柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1潛在子孢子互作蛋白的篩選

崔曉霞，黃 兵,3，趙其平，韓紅玉，朱順海，徐帥兵，謝雨翔，唐 敏,2，楊志遠(yuǎn),2，董 輝

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1潛在子孢子互作蛋白的篩選

崔曉霞1，黃 兵1,3，趙其平1，韓紅玉1，朱順海1，徐帥兵1，謝雨翔1，唐 敏1,2，楊志遠(yuǎn)1,2，董 輝1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為了篩選與柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1（Eimeria tenella apical membrance antigen 1，EtAMA1）存在互作的子孢子蛋白，以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，PCR擴(kuò)增EtAMA1基因胞外區(qū)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEX-6P-1連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-EtAMA1，表達(dá)、純化重組蛋白EtAMA1-GST。純化的重組蛋白經(jīng)Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示在75 kDa處有單一的目的條帶，證實(shí)了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。將EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分別與谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育后，再分別與子孢子裂解物共孵育，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析后，結(jié)果顯示三者之間的條帶明顯不同。將差異條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)獲得的蛋白質(zhì)肽段與Uniprot中雞球蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，初步獲得了10個(gè)與EtAMA1存在潛在互作的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白，包括微線體蛋白、糖酵解酶類、肌動(dòng)蛋白相關(guān)因子以及一些保守蛋白等，他們廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學(xué)過程。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲；頂膜抗原-1；GST pull-down；相互作用蛋白

球蟲病是集約化養(yǎng)雞業(yè)中最多發(fā)、危害嚴(yán)重且防治困難的疾病之一[1]，全世界每年因球蟲病造成的損失及其防治的費(fèi)用達(dá)20億英鎊[2]。目前，控制球蟲病主要依靠抗球蟲藥物和活疫苗的使用[3]，但由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生，藥物殘留問題日益受到關(guān)注以及活疫苗潛在散毒等問題的產(chǎn)生，促使研究人員迫切地尋找新的防治手段來控制球蟲病。雞球蟲的生活史包括細(xì)胞外的入侵階段和細(xì)胞內(nèi)的繁殖階段，其中子孢子是球蟲從體外入侵宿主細(xì)胞建立感染的第一個(gè)階段。阻斷子孢子入侵宿主細(xì)胞，是防治球蟲病的一種有效方法。因此，分離鑒定與球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵分子，對(duì)闡明球蟲入侵的分子機(jī)制，研制抗球蟲病疫苗和治療新藥物都具有積極意義[4]。

頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1 ）于1982年在瘧原蟲（Plasmodium）裂殖子中發(fā)現(xiàn)，是頂復(fù)器門原蟲中一種高度保守的微線蛋白[5]。大量研究表明，AMA1在瘧原蟲、弓形蟲（Toxoplasma）等裂殖子/速殖子入侵宿主過程中，能與多個(gè)棒狀體頸部蛋白（RON2/4/5/8）相互作用，形成復(fù)合物，在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的功能[6-8]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲AMA1（Eimeria tenella AMA1，EtAMA1）在子孢子中的蛋白表達(dá)水平明顯高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子階段，其抗體能明顯抑制子孢子入侵[9]，但具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在利用GST pull-down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選出與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，為闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 柔嫩艾美耳球蟲（資源編號(hào)：CAAS2111 1611）和pGEX-6P-1載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；宿主菌TOP10、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker（DL2000）、DNA Marker（DL5000）、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自上海天根生物技術(shù)有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I購(gòu)自大連TaKaRa公司；鼠源GST標(biāo)簽抗體、RIPA裂解液、銀染試劑購(gòu)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Cocktail 蛋白酶抑制劑、羊抗鼠IgG-Cy3二抗購(gòu)自Sigma公司；GST·BindTMResin 購(gòu)自Novagen公司；PierceTM GST Protein Interaction Pull-Down Kit購(gòu)自美國(guó)Themo scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 子孢子的收集與純化 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按劑量為2.0×105個(gè)/只，接種7日齡無球蟲的雛雞，收集接種后d 6~8糞便中的卵囊[10]，在28℃的生化培養(yǎng)箱中通氧進(jìn)行孢子化。待卵囊孢子化率達(dá)到90%以上時(shí)，用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行純化。在純化好的卵囊沉淀中加入少量PBS，混勻后加入含有玻璃珠的離心管中[11]，漩渦震蕩5 min。鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量孢子囊釋放且卵囊破壁率達(dá)到95%以上時(shí)，960×g離心10 min，沉淀用HBBS緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移至三角錐形瓶中，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和5%的雞膽汁[12]，混勻后置于41℃水浴鍋中消化至95%以上的子孢子逸出，用砂芯漏斗過濾純化子孢子，收集濾液，離心。子孢子沉淀用PBS洗滌3次后，計(jì)數(shù)，按每管1×106個(gè)子孢子進(jìn)行分裝，置于液氮中保存。

1.2.2 cDNA模板的制備 取0.5×106個(gè)子孢子，加入Trizol，按照說明書的步驟提取總RNA，取少量總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。符合要求后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。

1.2.3 PGEX-6P-1-EtAMA1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 對(duì)EtAMA1（GenBank登錄號(hào)：JN032081）的胞外區(qū)序列（1327 bp）設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-CGGGATCCGGGGTGCAGCACAA-3'，下游引物：5'-CGGAATTCGCCCCCTTTAGA-3'），上下游引物分別引入BamH I、EcoR I酶切位點(diǎn)（下劃線處）[9]。以柔嫩艾美耳球蟲子孢子的cDNA產(chǎn)物為模板，進(jìn)行EtAMA1基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s，53℃ 退火30 s，72℃延伸 2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。將回收的基因片段和載體pGEX-6P-1質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后回收目的片段，按物質(zhì)的量之比為4:1的比例混合，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆菌落于5 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃恒溫?fù)u床中，180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 EtAMA1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的PGEX-6P-1-EtAMA1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。挑取單克隆菌落接種到100 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃恒溫?fù)u床中，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.4～0.8之間，加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L，16℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后，4℃、10 000×g離心8 min，收集菌體沉淀，加入預(yù)冷的PBS重懸菌體，利用超聲破碎的方法裂解菌體，直至菌液透明清亮，條件為超聲2 s，停止2 s，超聲20 min。超聲裂解液于4℃、10 800×g離心10 min，上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析，確定上清中有目的蛋白的表達(dá)。使用GST·BindTM Resin 對(duì)上清中的目的蛋白進(jìn)行純化。

1.2.5 EtAMA1-GST純化蛋白的鑒定 以未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，取部分純化后的蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。全濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBST洗滌3次，加入鼠源GST標(biāo)簽一抗，37℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1:10 000稀釋的熒光羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，再經(jīng)PBS洗滌5次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.6 柔嫩艾美耳球蟲子孢子全蛋白的提取 取10×106個(gè)子孢子，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，10 800×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入100 μLRIPA裂解液及1% cocktail蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，輕輕地反復(fù)吹打裂解液，避免產(chǎn)生氣泡；4℃、10 800 ×g離心10 min，吸取上清液即為子孢子總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.7 GST pull-down試驗(yàn) 參照試劑盒的說明書進(jìn)行，取3個(gè)Pierce瓊脂糖純化離心柱，向每個(gè)離心柱中加入50 μL谷胱甘肽瓊脂糖凝膠和400 μL的由1:1 TBS和裂解緩沖液配成的洗滌液，上下翻轉(zhuǎn)離心柱，將柱子放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，用洗滌液反復(fù)洗滌5次。向3個(gè)離心柱中分別加入150 μg的GST-EtAMA1蛋白液、GST標(biāo)簽蛋白液以及PBS，用洗滌液補(bǔ)足體積至300 μL，4℃搖床溫和旋轉(zhuǎn)振蕩1 h，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液。加入400 μL洗液，反復(fù)顛倒混勻，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，向離心柱中加入洗液，反復(fù)洗滌瓊脂糖凝膠5次。每個(gè)離心柱中加入150 μg子孢子蛋白，用洗滌液補(bǔ)足體積至800μL，置于搖床溫和轉(zhuǎn)動(dòng)，4℃孵育過夜。次日，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，向離心柱中加入洗滌液，反復(fù)洗滌瓊脂糖凝膠5次。將250 μL現(xiàn)配制10 mmol/L谷胱甘肽洗脫液（pH=8.0）添加至離心柱中，4℃搖床溫和振蕩至少5 min，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，收集管內(nèi)的洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析，凝膠用銀染試劑盒進(jìn)行染色。

1.2.8 差異蛋白質(zhì)條帶的質(zhì)譜鑒定 將SDS-PAGE分析得到的差異蛋白條帶，切割后送至上海厚基生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)獲得的蛋白質(zhì)肽段，與Uniprot 中球蟲數(shù)據(jù)庫(kù)（uniprot_ Eimeria_57563_20151228.fasta，收錄序列 57563條）進(jìn)行搜索，鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 EtAMA1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化 以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)合成的特異性引物擴(kuò)增出1條目的條帶，大小為1260 bp，與預(yù)期相符。將目的片段連接到pGEX-6P-1，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后，原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-EtAMA1用0.05 mmol/mL IPTG在16℃條件下誘導(dǎo)過夜。將表達(dá)后的菌液進(jìn)行超聲破碎，所獲沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在上清和沉淀中均有72 kDa目的蛋白存在，其中pGEX-6P-1載體約為26 kDa，AMA1蛋白約為46 kDa（圖1）。用GST-Bing柱對(duì)上清中的重組蛋白進(jìn)行純化，可獲得較純的EtAMA1-GST蛋白（圖1）。

圖1 EtAMA1-GST重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.1 Expression and purif cation of recombinant protein EtAMA1-GSTM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 重組蛋白上清; 2: 重組蛋白沉淀; 3: 純化后重組蛋白M: Protein Marker; 1: Supernant of EtAMA1-GST; 2: Precipitate of EtAMA1-GST; 3: Purif ed EtAMA1-GST protein

2.2 EtAMA1-GST融合蛋白的鑒定 以GST抗體為一抗，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，純化蛋白在72 kDa處有單一的目的條帶，而未誘導(dǎo)菌液無條帶，證實(shí)所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白（圖2）。

圖2 EtAMA1-GST重組蛋白的Western blot鑒定Fig.2 Identif cation of recombinant protein EtAMA1-GST by Western blotM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 純化的EtAMA1-GST蛋白; 2: 陰性對(duì)照M: Protein Marker; 1: Purif ed EtAMA1-GST protein; 2: Negative control

2.3 SDS-PAGE分析與質(zhì)譜分析 對(duì)GST pull-down的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，銀染結(jié)果顯示，EtAMA1-GST實(shí)驗(yàn)組、GST空載體對(duì)照組以及陰性對(duì)照組之間的條帶明顯不同（圖3）。將差異條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)獲得的蛋白質(zhì)肽段，與Uniprot中雞球蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，初步得到10個(gè)與EtAMA1存在潛在相互作用的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白（表1）。

圖3 GST pull-down結(jié)果的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the results of GST pull-down by SDSPAGEM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 陰性對(duì)照組; 2: GST空載體對(duì)照組; 3: EtAMA1-GST實(shí)驗(yàn)組M: Protein Marker; 1: Negative control group; 2: GST control group; 3: EtAMA1-GST group

表1 GST pull-down篩選到與EtAMA1潛在作用的子孢子蛋白Table 1 Potential sporozoite proteins interacting with EtAMA1 screened by GST pull-down

3 討論

AMA-l 最早由 Deans 等從諾氏瘧原蟲（P. knowlesi）裂殖子的頂端復(fù)合體中篩選到[5]，隨后在弓形蟲[13]、泰勒蟲（Theileria）[14]、新孢子蟲（Neospora）[15]、球蟲[16]、巴貝斯蟲（Babesia）[17]等中相繼發(fā)現(xiàn)。在瘧原蟲和弓形蟲中的研究表明，AMA-1與棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck protein，RON）復(fù)合物結(jié)合形成運(yùn)動(dòng)連接環(huán)（moving junction，MJ），是蟲體成功入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。Alexander等[18]首先利用惡性瘧原蟲（P. falciparum）AMA-1（PfAMA-1）抗體免疫共沉淀了棒狀體頸部蛋白4（PfRON4），發(fā)現(xiàn)PfAMA-1和PfRON4都位于MJ[19]。隨后又鑒定了PfRON2和PfRON5，發(fā)現(xiàn)PfRON245以復(fù)合體形式存在，與PfAMA-1相互作用，在入侵宿主細(xì)胞時(shí)定位于MJ[20-22]。弓形蟲TgAMA-1通過TgRON2與RON蛋白復(fù)合物（TgRON2/4/5/8）連接，結(jié)合在MJ上，對(duì)速殖子入侵宿主細(xì)胞至關(guān)重要[23]。在前期研究中，Jiang等[9]對(duì)EtAMA1功能進(jìn)行了初步研究，抗體抑制的結(jié)果發(fā)現(xiàn)子孢子入侵率下降了70%，表明EtAMA1是子孢子宿主的關(guān)鍵蛋白，但機(jī)制尚不清楚。因此，本文對(duì)其潛在作用的子孢子蛋白進(jìn)行了篩選。

目前，用于篩選蛋白質(zhì)互作蛋白的方法主要包括酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、GST pulldown技術(shù)、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化技術(shù)以及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等[24]。GST pull-down 技術(shù)是將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST 融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白[25]。由于該技術(shù)具有可以使靶蛋白保持“天然”狀態(tài)，在體外驗(yàn)證蛋白間直接的相互作用時(shí)有較強(qiáng)的特異性。同時(shí)，含有的GST標(biāo)簽融合蛋白具有高通量和高選擇性等特點(diǎn)，使得GST pulldown 技術(shù)被廣泛應(yīng)用到互作蛋白篩選中。利用這一技術(shù)，Shen等[26]成功篩選出了肝細(xì)胞癌Nck1 蛋白的結(jié)合蛋白dermcidin；Zhang等[27]篩選出能與乙型肝炎病毒X 蛋白發(fā)生相互作用的apoA-I蛋白；李一柯[28]從12周齡人胎腦組織中“釣取”了4個(gè)與IE286相互作用的宿主蛋白：II型角蛋白（K2C1）、I型角蛋白（KIC10）、組蛋白H2B以及波形蛋白；柴政斌等[29]篩選到了與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感基因肽?；彼崦搧啺访涪粝嗷プ饔玫牡鞍诪镠L-60；鄭斌等[30]初步篩選出與弓形蟲微線體蛋白6羧基端MIC6C相互作用的蛋白為醛縮酶；趙文等[31]篩選出31個(gè)只在 PID3 介導(dǎo)的抗稻瘟病反應(yīng)中能與其特異結(jié)合的 PID3 互作蛋白，包括受體激酶、LRR類蛋白、ATP 酶、磷酸羧化酶和離子通道蛋白等。

GST pull-down 技術(shù)在篩選相互作用蛋白時(shí)存在一定的局限性，因此，在進(jìn)行GST pull-down 試驗(yàn)時(shí)，要充分考慮GST融合蛋白的純度、GST標(biāo)簽等因素可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)[32]。為了能最大程度地保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性，一般在獲取融合蛋白時(shí)傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度可溶性融合蛋白對(duì)GST pull-down的結(jié)果很關(guān)鍵[33]。本研究在表達(dá)EtAMA1-GST融合蛋白的初期，目的蛋白是以包涵體形式表達(dá)，通過改變溫度、時(shí)間以及IPTG濃度等誘導(dǎo)條件，確定當(dāng)IPTG終濃度為0.05 mmol/L條件下，16℃180 r/min培養(yǎng)24 h時(shí)，目的蛋白在上清中得以表達(dá)，獲得了可溶性蛋白。對(duì)純化獲得的融合蛋白，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示在75 kDa處有單一的目的條帶，進(jìn)一步證實(shí)了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。同時(shí)，本研究在利用GST pull-down篩選與EtAMA1發(fā)生互作的子孢子蛋白時(shí)，設(shè)置了GST空載體組和PBS組作為對(duì)照，以減少GST標(biāo)簽蛋白等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

EtAMA1是典型的I型跨膜蛋白，可分為 N-端的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和 C-端胞內(nèi)區(qū)，為了獲得可溶性蛋白，本研究?jī)H對(duì)其胞外區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)，并以EtAMA1-GST蛋白作為探針蛋白，通過GST pull-down技術(shù)篩選到了10個(gè)與EtAMA1存在潛在相互作用的子孢子蛋白，包括微線體蛋白（microneme protein，MIC）、糖酵解酶類、肌動(dòng)蛋白相關(guān)因子等，廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學(xué)過程。在獲得的10個(gè)子孢子蛋白中，未見有已知的能與AMA1發(fā)生作用的蛋白，但有能與其他蟲體或宿主蛋白發(fā)生作用的蛋白。柔嫩艾美耳球蟲EtMIC4是一種血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)蛋白（thrombospondin-related anonymous protein， TRAP），與Rhomboid蛋白存在一定的相互作用，且Rhomboid蛋白能夠切割底物EtMIC4蛋白[34]；其 EGF-like 結(jié)構(gòu)域與雞表皮表皮生長(zhǎng)因子受體（chicken epidermal growth factor receptor，CER）存在相互作用[35]。柔嫩艾美耳球蟲14-3-3 蛋白能與粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）RNA 結(jié)合域（TRBD）發(fā)生相互作用，可能對(duì)端粒酶活性具有負(fù)向調(diào)節(jié)的作用[36]。下一步，我們將對(duì)獲得蛋白的基因進(jìn)行克隆，利用酵母雙雜交、免疫共沉淀、BiFC等技術(shù)驗(yàn)證其與EtAMA1之間的關(guān)系，以獲得真正能與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，為闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主過程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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SCREENING OF THE POTENTIAL SPOROZOITE PROTEINS INTERACTING WITH EIMERIA TENELLA APICAL MEMBRANCE ANTIGEN-1

CUI Xiao-xia1, HUANG Bing1,3, ZHAO Qi-ping1, HAN Hong-yu1, ZHU Shun-hai1, XU Shuai-bing1, XIE Yu-xiang1, TANG Min1,2, YANG Zhi-yuan1,2, DONG Hui1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to screen the potential sporozoite proteins interacting with Eimeria tenella apical membrance antigen 1(EtAMA1), the ectodomain of EtAMA1was amplifed in PCR with the cDNAs of the E. tenella sporozoite as template. The PCR products were subcloned to pGEX-6P-1 vector for expression of the recombinant protein. The purif ed recombinant protein EtAMA1-GST was identif ed in Western blot. The results showed that a protein about 75 kDa in accordance with molecular weight of target protein was recognized by anti-GSTantibody, which conf rmed that the expressed product was EtAMA1-GST fusion protein. Glutathione sepharose beads were incubated with EtAMA1-GST, GST protein or PBS and then the beads were incubated with sporozoite lysates. Bound proteins were eluted by using the sample buffer and eluants were subject to SDS-PAGE. The separated bands were digested and analyzed by mass spectrometry. The resulting protein peptides were blasted with Eimeria proteins database deposited in Uniprot and 10 potential sporozoite proteins were obtained. These proteins, mainly including microneme proteins, glycolytic enzymes, actin-related proteins and some hypothetical proteins, are involved in many molecular processes, such as invasion, development and energy metabolism. These results were informative for further elucidating the molecular mechanism of EtAMA1 that plays an important role in Eimeria host invasion.

Eimeria tenella; apical membrance antigen 1; GST pull-down; interacting protein

S852.723

A

1674-6422（2017）03-0061-07

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（31672551，31272557）；上海市閔行區(qū)人才發(fā)展專項(xiàng)基金（201351）

崔曉霞，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

董輝，E-mail：donghui@shvri.ac.cn