野雉尾金粉蕨微繁殖技術(shù)

管 菊，萬 勁，陳嘉裔

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.三江學(xué)院，江蘇 南京 210012； 3.昆明綠島園藝有限公司，云南 昆明 650224)

野雉尾金粉蕨微繁殖技術(shù)

管 菊1，萬 勁2，陳嘉裔3*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.三江學(xué)院，江蘇 南京 210012； 3.昆明綠島園藝有限公司，云南 昆明 650224)

以野雉尾金粉蕨的孢子為外植體，建立快繁體系。結(jié)果表明，野雉尾金粉蕨孢子HgCl2最佳處理時(shí)間為3 min，孢子最適萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS+2%蔗糖。增殖期間，降低糖濃度更有利于配子體的快速增殖，最適增殖培養(yǎng)基為1/2MS+1%蔗糖。1/2MS+2%蔗糖為最適孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，待幼孢子體長至3～5 cm時(shí)，即可出瓶煉苗，煉苗最優(yōu)基質(zhì)為草炭+蛭石(1∶1)。

野雉尾金粉蕨； 孢子； 微繁殖

野雉尾金粉蕨(Onychiumjaponicum)，又名中華金粉蕨、柏香蓮，為中國蕨科金粉蕨屬植物，常生于海拔50～2 200 m的林下溝邊或灌叢陰處，主要分布于秦嶺以南、廣東以北地區(qū)，云南產(chǎn)綏江、大關(guān)、宣威等地[1]。野雉尾金粉蕨生長旺盛，葉密呈叢狀，似雞尾形，造型別致，優(yōu)雅飄逸，極適宜于盆栽或垂吊栽培觀賞。

試驗(yàn)采用微繁殖技術(shù)建立其快繁體系，將對(duì)保護(hù)野雉尾金粉蕨野生資源不受破壞、合理進(jìn)行開發(fā)利用有著重要意義，同時(shí)也對(duì)促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展、保持生物多樣性及維護(hù)生態(tài)平衡具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野雉尾金粉蕨孢子采自云南省昆明市金殿蕨類植物園，采集日期2015年10月，采集后放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)培養(yǎng)基以MS、1/2MS為基本成分，分別附加0.4%的1 500 g·cm-2強(qiáng)度卡拉膠以及不同濃度的蔗糖，調(diào)整pH值在5.8～6.0，于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。使用日本三洋MLR-351H型人工可控氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度設(shè)定為3 000 lx，每日光照時(shí)長18 h，培養(yǎng)溫度恒定25 ℃，培養(yǎng)濕度恒定80%。

1.2.2 孢子預(yù)處理

為使孢子滅菌取得更好效果，首先對(duì)孢子進(jìn)行預(yù)處理，使孢子被水充分浸潤，并進(jìn)一步去雜。

稱取1 mg供試孢子，置于5 mL離心管內(nèi)，滴入無菌水，充分振蕩后以3 000 r·min-1離心1 min，棄去上清液，重復(fù)2次，至上清液無肉眼可見雜質(zhì)后，再次充分振蕩，得到的即純度較高的孢子懸濁液，備用。

1.2.3 孢子滅菌

使用一次性無菌滴管吸取1 mL孢子懸濁液，滴入濾紙疊成的紙包內(nèi)，置于75%的酒精中浸泡約15 s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2(使用前添加1～2滴吐溫-80)浸泡滅菌，設(shè)置30 s及1、3、5 min不同時(shí)長的滅菌處理組。浸泡滅菌后，用無菌水清洗5～6次，清洗總時(shí)長不少于5 min，然后用滴管吸取濾紙袋內(nèi)的孢子懸濁液，滴于1/2MS+1%蔗糖培養(yǎng)基中，輕輕搖晃，使懸浮液均勻分布于培養(yǎng)基上。試驗(yàn)每個(gè)處理接種6瓶，重復(fù)4次。接種后每日取樣，使用顯微鏡對(duì)孢子萌發(fā)進(jìn)行鏡檢，使用Nikon ECLIPSE Ti倒置顯微鏡進(jìn)行拍照記錄，5 d后對(duì)污染率進(jìn)行調(diào)查，20 d后統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率檢測(cè)方法為隨機(jī)鏡檢，隨機(jī)抽取處理組中4瓶，以100倍的放大倍數(shù)，在每瓶內(nèi)隨機(jī)選擇4個(gè)視野進(jìn)行觀察，對(duì)視野內(nèi)孢子進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)，以出現(xiàn)綠色配子體細(xì)胞作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 孢子萌發(fā)培養(yǎng)

將孢子懸濁液按先前得出的最適滅菌方法進(jìn)行處理，處理后分別接種于不同成分的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，每處理20瓶，重復(fù)3次。接種7 d后，每隔2 d觀察和記錄配子體的生長發(fā)育狀況，30 d后結(jié)束調(diào)查。

1.2.5 增殖培養(yǎng)

將原葉體充分分散成單個(gè)個(gè)體，挑選出其中長勢(shì)良好、大小相近的原葉體個(gè)體，分別接種于不同培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。使用不同培養(yǎng)基成分(A)、不同蔗糖含量(B)、不同pH值(C)的組合對(duì)原葉體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，試驗(yàn)采用L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，1～3水平因素A分別為MS、1/2MS和1/4MS，B分別為1%、2%和3%，C分別為5.8、6.0和6.2。處理組合為A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1和A3B3C2。

每瓶培養(yǎng)基接原葉體10棵，每種培養(yǎng)基接20瓶，重復(fù)3次，為方便數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在接種時(shí)原葉體個(gè)體之間均需保留一定距離，均勻分布于培養(yǎng)基上。接種7 d后開始觀察并記錄生長狀況，觀察記錄原葉體長勢(shì)、增殖狀況，60 d后對(duì)原葉體長勢(shì)、增殖倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 幼孢子體誘導(dǎo)

將長勢(shì)良好、大小相近的原葉體個(gè)體分別接入以下孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。①1/2MS；②1/2MS+1%蔗糖；③1/2MS+2%蔗糖；④1/2MS+3%蔗糖。試驗(yàn)每組接種15瓶，重復(fù)3次。7 d后，每隔2 d觀察并記錄生長狀況，不再轉(zhuǎn)接，60 d后對(duì)誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 煉苗與移栽

當(dāng)幼孢子體長至3～5 cm時(shí)進(jìn)行馴化移栽。首先在培養(yǎng)室半開瓶蓋放置3 d，然后用鑷子從瓶內(nèi)取出植株，用自來水沖洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，移栽到不同基質(zhì)的穴盤中。1號(hào)草炭，2號(hào)蛭石，3號(hào)草炭+蛭石(1∶1)。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定培養(yǎng)溫度25 ℃，光照12 h，濕度90%。45 d后，對(duì)根長、苗高、狀態(tài)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體成活率的影響

由表1可知，隨著HgCl2滅菌時(shí)間的增加，污染率大幅降低，說明HgCl2對(duì)于孢子表面所攜帶的污染物具有較好的滅殺效果。但隨著滅菌時(shí)間的延長，孢子的萌發(fā)活性也會(huì)受到影響。結(jié)果表明，75%的酒精處理15 s后，再用0.1% HgCl2處理3 min，為野雉尾金粉蕨孢子的最佳滅菌方法。

表1 不同滅菌處理對(duì)野雉尾金粉蕨孢子 成活率的影響

2.2 不同濃度無機(jī)鹽及糖對(duì)孢子萌發(fā)及原葉體形成的影響

接種4 d后于顯微鏡下即可觀察到孢子大量萌發(fā)，萌發(fā)后逐漸形成絲狀體和片狀體，30 d后可形成直徑0.2 cm左右的綠色原葉體。經(jīng)相關(guān)性分析可得，萌發(fā)率與MS鹽濃度相關(guān)系數(shù)為-0.998，萌發(fā)率與蔗糖濃度的相關(guān)系數(shù)為-0.016，萌發(fā)率與MS鹽濃度在0.01水平上極顯著相關(guān)，說明在本試驗(yàn)梯度下，野雉尾金粉蕨孢子萌發(fā)情況主要只與無機(jī)鹽濃度高低有關(guān)，而與糖濃度基本無關(guān)，較低的無機(jī)鹽水平有利于孢子的萌發(fā)，1/2MS培養(yǎng)基為孢子萌發(fā)最適培養(yǎng)基。由表2可知，野雉尾金粉蕨孢子萌發(fā)后，糖濃度與無機(jī)鹽濃度均對(duì)其生長均有一定影響，萌發(fā)后的孢子在不加糖的培養(yǎng)基上生長速度極為緩慢，綠色絨狀體最小，較低的無機(jī)鹽水平以及一定的糖濃度更有利于孢子萌發(fā)后的生長，6號(hào)1/2MS+2%蔗糖培養(yǎng)基最適于孢子萌發(fā)生長。

表2 不同培養(yǎng)基下野雉尾金粉蕨孢子萌發(fā)情況

注：+號(hào)代表配子體生長量，數(shù)量越多表示生長量越大。

2.3 不同濃度無機(jī)鹽、糖及pH對(duì)原葉體增殖的影響

在原葉體增殖階段，低鹽分、低濃度蔗糖更加適宜原葉體的增殖生長。原葉體在高糖環(huán)境下，雖然增殖倍數(shù)也較高，但自身體積變小，且出現(xiàn)團(tuán)塊狀生長、相互之間無法分離，這對(duì)于今后原葉體的轉(zhuǎn)接擴(kuò)增、幼孢子體的形成都極為不利。

由表3可知，1/2MS+1%蔗糖的4號(hào)培養(yǎng)基為原葉體增殖最適培養(yǎng)基，在該配方下，原葉體無性增殖數(shù)量多，且原葉體個(gè)體形態(tài)較大、相互間質(zhì)地疏松可分開，有利于原葉體的轉(zhuǎn)接擴(kuò)增以及幼孢子體的誘導(dǎo)。培養(yǎng)基MS鹽濃度與增殖倍數(shù)呈顯著相關(guān)(F=726.500，P=0.001)，說明主要影響增殖情況的仍為培養(yǎng)基MS鹽濃度，而當(dāng)pH值處于5.8～6.2時(shí)，對(duì)增殖培養(yǎng)幾乎沒有影響。

表3 不同成分培養(yǎng)基處理組合下野雉尾金粉蕨原葉體增殖生長情況

2.4 孢子體誘導(dǎo)

不同糖濃度下孢子體誘導(dǎo)的具體情況見表4。原葉體停止轉(zhuǎn)接后，不加糖配方的培養(yǎng)基沒有誘導(dǎo)出孢子體，且原葉體生長極為緩慢，出現(xiàn)了部分死亡的現(xiàn)象。高糖濃度配方的培養(yǎng)基上，原葉體不斷增殖繼續(xù)團(tuán)塊狀生長，同樣沒有誘導(dǎo)出孢子體。1%、2%糖濃度培養(yǎng)基在停止轉(zhuǎn)接后約40 d即有孢子體產(chǎn)生，60 d后統(tǒng)計(jì)孢子體生長情況，1%蔗糖濃度培養(yǎng)基相比2%蔗糖濃度培養(yǎng)基孢子體產(chǎn)生數(shù)量少、長勢(shì)弱、葉片發(fā)黃。由此可見，1/2MS+2%蔗糖培養(yǎng)基為孢子體誘導(dǎo)適宜培養(yǎng)基。

2.5 煉苗與移栽

45 d后煉苗及移栽情況見表5、圖1。由于蕨類在煉苗時(shí)孢子體已有根系長出，植株具備完整的根、莖、葉結(jié)構(gòu)，煉苗成活率很高，期間注意噴水、遮蔭和保溫即可。在以蛭石為基質(zhì)的煉苗盤中，由于蛭石養(yǎng)分含量較少，故幾乎沒有生長量，新生葉萌發(fā)數(shù)量少、植株細(xì)長瘦弱。在泥炭基質(zhì)中的苗新葉數(shù)量、根系數(shù)量、苗高、長勢(shì)等均沒有在草炭+蛭石(1∶1)的混合栽培介質(zhì)中的好，這可能是由于添加蛭石后，介質(zhì)的透氣性得到改善，從而更有利于植株根系的生長，促進(jìn)了植物的營養(yǎng)吸收。

表4 60 d后不同糖濃度下孢子體誘導(dǎo)情況

注：+數(shù)量代表誘導(dǎo)數(shù)量多少。

表5 野雉尾金粉蕨的煉苗與移栽

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著；+代表植株長勢(shì)情況。

圖1 野雉尾金粉蕨配子體增殖、孢子體誘導(dǎo)、煉苗移栽情況

3 討論

本試驗(yàn)以野雉尾金粉蕨的孢子作為外植體，經(jīng)滅菌處理后建立其無菌繁殖體系，理論上可以無限數(shù)量增殖生長，避免常規(guī)孢子繁殖中孢子材料有限[2]的問題；在配子體增殖階段，于適宜的培養(yǎng)配方、培養(yǎng)環(huán)境下，其增殖量每60 d可達(dá)20.27倍，與常規(guī)孢子繁殖研究相比，大大提高了繁殖效率；煉苗移栽環(huán)節(jié)中，煉苗方法簡單、栽培基質(zhì)配方易于調(diào)配，45 d左右即可正常養(yǎng)護(hù)，以上這些都使得短時(shí)間內(nèi)獲得標(biāo)準(zhǔn)化野雉尾金粉蕨種苗成為可能，這對(duì)于開發(fā)利用野雉尾金粉蕨資源具有重要意義。

在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，野雉尾金粉蕨微繁殖各階段中，1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較MS培養(yǎng)基效果均更好，這說明野雉尾金粉蕨適合于較低無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基上生長，這一現(xiàn)象與吳芹等[3-4]研究觀點(diǎn)基本一致，說明蕨類的微繁殖可能都需要較低的無機(jī)鹽水平。在孢子體誘導(dǎo)階段，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同蕨類在離體培養(yǎng)微繁殖過程中，幼孢子體的產(chǎn)生的狀況差異很大。如本試驗(yàn)中的野雉尾金粉蕨，即屬于配子體可增殖、孢子體可瓶內(nèi)誘導(dǎo)的蕨類，由于其配子體增殖倍率已經(jīng)很高，故試驗(yàn)過程中沒有再誘導(dǎo)愈傷的必要，快繁可直接通過增殖配子體產(chǎn)生孢子體來實(shí)現(xiàn)。而對(duì)于部分配子體難以快速增殖[5]、孢子體難以瓶內(nèi)發(fā)生[6]及無法獲得孢子材料[7]的這類蕨類，為提高增殖倍數(shù)，就需通過調(diào)整培養(yǎng)基配方來進(jìn)行，如通過誘導(dǎo)愈傷、誘導(dǎo)GGB、誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽等途徑來實(shí)現(xiàn)植株的高速增殖。

本試驗(yàn)只針對(duì)糖濃度以及培養(yǎng)基成分對(duì)于生長的影響進(jìn)行了初步研究，而韋景楓等[8]在研究鳳丫蕨微繁殖時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過添加NAA、BA等外源激素于培養(yǎng)基內(nèi)可以有效提高增殖倍數(shù)，野雉尾金粉蕨微繁殖過程中是否也存在這一現(xiàn)象，在添加不同濃度激素、不同激素組合下是否還可以繼續(xù)提高配子體增殖倍數(shù)、孢子體誘導(dǎo)率等，這些有待做進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-01-17

西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(C16051)

管 菊(1991—)，女，云南宣威人，碩士研究生，研究方向?yàn)橛^賞植物繁殖與栽培，E-mail：710029000@qq.com。

陳嘉裔，從事觀賞植物育種與繁殖工作，E-mail：wansju@foxmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170628

S68

B

0528-9017(2017)06-0996-04

文獻(xiàn)著錄格式：管菊，萬勁，陳嘉裔. 野雉尾金粉蕨微繁殖技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：996-999.