一株海南土著莢膜紅細(xì)菌的培養(yǎng)特性

冼健安+張秀霞+李軍濤+鄭佩華+魯耀鵬+王冬梅

摘 要：針對(duì)篩選到的一株海南土著的高活性莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）菌株QH03，開(kāi)展其最適培養(yǎng)條件研究。結(jié)果顯示：其最適碳源為乙酸鈉和酵母膏，最適氮源為氯化銨和硫酸銨，適宜光照強(qiáng)度為3 000 ～8 000 lx，最適溫度為30～35 ℃，最適初始pH為7.0～7.5，最適鹽度為10‰～30‰。

關(guān)鍵詞：光合細(xì)菌；莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）；培養(yǎng)條件

光合細(xì)菌是最早出現(xiàn)具有原始光能合成體系的原核生物，可具有多種功能，包括固氮、脫氮、固碳、硫化物氧化等，與氮、磷、硫循環(huán)具有密切的關(guān)系，在自然界的凈化過(guò)程中擔(dān)當(dāng)著十分重要的角色。因此，人們利用光合細(xì)菌的生理和生態(tài)特點(diǎn)，將其應(yīng)用于廢水治理當(dāng)中，取得了顯著的效果。研究表明光合細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果也十分顯著[1]。光合細(xì)菌不但能作為凈水劑改善池塘水質(zhì)，還因其含有豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及生物活性物質(zhì)輔酶Q，可作為魚(yú)蝦貝幼體及輪蟲(chóng)等動(dòng)物性生物餌料的餌料，以及水產(chǎn)動(dòng)物的飼料添加劑[1]。光合細(xì)菌的使用可顯著提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、存活率、免疫功能和抗病能力，從而提高養(yǎng)殖產(chǎn)量[2-4]。光合細(xì)菌產(chǎn)品作為一種無(wú)毒害副作用和藥物殘留的微生態(tài)制劑，在當(dāng)前保護(hù)環(huán)境、生態(tài)養(yǎng)殖及食品安全等的社會(huì)導(dǎo)向下，十分值得進(jìn)一步的推廣應(yīng)用。

目前應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的光合細(xì)菌產(chǎn)品繁多，但產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，其中不乏添加色素、活力低等的偽劣產(chǎn)品。另一方面，海南地處熱帶地區(qū)，氣候條件特殊，但針對(duì)海南土著光合細(xì)菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，作者從海南養(yǎng)殖池塘中篩選海南土著的光合細(xì)菌菌種，以期研發(fā)能更好地適用于海南地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的高效光合細(xì)菌產(chǎn)品。從大量分離的菌株中，篩選了一株生長(zhǎng)速度快、菌液鮮紅的菌株，編號(hào)為QH03，經(jīng)鑒定該菌株為莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）。為進(jìn)一步研究該菌株的應(yīng)用價(jià)值，針對(duì)該菌株開(kāi)展了適宜碳源、氮源、光照度、溫度、初始pH以及鹽度等培養(yǎng)特性研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株

本試驗(yàn)用的菌株由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所從海南高產(chǎn)對(duì)蝦土塘的養(yǎng)殖水體中分離獲得，經(jīng)鑒定為莢膜紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus（菌株編號(hào)QH03）。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

每1 L液體培養(yǎng)基中，含有以下成分：CH3COONa 2 g、NH4Cl 1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.3 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 50 mg、MnSO4·H2O 2.5 mg、生長(zhǎng)素貯液（生長(zhǎng)素1 mg、煙酸100 μg、對(duì)氨基苯甲酸10 mg、維生素B1 100 mg，蒸餾水1 L）10 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。

1.3 生長(zhǎng)測(cè)定

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在660 nm的OD值。

1.4 培養(yǎng)特性研究

1.4.1 碳源 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不同的碳源替代CH3COONa，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基，將活化的菌種以20%接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lx下培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況判斷其對(duì)不同碳源的利用情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.2 氮源 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不同的氮源替代NH4Cl，配制成含有不同氮源的培養(yǎng)基，將活化的菌種以20%接種到已滅菌的培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lx下培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況判斷其對(duì)不同氮源的利用情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.3 光照強(qiáng)度 將活化的菌種以20%接種到已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于不同的光照強(qiáng)度下培養(yǎng)：1 000 、2 000、3 000、4 000、6 000和8 000 lx，溫度30 ℃，培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.4 溫度 將活化的菌種以20%接種到已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于不同的溫度下培養(yǎng)：15、20、25、30、35和40 ℃，光照度3 000 lx，培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.5 初始pH值 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為不同的pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，將活化的菌種以20%接種，于溫度30 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lx下培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.6 鹽度 將海水進(jìn)行過(guò)濾，以蒸餾水進(jìn)行稀釋配制不同鹽度：0、5‰、10‰、15‰、20‰、25‰和30‰。以不同鹽度的稀釋海水配制培養(yǎng)基（去除NaCl），將活化的菌種以20%接種，于溫度30 ℃、光照強(qiáng)度3 000 lx下培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液測(cè)定OD660。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 碳源

莢膜紅細(xì)菌菌株QH03對(duì)碳源利用結(jié)果如表1所示，菌株QH03對(duì)乙酸鈉和酵母膏的利用率很高，對(duì)丙酸鈉、谷氨酸、蘋(píng)果酸和醋酸有較高的利用率，對(duì)乙醇、琥珀酸鈉、甘油、葡萄糖、蔗糖和果糖的利用率較低，不能利用檸檬酸鈉、酒石酸鈉、硫代硫酸鈉、苯甲酸鈉和甘露糖。

“-”表示對(duì)該物質(zhì)不利用，“+”表示對(duì)該物質(zhì)利用率較低，“++”表示對(duì)該物質(zhì)利用率較高，“+++”表示對(duì)該物質(zhì)利用率很高，下表同。

2.2 氮源

莢膜紅細(xì)菌菌株QH03對(duì)氮源利用結(jié)果如表2所示，菌株QH03對(duì)氯化銨和硫酸銨的利用率很高，對(duì)蛋白胨有較高的利用率，對(duì)硝酸鈉的利用率較低，不能利用亞硝酸鈉和尿素。

2.3 光照強(qiáng)度

光照強(qiáng)度對(duì)QH03菌株生長(zhǎng)的影響如圖1所示。在1 000至8 000 lx的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，該菌均能生長(zhǎng)，光照強(qiáng)度越大，其生長(zhǎng)速度越快，生物量越大。在光照強(qiáng)度為3 000～8 000 lx時(shí)，生長(zhǎng)情況良好，達(dá)到6 000～8 000 lx時(shí)，生長(zhǎng)速度最快。在2 000 lx以下時(shí)，生長(zhǎng)速度受到了較大的抑制。

2.4 溫度

溫度對(duì)QH03菌株生長(zhǎng)的影響如圖2所示。該菌在溫度為15～40 ℃的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。在15 ℃時(shí)，菌的生長(zhǎng)速度最慢；在15～35 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，菌的生長(zhǎng)速度也提高，在25～35 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，達(dá)到30～35 ℃時(shí)，生長(zhǎng)速度最快；溫度繼續(xù)提高到40 ℃時(shí)，對(duì)其生長(zhǎng)造成了一定的抑制性。

2.5 初始pH值

初始pH值對(duì)QH03菌株生長(zhǎng)的影響如圖3所示。該菌在初始pH為6.0～8.5的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。在pH值為6.5～8.0時(shí)，生長(zhǎng)狀況良好，在pH值為7～7.5時(shí)，生長(zhǎng)速度最快。pH值過(guò)低或過(guò)高均對(duì)該菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生較大的抑制作用。

2.6 鹽度

鹽度對(duì)QH03菌株生長(zhǎng)的影響如圖4所示。該菌在鹽度為0～30‰的范圍均能生長(zhǎng)。在鹽度為10‰～30‰的狀態(tài)下，菌的生長(zhǎng)速度顯著高于鹽度為0～5‰。

3 討論

從結(jié)果可見(jiàn)，莢膜紅細(xì)菌菌株QH03可利用的碳源較為廣泛，其中對(duì)乙酸鈉和酵母膏的利用率最高，以丙酸鈉、谷氨酸、蘋(píng)果酸和醋酸為碳源時(shí)，生長(zhǎng)狀況也較為良好。適宜氮源以銨鹽為主，對(duì)有機(jī)氮的尿素以及亞硝態(tài)氮的亞硝酸鈉均不可利用。

光照強(qiáng)度是影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)速度的最重要因素之一。從結(jié)果可看出，菌株QH03的適宜光照強(qiáng)度在3 000～8 000 lx，在光照強(qiáng)度為3 000 lx以上時(shí)，菌的生長(zhǎng)良好，光照強(qiáng)度達(dá)到6 000 lx以上時(shí)，生長(zhǎng)速度還能進(jìn)一步提高，但提高程度有限。如果以該菌株作為規(guī)模化生產(chǎn)的菌種，考慮生產(chǎn)成本，則以3 000 lx為宜。從海底污泥中分離的莢膜紅假單胞菌的適宜光照強(qiáng)度則偏低，為1 600～3 000 lx，超過(guò)3 000 lx時(shí)，對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用[5]。從寧波蝦塘底泥中分離的莢膜紅假單胞菌的最適光照強(qiáng)度為2 000～5 000 lx[6]。本研究所用的菌株QH03分離自池塘表面水體，接受自然光照的強(qiáng)度較大，因此相比較分離自底泥的菌株，其光照強(qiáng)度需求較高。

溫度與菌體的生長(zhǎng)代謝速率關(guān)系密切，由結(jié)果可見(jiàn)，溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于菌株QH03的生長(zhǎng)，其在25～35 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，最適溫度范圍為30～35 ℃，與從洛河水中分離的莢膜紅假單胞菌的研究結(jié)果較一致[7]；從廣東臺(tái)山海底污泥中分離的莢膜紅假單胞菌的最適溫度為25～28 ℃[5]；從寧波蝦塘底泥中分離的莢膜紅假單胞菌的最適溫度則為27.5～30 ℃[6]。菌株QH03來(lái)源于海南熱帶地區(qū)的養(yǎng)殖池塘，因此更能適應(yīng)較高的生長(zhǎng)溫度。

初始pH值對(duì)菌株QH03生長(zhǎng)具有十分明顯的影響，結(jié)果顯示菌株QH03能較好地適應(yīng)的pH范圍為6.5～8.0，表明該菌株的pH適應(yīng)范圍較廣，其中pH為7.0～7.5時(shí)，可達(dá)到最佳的生長(zhǎng)速度。易力等從洛河水中分離的莢膜紅假單胞菌的最適pH為6～7[7]；金珊等從寧波蝦塘底泥分離的莢膜紅假單胞菌的最適pH為6.5～75[6]。光合細(xì)菌的大量繁殖會(huì)導(dǎo)致菌液pH的上升，雖然pH上升意味著光合細(xì)菌處于生長(zhǎng)旺盛階段，但pH升高至超過(guò)生長(zhǎng)適宜范圍時(shí)，便會(huì)抑制菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯并逐漸衰亡，因此初始pH應(yīng)盡量控制在較低的適應(yīng)水平。為達(dá)到最佳的生長(zhǎng)速度，對(duì)菌株QH03進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，其培養(yǎng)基以pH 7.0為宜。

為確定菌株QH03的咸淡水適用范圍，分析了其適宜生長(zhǎng)的鹽度。由結(jié)果可見(jiàn)，菌株QH03的適宜鹽度范圍十分廣泛，可在淡水至30‰海水中正常生長(zhǎng)，尤其在10‰～30‰海水中生長(zhǎng)情況較好。該菌株篩選自海南沿海地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘，養(yǎng)殖水體為海水，其鹽度為28‰～30‰，因此該菌株更能適應(yīng)高鹽度的水體。從洛河水中分離的莢膜紅假單胞菌的較為適宜NaCl鹽度為05%～2%[7]；從寧波蝦塘底泥分離的莢膜紅假單胞菌的適宜NaCl鹽度為2.5%～5.0%[6]。

本研究所選用的莢膜紅細(xì)菌菌株QH03為海南土著菌種，結(jié)果顯示其碳源適應(yīng)范圍廣，能夠很好地利用銨鹽，光照強(qiáng)度為3 000 lx以上可生長(zhǎng)良好，適宜溫度25～35 ℃，適宜pH6.5～8.0，適宜鹽度范圍廣，淡水和海水中均可適用，表明該菌株在海南熱帶地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有一定的應(yīng)用潛力，可作進(jìn)一步的應(yīng)用性研究。

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（收稿日期：2017-02-07）