膠體金免疫層析法對(duì)重金屬汞殘留的快速檢測(cè)

王 森，葉國(guó)華，陳笑笑，胡葉軍*，周麗燕

(1.紹興市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 紹興 312000； 2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051)

膠體金免疫層析法對(duì)重金屬汞殘留的快速檢測(cè)

王 森1，葉國(guó)華1，陳笑笑2，胡葉軍2*，周麗燕1

(1.紹興市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 紹興 312000； 2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051)

采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法，將抗重金屬汞單克隆抗體—膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上，將人工合成的重金屬汞抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測(cè)線(T線)，其與待測(cè)樣品中重金屬汞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的重金屬汞單克隆抗體，并通過(guò)T線和C線上肉眼可見(jiàn)的顏色顯示檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)水質(zhì)時(shí)，靈敏度最低值可達(dá)1 μg·L-1，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需3～5 min。膠體金免疫層析法具有較高的靈敏度及特異性，操作便捷，可用于快速檢測(cè)重金屬汞殘留。

重金屬汞； 半抗原； 免疫測(cè)定； 膠體金

重金屬污染是水污染的主要問(wèn)題之一，礦山開(kāi)采、金屬冶煉、化工生產(chǎn)廢水、施用農(nóng)藥化肥和生活垃圾等人為污染，以及地質(zhì)侵蝕、風(fēng)化等天然因素均能導(dǎo)致重金屬以各種形式進(jìn)入水體。汞是最為常見(jiàn)的重金屬之一，汞中毒以慢性為多見(jiàn)，主要癥狀為精神-神經(jīng)異常、齒齦炎、震顫，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生幻覺(jué)，急性中毒有腹痛、腹瀉、血尿等癥狀，20世紀(jì)50年代在日本發(fā)生的水俁病就是由于汞污染引起。我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)Ⅴ類地表水水質(zhì)中汞的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 μg·L-1，《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)中汞、鉛、鎘、銅的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為1 μg·L-1。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)水質(zhì)中重金屬的常見(jiàn)方法包括原子吸收光譜法(AAS)[1]、電感耦合等離子體法(ICP)[2]、原子熒光光譜法(AFS)[3]、溶出伏安法[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、分光光度法[6]、酶抑制法[7]、生物化學(xué)傳感器[8]等，其中AAS、ICP、AFS、HPLC雖然靈敏度高，幾乎可以用于所有重金屬的檢測(cè)，但樣品前處理和檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)或在線監(jiān)測(cè)，儀器設(shè)備的安裝環(huán)境和使用維護(hù)要求較高。

免疫膠體金快速檢測(cè)法是20世紀(jì)90年代興起的一種新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，與其他檢測(cè)方法相比，具有簡(jiǎn)便、快速、方便等優(yōu)點(diǎn)。這種檢測(cè)重金屬汞的免疫膠體金層析方法具有較高的靈敏度，適用于大規(guī)模樣本初篩和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維(Millipore公司)；重金屬離子(Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、佐劑(FCA、FICA)、檸檬酸三鈉、羊抗鼠IgG、海藻糖、Tween-20(美國(guó)Sigma)；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE日本化學(xué)同仁研究所)；聚乙二醇20000、HCl、Na2CO3、NaN3(華東醫(yī)藥有限公司)；PBS溶液、PBST溶液(試驗(yàn)室自配)；包被抗原(Hg-ITCBE-BSA)、免疫抗原(Hg-ITCBE-KLH)[9]、Hg單克隆抗體[10](試驗(yàn)室自制)。

BioJet XYZ3000型點(diǎn)膜儀(美國(guó)BioDot)；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Becman公司)；恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)業(yè)設(shè)備有限公司)；切割機(jī)(杭州市恒通設(shè)備有限公司)；膠體金讀數(shù)儀(杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司)；78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 試紙條和溶液配制

膠體金溶液配制。使用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金[11]。

金標(biāo)抗體溶液配制。取1 L膠體金溶液使用K2CO3及HCl調(diào)整至最適標(biāo)記pH值后，加入適量Hg2+螯合物單抗，放置12 h后加入5%BSA至BSA最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，離心純化后沉淀用0.01 mol·L-1PB溶液(含1%BSA和0.05%NaN3)重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試紙條組裝和樣本處理

如圖1所示，將稀釋好的Hg-ITBCE-BSA和羊抗鼠IgG按一定濃度噴于NC膜上，形成檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，將金標(biāo)抗體溶液噴至玻璃纖維上作為金標(biāo)結(jié)合墊，分別置于37 ℃烘箱干燥；將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上，切成3 mm寬試紙條后，裝入塑料模板中壓成試劑板。

圖1 試紙條的結(jié)構(gòu)

樣本處理。取水樣(經(jīng)螯合劑EDTA處理)1 mL于5 mL離心管中，加入3 mL PBST溶液，混勻，待檢。本試紙條采用對(duì)比法判定，若檢測(cè)線(T線)顯色淺于控制線(C線)顯色，則判定為陽(yáng)性；若檢測(cè)線(T線)顯色深于控制線(C線)顯色，或者顯色一樣深，則判定為陰性；若控制線(C線)沒(méi)有顯色，檢測(cè)線(T線)無(wú)論有無(wú)顯色，均判定為無(wú)效板。

1.2.3 T、C線包被濃度、金標(biāo)抗體包被量

將抗原Hg-ITCBE-BSA用PBS溶液(含3%甲醇)稀釋成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg·mL-1共8個(gè)濃度，稀釋后按常規(guī)噴量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作為T線，保持C線及金標(biāo)抗體濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，觀察T線顯色強(qiáng)度，讀取T/C值。

將羊抗鼠IgG用PBS溶液(含3%甲醇)稀釋成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg·mL-1，按噴量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作為C線，保持T線及金標(biāo)抗體濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，觀察C線顯色強(qiáng)度，讀取T/C值。

將金標(biāo)抗體包被到膠體金結(jié)合墊上(D525 nm=20，噴量分別為1.5、1.8、2.0、2.2、2.5、2.8、3.0、3.3、3.5 μL·cm-1)，保持T線及C線濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 值7.4的PBST滴定，觀察T、C線顯色強(qiáng)度，讀取T/C值。

1.2.4 檢測(cè)溫度

將所有組分均相同的試紙卡，在4 ℃，15 ℃，20 ℃，25 ℃，37 ℃這5個(gè)不同環(huán)境溫度條件下，用去離子水樣和1 μg·L-1Hg2+溶液樣本檢測(cè)，比較顯色情況和檢測(cè)結(jié)果差異。

1.2.5 試紙條檢測(cè)特性

試紙條檢出限。取去離子水添加Hg2+至最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，樣本處理后滴板檢測(cè)并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

試紙條特異性。取Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+稀釋成梯度濃度后經(jīng)樣本處理，分別使用試紙條檢測(cè)，記錄并比較結(jié)果。

試紙條穩(wěn)定性。將試紙條置于25 ℃下，分別于1、2、3、6、9、12個(gè)月后抽取2組，每組3條試紙條，使用去離子水樣及1 μg·L-1Hg2+水樣檢測(cè)，觀察顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 T、C線包被濃度、金標(biāo)抗體包被量

由表1可見(jiàn)，結(jié)合T線的顯色強(qiáng)度及顯色穩(wěn)定性情況，最終確定抗原的工作濃度范圍為0.8～1.2 mg·mL-1。

由表2可見(jiàn)，C線二抗的工作濃度范圍為0.8～1.2 mg·mL-1。

由表3可見(jiàn)，結(jié)合C/T線顯色深淺和靈敏度高低，金標(biāo)抗體的適宜包被量范圍為2.0～3.0 μL·cm-1。

表1 抗原工作濃度范圍

表2 羊抗鼠IgG工作濃度范圍

表3 金標(biāo)抗體包被量范圍結(jié)果

2.2 檢測(cè)溫度

由表4可見(jiàn)，檢測(cè)溫度影響跑板速度，37 ℃相對(duì)15～25 ℃平均快6 S，相對(duì)4 ℃平均快11.5 S。15～25 ℃下檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，4 ℃下檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏陽(yáng)，37 ℃下檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏陰。為避免出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，保證跑板順暢，建議檢測(cè)時(shí)采用的環(huán)境溫度為15～25 ℃。

表4 不同檢測(cè)溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 試紙條檢出限

用試紙條對(duì)Hg2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果當(dāng)Hg2+≥1 μg·L-1時(shí)，試紙條呈陽(yáng)性，當(dāng)Hg2+<1 μg·L-1時(shí)，試紙條呈陰性，故試紙條的檢出限為1 μg·L-1。

2.4 特異性試驗(yàn)

由表5可知，本試紙條中與常見(jiàn)重金屬Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+在100 μg·L-1濃度下無(wú)交叉反應(yīng)，故特異性較高。

表5 試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性

由表6可知，25 ℃下試紙條的陰性及檢出限濃度下的檢測(cè)結(jié)果在12個(gè)月內(nèi)保持不變，故其在25 ℃下至少可保存12個(gè)月。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

使用膠體金免疫層析技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)重金屬Hg2+的方法，試紙條對(duì)水中Hg2+的檢出限可達(dá)1 μg·L-1，滿足我國(guó)相關(guān)法規(guī)的要求。該方法前處理方法簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，可目測(cè)直接讀取試驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)過(guò)程只需3～5 min，可用于水中重金屬Hg2+的快速篩查，但陽(yáng)性結(jié)果仍需其他方法確證。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-03-23

紹興市公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014B70047)

王 森(1982—)，男，浙江新昌人，農(nóng)藝師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)工作，E-mail: 47419714@qq.com。

胡葉軍，E-mail: hyj664@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170635

S158

B

0528-9017(2017)06-1020-04

文獻(xiàn)著錄格式：王森，葉國(guó)華，陳笑笑，等. 膠體金免疫層析法對(duì)重金屬汞殘留的快速檢測(cè)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：1020-1023.