是最大的1類蛋白酶家族，廣泛參與植物的衰老、細胞分化、程序化細胞死亡、蛋白質降解與加工等生理過程[26]；酯酶不僅影響生物的物質及能量代謝，還參與基因表達調控、酶活性調節(jié)、細胞信號轉導和植物抗逆性調控[27]。分離到的這些基因均在開花后25 d去甲基化，可能與綠色棉纖維色素合成的能量代謝、纖維細胞的凋亡、纖維的成熟衰老等過程有關，但其具體作用還有待于證實。另外，本研究在對甲基化多態(tài)性片段的分離、克隆與鑒定中尚未找到與綠色棉纖維色素合成相關的直接證據(jù)；其中，分離到的已知功能的基因同源片段與纖維色素合成的相關性較小，而未知功能的基因同源片段與纖維色素合成是否相關仍有待于進一步研究。

4 結論

利用MSAP技術分析了綠色棉纖維發(fā)育過程中DNA甲基化的變化情況。結果表明，隨著綠色棉纖維的發(fā)育，甲基化條帶總數(shù)、甲基化條帶比率、全甲基化條帶百分比均逐漸升高。分離得到了棉花線粒體基因組、絲氨酸蛋白酶和酯酶等相關基因，這些基因均在開花后25 d時發(fā)生去甲基化。

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Methylation-sensitive Amplified Polymorphism Analysis of Epigenetic Changes during Fiber Development in Green Cotton(Gossypium hirsutumL.)

Qian Senhe1,Hong Liang2,Wei Ming1,Lin Yi2,Cai Yongping2
(1.Department of Biochemistry,Anhui Polytechnic University,Wuhu,Anhui241000,China;2.Life Science School,Anhui A-gricultural University,Hefei230036,China)

[Objective]The aim of this study was to analyze the DNA methylation during fiber development in green cotton.[Method]The products resulting fromEcoRI/HpaII andEcoRI/MspI double-digestions were amplified by methylation-sensitive amplified polymorphism primers to analyze the methylation status of the 5'-CCGG-3'locus in the'Lüxumian No.1'genome.Meanwhile,the amplified fragments were sequenced to characterize their biological functions.[Result]A total of 4 112 fragments were amplified by 66 primer pairs,with an average of 822.4 fragments each.Additionally,each primer amplified an average of 12.46 fragments.The number of methylated fragments at 10,15,20,and 25 days post anthesis (DPA)was 11.45%, 13.86%,20.10%,and 33.13%higher than the number of methylated fragments at 5 DPA,respectively.At 10,15,20,and 25 DPA,3.15%,3.43%,3.65%,and 2.52%of the green cotton fiber genomic loci were methylated,respectively.In contrast,at the same time points,12.87%,14.72%,13.31%,and 48.81%of the loci were demethylated,respectively.The sequencing results and BLAST searches revealed that 17 gene fragments were homologous to known functional genes,including those from the cotton mitochondrial genome as well as the genes encoding a serine protease and an esterase.These genes were methylated at 25 DPA.[Conclusion]Genes are methylated and demethylated during green cotton fiber development.

green cotton;fiber development;epigenetic;methylation-sensitive amplified polymorphism analysis

S562.03

A

1002-7807(2017)04-0316-11

10.11963/1002-7807.qshqsh.20170405

2016-07-15

錢森和（1978―），男，博士，qiansenhe@163.com

安徽省棉花產業(yè)技術體系；安徽省高校自然科學基金(KJ2014A078)