骨肉瘤患者外周血單個核細胞m icroRNA-21與骨肉瘤組織中K i-67表達水平檢測及其臨床價值

宋魏，張建波，馬杰，于慶凱*

（鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2分子病理科，鄭州450000）

骨肉瘤患者外周血單個核細胞m icroRNA-21與骨肉瘤組織中K i-67表達水平檢測及其臨床價值

宋魏1，張建波2，馬杰1，于慶凱1*

（鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2分子病理科，鄭州450000）

目的探討外周血單個核細胞中m icroRNA-21（m iR-21）水平和組織中Ki-67表達在骨肉瘤發(fā)展中的臨床價值。方法采用RT-qPCR法檢測120例骨肉瘤患者、80例骨軟骨瘤和70例正常健康人群miR-21的表達水平，應用免疫組織化學技術檢測Ki-67表達，采用受試者工作特征曲線（ROC）分析m iR-21對骨肉瘤的診斷價值。結果m iR-21在骨肉瘤患者外周血中的表達顯著高于正常人群，miR-21表達與臨床分期、術后復發(fā)、轉移有關，而與年齡、性別、病理類型、病變部位均無關。m iR-21的ROC曲線下面積為0.858，敏感度和特異度分別為91.89%和79.61%。Ki-67在骨肉瘤組織中的免疫組織化學表達水平明顯高于骨軟骨瘤和正常人群組織。結論miR-21和Ki-67的表達水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關，外周血miR-21水平和Ki-67表達檢測可增強對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展的預測能力。

microRNA-21；Ki-67；骨肉瘤；骨軟骨瘤；外周血單個核細胞；臨床分期；轉移

骨肉瘤是一種惡性程度高的原發(fā)性腫瘤，其特點是癌細胞直接形成骨樣組織。骨肉瘤大多發(fā)生在10～25歲人群，男性發(fā)病率高于女性；其發(fā)病部位多處于骨端，偶爾發(fā)生在骨干或骨骺[1]。即使現(xiàn)在治療方式增多，如化療、保守治療、截肢術、其他治療等，但其存活率或修復率仍是不理想[2]。由于骨肉瘤發(fā)病率的成倍增加，患者一般可以活15個月至5年，常伴隨引發(fā)的并發(fā)癥有心臟病、肺病、糖尿病、和病理骨折；術后極易出現(xiàn)肺部轉移，即使截肢，患者3～5年存活率僅為5%～20%，預后非常不理想[3]。外周血單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，多用密度梯度離心法提取需要成分[4]。M icroRNAs(miRNAs)是一類存在于真核生物的非常常見和廣泛的非編碼單鏈RNA分子，在細胞內具有多種調節(jié)作用，如細胞增殖、細胞凋亡、以及程序性死亡等[5,6]；其通過參與轉錄后基因表達調控，提供了新的基因表現(xiàn)調控方式。既往研究已證實，m iRNAs在研究疾病發(fā)病機制中的重要作用[7,8]和優(yōu)勢，其性質穩(wěn)定，可抗熱、抗酸堿等物理化學變化[9]。m iRNAs與腫瘤相關進程有著密切聯(lián)系，起著促癌或者抑癌基因的作用，有望成為早期腫瘤診斷的分子標識物[10,11]。m icroRNA-21（m iR-21）是一種在腫瘤癌癥中有著高表達的小RNA分子。人類m iR-21定位于染色體17q23.2區(qū)，常起著促癌作用[12,13]。直接抽取外周血獲得實驗標本，操作簡便、快速且無侵[14]；同時鑒于骨肉瘤的惡性程度和不良預后，研究外周血單個核細胞中m iR-21在骨肉瘤臨床診斷中有重要價值。本研究通過對外周血單個核細胞進行分離檢測的方法，分析m iR-21在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其對骨肉瘤的診斷價值。

材料與方法

1 研究對象

在2011年12月至2013年12月期間，收集鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的120例原發(fā)性骨肉瘤患者手術切除的骨肉瘤標本。所有病例均經(jīng)臨床病理和影像學檢測確診，并經(jīng)HE染色進一步驗證骨肉瘤，均接受手術治療。本研究病例納入標準：①入院確診，原發(fā)性骨肉瘤患者；②無任何針對腫瘤細胞的治療史；③病變部位集中，為四肢骨骼。病例排除標準：①繼發(fā)性骨肉瘤，或有嚴重疾病史，包括重要臟器功能衰竭，代謝性骨病，良惡性腫瘤等等；②接受既往腫瘤治療方案，或正在接受治療者；③婦女正在生育或哺乳期間；④患者臨床資料缺失，無法配合完成隨訪者。120例骨肉瘤患者中，男性78例，女性42例，年齡9～48歲，中位年齡20歲，男女比例1.86:1。病理分型依據(jù)WHO骨肉瘤分類[15]，共分為2類，其中普通型骨肉瘤納入患者92例，其他類型28例。按照Ennecking外科分期法[16]，臨床分類為Ⅰ期18例，ⅡA期33例，ⅡB期42例，Ⅲ期27例。病變部位：脛骨上端44例，股骨下端62例，其他部位14例。另外，91例骨肉瘤患者發(fā)生轉移，其中肺轉移患者58例。收集80例骨軟骨瘤標本作為對照研究，選自本院病理科同期手術切除的骨軟骨瘤標本。其中男性52例，女性28例，年齡9～50歲，中位年齡20歲，男女比例1.86:1。收集70例同期本院來源于非腫瘤患者的新鮮正常骨組織標本和外周血標本作為健康對照，男性55例，女性25例，年齡8～50歲，中位年齡19歲，男女比例1.80:1。病例組和對照組年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義。

2 血液樣本制備及總RNA提取

用EDTA-K2 抗凝管采集所有的研究對象外周血3～5m l，1600g離心10m in后，將上層血漿小心轉移到潔凈的離心管中，再以13300g離心10min，除去所有的細胞碎屑等污染物，吸取上層血漿于潔凈的離心管，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?00μl血漿于1.5m l離心管中，75 ℃加熱5m in，42 ℃溫育1h。按照Invitrogen的Trizol 試劑盒說明書進行RNA提取，用NanoDrop 1000（Thermo Scientif c, America） 檢測RNA濃度，并讀取在260/280 nm處吸收值，此值介于1.8～2.0之間。將RNA保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3 實時熒光定量PCR檢測

依據(jù)RNA 逆轉錄試劑盒說明（TaKaRa 公司）建立本實驗所需的逆轉錄體系（總含量為20μl），將配制好的反應試劑振蕩混勻后置于PCR 反應儀（Step OneTM, APPlied Biosystems公司，美國），經(jīng)逆轉錄（37℃ 30m in，85 ℃15s），獲取合成cDNA模板。產(chǎn)物低溫（-20℃）保存?zhèn)溆?。隨后，以逆轉錄合成的cDNA作為模版，進行PCR擴增。RT-qPCR反應條件為95 ℃ 10m in，95 ℃15s，60 ℃20s，72℃20s，40個循環(huán)(各基因的上下游引物如表1所示)。隨后，取PCR反應產(chǎn)物10μl在1%瓊脂糖凝膠上電泳。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶，采用凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）對電泳凝膠圖譜進行觀察拍照，并保存電泳條帶類型，依據(jù)電泳后條帶亮度的強弱判斷表達量高低。熒光定量PCR總反應體系為20 μl:1.3μl cDNA模板，1μl m iR-21(U6)特異性引物，10μl TaqMan Universal PCRmaster M ix (ABI)，7.7μl H2O。所有反應均設立3個復孔。記錄每個反應管中標本的CT值，實驗結果采用定量PCR中的相對定量法進行分析用2-△△Ct表示病例組織相對于健康對照組織相對表達量的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt= (CTmiR-21－CTU6)病例組織－(CTmiR-21－CTU6)健康對照組織。SPSS 21.0統(tǒng)計軟件計算各組目的基因相對表達量并繪制柱狀圖。

表1 m iR-21及U6 的RT-qPCR引物Tab. 1 RT-qPCR primers of m iR-21 and U6

4 免疫組織化學染色

組織樣本收集后，用酒精（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）梯度脫水，二甲苯（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）透明，石蠟（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）包埋、切片。切片在烤箱中烤片1 h后浸入二甲苯脫蠟、酒精入水，pH6.0檸檬酸鹽緩沖液進行高壓抗原修復，隨后在室溫冷卻，PBS沖洗3次。加入鼠抗人Ki-67單克隆抗體（即用型；北京中杉金橋生物技術有限公司）孵育過夜，PBS沖洗3次（2m in/次），生物素標記的兔抗小鼠IgG（1:1000；北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育1 h，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液孵育37℃30m in，PBS沖洗，加DAB液（北京中杉金橋生物技術有限公司），蘇木素復染，反藍，梯度酒精脫水，最后進行二甲苯透明，以中性樹膠（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）封片，顯微鏡下觀察。實驗過程以PBS代替一抗作為空白對照。

結果判定：Ki-67陽性染色主要定位細胞核，選取任意5個高倍鏡視野，按所選視野陽性細胞占比計數(shù)，用平均值定義陽性細胞百分比為評定標準，以陽性細胞數(shù)＞25%定義陽性。同時，應用Image-Pro Plus6.0分析系統(tǒng)對Ki-67標記的切片標本隨機選取5個圖像，測定積分光密度，取平均值為相對表達量，以此作為進行Ki-67的定量分析。

5 統(tǒng)計學方法

m iR-21相對表達量及Ki-67積分光密度以均數(shù)±標準差表示，陽性表達率以及其他計數(shù)資料以百分比表示。使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對比分析（組間均數(shù)t檢驗，多組間方差分析）；應用受試者工作曲線（ROC）分析m iR-21對骨肉瘤的診斷價值，并計算對應曲線下面積，以及敏感度和特異度。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 骨肉瘤患者外周血單個核細胞中m iR-21水平增高

通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者、骨軟骨瘤患者及健康對照組外周血中miR-21相對表達量2-ΔΔCt分別為1.43±0.10、1.02±0.07和0.67±0.08，骨肉瘤患者外周血中m iR-21相對表達量顯著高于骨軟骨瘤組和健康對照組，且骨軟骨瘤組水平較健康對照組高（圖1）。

圖1 骨肉瘤和骨軟骨瘤患者與正常人外周血單個核細胞中m iR-21表達水平的PCR檢測。A，凝膠電泳檢測；B，定量PCR檢測結果的統(tǒng)計學分析；*，0.01＜P＜ 0.05Fig. 1 PCR detection of the level of miR-21 in peripheral blood mononuclear cells in osteochondroma patients, osteochondroma patients and healthy controls. A, detection by gel electrophoresis; B, statistical analysis of qPCR results; *, 0.01＜P ＜ 0.05

2 m iR-21水平與臨床分期、術后復發(fā)、轉移呈正相關

m iR-21相對表達量與骨肉瘤臨床病理特征的關系見表2。miR-21在有轉移、術后復發(fā)患者中的相對表達量顯著高于無轉移患者，臨床分期IIB+III期患者m iR-21相對表達量亦顯著高于I+IIA 期患者，但m iR-21相對表達量的高低與骨肉瘤患者的年齡、性別、病理類型、病變部位無關。

表2 M iR-21相對表達量與骨肉瘤患者臨床病理特征的關系Tab. 2 The relationship between the relative expression of M iR-21 and the clinicopathological features of osteosarcoma

3 m iR-21在骨肉瘤診斷中的價值

以正常人群外周血m iR-21相對表達量為對照組，與骨肉瘤外周血m iR-21相對表達量進行ROC曲線分析（圖2），m iR-21的曲線下面積為0.858，95%可信區(qū)間（95%CI）為0.805～0.910（P ＜ 0.001），敏感度和特異度分別為91.89%和79.61%。

圖2 m iR-21表達診斷骨肉瘤的ROC曲線Fig. 2 ROC curve of miR-21 expression in the diagnosis of osteosarcoma

圖3 骨肉瘤（A）和骨軟骨瘤（B）組織與正常人（C）骨組織中Ki-67表達的免疫組織化學檢測。比例尺，20μmFig. 3 Immunohistochem ical detection of Ki-67 expression in (A) osteosarcoma, (B) osteochondroma and (C) normal bone tissue. Scale bar, 20μm

4 骨肉瘤中K i-67免疫反應性增強

Ki-67陽性染色主要表達于細胞核中，細胞質無明顯著色，其陽性出現(xiàn)黃色、棕褐色大小不等的顆粒分布并明顯高于背景著色為陽性（圖3）。在120例骨肉瘤組織中，Ki-67的陽性表達99例，陽性率為82.50%，其中強陽性(+++)表達為24例，中度陽性(++)表達為48例，弱陽性(+)表達有27例，陰性(-)表達21例。骨軟骨瘤組織中表達陽性率為32.50%，陽性表達26例，陰性表達54例。而在正常骨組織中，陽性表達為6例，陽性率為8.57%，其中僅6例為弱陽性，其余均為陰性表達。Ki-67在骨肉瘤組織中的表達明顯高于骨軟骨瘤和正常骨組織，骨軟骨瘤組織中的表達高于正常骨組織。

應用Image-Pro Plus6.0分析系統(tǒng)對Ki-67免疫性強度分析顯示，骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織中及正常對照組織的積分光密度值分別為（38.21±6.23）、（35.55±5.40）和（27.96±4.68），骨肉瘤和骨軟骨瘤組織積分光密度值均高于正常對照骨組織，且差異具有統(tǒng)計學意義(骨肉瘤vs.正常對照：t=13.15，P＜0.001；骨軟骨瘤vs.正常對照：t=10.62，P＜0.001)，且骨肉瘤組織的Ki-67積分光密度亦高于骨軟骨瘤組織，具有顯著性差異(t=3.226，P=0.015)（表3）。

表3 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織與正常人骨組織中Ki-67表達的陽性率比較Tab. 3 Com parison of the positive rates of K i-67 expression in osteosarcoma, osteochondroma and normal bone tissue

討 論

骨肉瘤在原發(fā)性惡性腫瘤中發(fā)病率常位居首位，對患者生命質量安全影響重大，需高度重視。在現(xiàn)有一系列治療方法之上，更多可以提前采取預防措施，普及相關的知識，少年若是發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)周圍無明顯外傷的疼痛時，早期出現(xiàn)持續(xù)性疼痛后，應及時檢查預防[3,6]。同時，近年來m iRNAs在生命進程中扮演的角色逐漸凸顯，其在生物發(fā)育和生理活動中的調控功能也逐漸明朗，針對m iRNAs的研究成為當前熱點之一。M iRNAs是在各類小分子RNA中基因調節(jié)功能最為明顯的一類，其在正常和病理樣本中水平差異明顯，不同臨床階段的同一檢測樣本，其表達也不同[9,11]，提示m iRNAs可作為疾病監(jiān)測指標，也能為后期診療研究提供一定依據(jù)。現(xiàn)階段，針對骨肉瘤及其肺轉移等其他并發(fā)癥，在原有的治療方式上，開展了免疫基因治療、反義基因治療、抑癌基因治療等新型方法[17]。而m iR-21在腫瘤中常起著促癌基因的作用[13]，因此，本研究通過探討分析納入研究對象外周血m iR-21表達水平和組織Ki-67表達與骨肉瘤的相關關系，對于骨肉瘤的臨床診療有很重大意義。

本研究采用密度梯度離心法對從研究對象采集的外周血單個核細胞進行分離，運用實時熒光定量PCR方法對m iR-21進行檢測分析[18]。實時熒光定量 PCR具有高度的特異性和敏感性及相對費用低的優(yōu)點，是包括m iRNAs在內的核酸定量檢測的金標準[19]。本實驗提示外周血m iR-21的表達水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關，外周血單個核細胞中的m iR-21水平可作為骨肉瘤患者的診斷指標。目前主要影響骨肉癌發(fā)病率的主要因素有p53和Rb抑癌基因異常、轉錄調節(jié)因子活化蛋白-1、原癌基因、m iRNAs失調等；而在骨肉瘤轉移過程中，轉移和入侵腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤上分離，進入血流后，經(jīng)過轉染，從而形成轉移性骨肉瘤[20,21]。m iR-21作為一組非編碼RNA的組合，參與調控基因表達，并在多種腫瘤中扮演著促癌基因的作用。孫騰龍在研究中提到，在多發(fā)性骨髓癌（MM）中，m iR-21在MM患者中的表達水平要高于正常健對照組，與細胞增殖、化療和疾病預后治療有著密切聯(lián)系[22]。通過調節(jié)miR-21在骨肉瘤細胞中的表達水平來研究細胞的變化與miR-21的關系，上調m iR-21表達水平后，細胞生長增殖能力加強，而下調m iR-21表達水平后，細胞增殖能力受到抑制；在轉染m iR-21抑制劑后，發(fā)現(xiàn)其能抑制細胞增殖；進一步說明了m iR-21是骨肉瘤細胞侵襲的重要因子，m iR-21的失調是骨肉瘤發(fā)病因素之一[20,23]；吳夕在對人甲狀腺乳頭狀癌細胞（PTC）研究中提到，m iR-21在PTC組織中的表達遠高于癌旁正常組織，轉染后的m iR-21細胞凋亡率明顯增加；吳子宴在研究中提到，轉染m iR-21后，細胞凋亡明顯增加，說明轉染后的m iR-21可有效抑制m iR-21的致癌作用，反之，說明m iR-21有促進癌細胞發(fā)散的作用，以上均表明外周血m iR-21與骨肉瘤的發(fā)生有著相關作用[12,24]。與此同時，以健康正常組為對照組，與骨肉瘤外周血m iR-21水平結果做ROC曲線分析，m iR-21曲線下面積為0.858,95%CI為0.805～0.910，關聯(lián)度高，表明在骨肉瘤中，m iR-21可以作為骨肉瘤患者的診斷指標，呈現(xiàn)高表達的m iR-21常伴隨骨肉瘤細胞轉移和較高的臨床分期，提示miR-21外周血水平的檢測可用于預判骨肉瘤的發(fā)展趨勢及臨床病理特征的嚴重程度。同時，為進一步確定影響骨肉瘤的重要生物標記，我們關注了Ki-67表達在骨肉瘤中的變化。免疫組織化學染色結果顯示Ki-67陽性表達率有助于區(qū)分惡性骨肉瘤、良性骨軟骨瘤和正常人群，該結果提示作為細胞增殖相關抗原[25]，Ki-67的檢測有助于預測骨肉瘤發(fā)展。

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Detection for m icroRNA-21 level in peripheral blood mononuclear cells and K i-67 level in osteosarcoma tissue in osteosarcoma patients and analysis of the clinic signif cance

Song Wei1, Zhang Jianbo2, Ma Jie1, Yu Qingkai1*
(1Department of Pathology,2Department of Molecular Pathology, The Af liated Tumor Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo investigate the clinical signif cance of the level of microRNA-21 (miR-21) in peripheral blood mononuclear cells and tissue Ki-67 in the development of osteosarcoma.M ethodsRT-qPCR was performed to detect the expression of miR-21 in 120 cases of osteosarcoma, 80 cases of osteochondroma and 70 cases of normal healthy controls, the level of Ki-67 protein was detected by immunohistochem istry, and receiver operating characteristic curve (ROC) was used to analyze the value of m iR-21 in the diagnosis of osteosarcoma.ResultsThe level of miR-21 in peripheral blood was signif cantly higher in osteosarcoma patients than that in normal controls. Its expression was related to clinical staging, postoperative recurrence and metastasis, while not correlated w ith age, gender, pathological type and lesion location. The area under ROC curve of miR-21 was 0.858, the sensitivity and specif city were 91.89% and 79.61%, respectively. The immunohistochem ical expression of Ki-67 was signif cantly higher in osteosarcoma tissue than in osteochondroma and normal control tissue.ConclusionThe expression of miR-21 and Ki-67 is associated w ith the development of osteosarcoma, and detection of the level of m iR-21 in peripheral blood and Ki-67 expression can help to predict the occurrence and development of osteosarcoma.

M icroRNA-21; Ki-67; osteosarcoma; osteochondroma; peripheral blood mononuclear cells; clinical stage; metastasis

R738.1

ADOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.011

2017-01-21

2017-06-09

宋魏，女(1980)，漢族，主治醫(yī)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：medchang@126.com