線粒體自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纖維化中的作用研究

劉開翔，占志朋，謝席勝

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637001)

線粒體自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纖維化中的作用研究

劉開翔，占志朋，謝席勝

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637001)

目的：建立百草枯(paraquat，PQ)中毒大鼠模型，觀察不同階段肺線粒體膜電位(JC-1染色)、調(diào)控線粒體自噬關(guān)鍵性蛋白PINK1、Parkin及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化，探討線粒體自噬是否參與PQ中毒肺纖維化的發(fā)生。方法：成年雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常對照組(n=6)、模型組(n=36)，模型組下設(shè)2 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只大鼠。使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型。通過流式細(xì)胞儀檢測血紅細(xì)胞ROS濃度；HE染色和Masson染色觀察PQ中毒后肺組織病理損害；JC-1染色檢測肺組織線粒體膜電位變化；Western blot檢測PINK1、Parkin蛋白變化。結(jié)果：與對照組相比，隨著PQ中毒時(shí)間的延長，肺纖維化病理評分較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PQ組ROS熒光陽性強(qiáng)度率比值在中毒后2 h顯著升高，中毒后12 h達(dá)高峰后逐漸下降(P<0.05)，中毒后14 d與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PQ組肺組織JC-1紅綠熒光比均較對照組降低，Western blot提示隨中毒時(shí)間延長，PINK1及Parkin蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PQ組肺組織JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01)。在PQ中毒12 h內(nèi)，血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與JC-1紅綠熒光比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712，P<0.01)，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.01；r=0.484，P<0.01；r=0.602，P<0.05)。結(jié)論：PQ中毒導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生了明顯氧化應(yīng)激，誘發(fā)了線粒體自噬。ROS的產(chǎn)生與線粒體自噬的發(fā)生密切相關(guān)，共同參與了PQ大鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

百草枯；肺纖維化；線粒體自噬；PINK1；Parkin；氧化應(yīng)激

百草枯(paraquat，PQ)又名“對草快”、“克無蹤”，是我國廣大農(nóng)村地區(qū)廣泛應(yīng)用的季胺類高效能除草劑，同時(shí)也是目前致人類中毒死亡率最高的除草劑。PQ中毒后可造成體內(nèi)肺、腎上腺和腦等器官損傷。其特征性病變是肺損傷，致死率極高。PQ導(dǎo)致的肺損傷主要表現(xiàn)為肺泡炎、急性肺水腫，以及進(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化[1]。

當(dāng)PQ進(jìn)入體內(nèi)被肺泡上皮細(xì)胞主動(dòng)攝取后，PQ通過一系列連鎖反應(yīng)產(chǎn)生大量的自由基，構(gòu)成活性氧類(reactive oxygen species，ROS)系統(tǒng)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，ROS不僅通過脂質(zhì)過氧化參與肺泡上皮細(xì)胞的凋亡[4]，還能通過DNA損傷、線粒體功能障礙、炎癥因子活化、細(xì)胞因子激活、蛋白酶失衡等途徑參與肺纖維化的發(fā)生[2,5-6]。

通常機(jī)體在各種因素(如低氧、饑餓、光致福照、氧化應(yīng)激等)刺激下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生去極化損傷以及老化的線粒體被特異性地包裹進(jìn)自噬體中，并通過溶酶體被降解,這個(gè)過程稱為線粒體自噬。百草枯誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生的過程中，線粒體既是主要場所，又是自由基損傷的首要細(xì)胞器。當(dāng)PQ進(jìn)入線粒體后，經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)，細(xì)胞功能受損，甚至出現(xiàn)凋亡/壞死。PQ中毒時(shí)產(chǎn)生的大量ROS能否誘導(dǎo)肺發(fā)生線粒體自噬，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化呢？目前對此問題的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道，其潛在的分子機(jī)制更是未闡明。

本研究通過建立PQ中毒大鼠模型，觀察PQ中毒大鼠不同階段肺線粒體膜電位及在線粒體自噬這一特殊過程中, 具有關(guān)鍵性調(diào)控作用的細(xì)胞線粒體外膜蛋白PINK1及胞質(zhì)蛋白Parkin的變化，初步探討線粒體自噬是否參與PQ中毒誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肺纖維化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

6周齡雄性清潔、健康SD大鼠42只，體重(200±20)g(川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。20%的PQ溶液(先正達(dá)-中國投資有限公司)。戊巴比妥鈉 (分析純，蘇州瑞和)，活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；線粒體JC-1熒光探針試劑盒(上海貝博生物試劑公司)、線粒體蛋白提取試劑盒(上海貝博生物試劑公司)。anti-PINK1(Santa Cruz Biotechnology)、anti-Parkin(Santa Cruz Biotechnology)，鼠抗β-actin 單克隆抗體(上海生工生物工程股份有限公司)。25%戊二醛、HE染色試劑盒、MASSON染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)。流式細(xì)胞儀(FC500，Beckman公司)。正置顯微鏡(Nikon 80i，Nikon公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將健康成年雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為對照組(生理鹽水灌胃)6只，染毒組(PQ 50 mg/kg，灌胃)36只。各組分別于灌胃后2 h、12 h、24 h、72 h、7 d和14 d各取6只，2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，于-4 ℃冰箱中保存。取部分新鮮肺組織于潔凈試管中保存；部分肺組織用%戊二醛溶液浸泡，-4 ℃冰箱中保存；余肺組-80 ℃冰箱中保存。

1.3 動(dòng)物模型建立

及根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，中毒組用20%PQ溶液按50 mL/kg一次性灌胃建立PQ中毒模型，對照組用生理鹽水按50 mL/kg一次性灌胃。灌胃后以無嘔吐、抽搐、呼吸困難、呼吸頻率改變等情況視為灌胃成功[7]。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)密觀察并記錄動(dòng)物的行為改變，以出現(xiàn)食欲降低、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)蓬松、鼠尾發(fā)紺、呼吸困難、易捕捉等標(biāo)準(zhǔn)選擇中毒組模型動(dòng)物。

1.4 血標(biāo)本采集和活性氧檢測

腹腔注射20%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉實(shí)驗(yàn)對象，開腹分離結(jié)蹄組織暴露腹主動(dòng)脈，以5 mL空針迅速抽取1 mL血液置于血常規(guī)管中保存于4 ℃冰箱，按照活性氧檢測試劑盒操作。

1.5 線粒體膜電位的檢測

取新鮮肺組織使用玻璃勻漿器將肺組織制成細(xì)胞懸液，采用JC-1綠色熒光探針檢測線粒體膜電位，具體步驟按JC-1熒光探針試劑盒說明操作。

1.6 肺組織HE、Masson染色

將大鼠右肺取下，以肺門為中心，水平切斷肺組織，留取大小約1 cm3的肺組織，用10%中性福爾馬林固定，肺組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，用于制備石蠟切片。3 mm切片，行HE、Masson染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。參照Szapiel[8]方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。具體方法如下：(1)肺泡炎,分為4級(jí)：無肺泡炎0分；輕度肺泡炎1分，單核細(xì)胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；中度肺泡炎2分，受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重；重度肺泡炎3分，面積大于50%，偶見肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成的實(shí)變。(2)肺纖維化：無肺纖維化0分；輕度肺纖維化1分，受累面積<20%；中度肺纖維化2分，受累面積20%～50%；重度肺纖維化3分，受累面積>50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

1.7 Western blot印跡

取新鮮肺組織使用玻璃勻漿器將肺組織進(jìn)行勻漿，鏡下觀察細(xì)胞破碎率80%以上，按線粒體蛋白提取試劑盒說明提取線粒體蛋白。參考文獻(xiàn)方法，采用BCA法定量蛋白濃度[9]。每個(gè)上樣孔上樣15 μg蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。用2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫孵育2 h，然后加兔抗鼠PINK1抗體(1∶500)，兔抗鼠Parkin抗體(1∶500)，和β-actin(1∶1 000)脫脂牛奶封閉4 ℃過夜；加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG (1∶20 000)，室溫孵育2 h；TBST(含0.1% Tween-20 的Tris 鹽緩沖液，pH7.4)中洗滌5 min，3次。DAB試劑顯色。采用β-actin為內(nèi)參照，Image J軟件分析蛋白條帶平均光密度，以β-actin平均光密度值進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)校正。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

3只PQ組大鼠分別于灌胃后72 h、5 d、9 d死亡，2只PQ組大鼠于灌胃后36 h出現(xiàn)消化道出血。PQ組大鼠2 h后即出現(xiàn)倦怠，煩躁；12 h出現(xiàn)毛發(fā)成縷、嗜睡，進(jìn)食飲水減少，呼吸急促；24 h開始出現(xiàn)口周、鼠尾及腳趾發(fā)紺、呼吸困難、稀便，體重下降；72 h后體重明顯下降；7 d大鼠明顯活動(dòng)減少，呼吸急促；14 d大鼠基本無活動(dòng)，極度呼吸困難。

2.2 各組大鼠肺組織病理結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

光學(xué)顯微鏡下，對照組(圖1A、圖2A)肺組織無明顯病理學(xué)改變，PQ 2 h組肺組織開始出現(xiàn)肺泡炎癥，少量膠原纖維形成。隨時(shí)間的增加，炎性細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞滲出以及膠原纖維不斷增加，至14 d時(shí)，大量膠原纖維形成，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。與對照組比較，染毒組大鼠肺組織HE染色肺泡炎半定量病理評分、Masson染色肺纖維化半定量病理評分較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1-圖3。

2.3 各組大鼠血紅細(xì)胞ROS

與正常對照組相比，模型組大鼠血紅細(xì)胞ROS的熒光陽性率比值在2 h即出現(xiàn)明顯升高，持續(xù)至中毒7 d后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖4。

2.4 各組大鼠肺組織JC-1檢測結(jié)果

與正常對照組相比，正常組紅綠熒光比為(1.83±0.53)，2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d染毒組大鼠比值紅綠熒光比分別為(1.63±0.56)、(1.40±0.79)、(1.11±0.71)、(0.96±0.80)、(0.78±0.88)、(0.59±0.34)，較正常組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖5-圖6。

2.5 Western blot結(jié)果

與正常對照組相比，PQ組大鼠肺組織中PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同時(shí)間組間肺組織PINK1、Parkin水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖7-圖8。

2.6 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PQ中毒大鼠肺組織JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01;r=-0.573,P<0.01)。在PQ中毒12 h內(nèi)，血紅細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度陽性率與JC-1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712,P<0.01)，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關(guān)(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01；r=0.602,P<0.05)。

3 討論

PQ急性中毒者可迅速出現(xiàn)各臟器功能衰竭，死亡率極高，即使度過急性期，后期也多發(fā)展為肺纖維化引起呼吸衰竭而死亡[10]。本次研究結(jié)果顯示，PQ2 h組肺組織開始出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡上皮水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，紅細(xì)胞漏出，以及膠原纖維形成。隨著時(shí)間的延長，PQ組肺組織的肺泡炎逐漸減輕、纖維化不斷加重，呈肺纖維化改變，與Yang等[11]的研究結(jié)果一致，說明本研究使用20%PQ溶液按50 mL/kg一次性灌胃成功建立了PQ肺纖維化模型。

既往研究表明，當(dāng)PQ進(jìn)入線粒體后，與遞氫體NADH-Q發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而抑制呼吸鏈中的NADH-Q還原酶的活性，導(dǎo)致有氧代謝減弱，無氧代謝增強(qiáng)，同時(shí)產(chǎn)生大量的乳酸和過量的含氧自由基，攻擊線粒體膜，使線粒體內(nèi)膜通透性增加，線粒體功能發(fā)生障礙，以致大量含氧自由基釋放入細(xì)胞質(zhì)，甚至進(jìn)入細(xì)胞核，經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)，細(xì)胞功能受損，甚至出現(xiàn)凋亡/壞死[12-13]。

ROS可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，故本研究使用流式細(xì)胞儀檢測了PQ中毒大鼠血紅細(xì)胞ROS的濃度，發(fā)現(xiàn)ROS濃度在PQ中毒后2 h即出現(xiàn)顯著升高，隨著中毒時(shí)間延長，其濃度持續(xù)升高，直到7 d后逐漸降低，再次證實(shí)PQ中毒導(dǎo)致大鼠體內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激。

目前認(rèn)為，線粒體膜電位降低可以導(dǎo)致線粒體自噬，故檢測線粒體膜電位可以間接反映線粒體自噬的發(fā)生[14]。在線粒體自噬這一特殊過程中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體外膜蛋白PINK1具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。線粒體膜電位崩解是線粒體自噬的早期事件，當(dāng)線粒體膜電位崩解時(shí)，全長型的PINK1將會(huì)穩(wěn)定蓄積在線粒體外膜上，誘導(dǎo)Parkin選擇性轉(zhuǎn)位到受損的線粒體，最終介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生選擇性清除受損的線粒體[15]。故本課題使用Western blot檢測了PINK1及Parkin蛋白的變化，進(jìn)一步觀察百草枯中毒后線粒體自噬的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PQ組大鼠肺組織細(xì)胞JC-1紅綠熒光比隨著時(shí)間的延長，與正常對照組比較明顯降低，而PINK1及Parkin蛋白與正常對照組比較不斷升高，相關(guān)性分析表明，JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin呈負(fù)相關(guān)。我們的研究初步證實(shí)，PQ中毒導(dǎo)致了大鼠肺線粒體自噬的發(fā)生，且JC-1紅綠熒光比與PINK1及Parkin有很好的參照性，共同反映了線粒體自噬的現(xiàn)象。

本研究相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬指標(biāo)與肺泡炎癥及纖維化密切相關(guān)，故線粒體自噬可能參與了PQ導(dǎo)致的肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。我們的結(jié)果還提示，ROS與JC-1呈負(fù)相關(guān)，與PINK1及Parkin、肺纖維化病理評分呈正相關(guān)，進(jìn)一步說明，線粒體自噬可能參與了PQ導(dǎo)致的肺纖維化過程，且此過程可能通過ROS的作用，經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞功能受損實(shí)現(xiàn)的。

綜合以上結(jié)果，我們初步證實(shí)，PQ中毒誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS。同時(shí)，PQ中毒誘發(fā)了肺線粒體自噬，并參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。但線粒體自噬在PQ中毒發(fā)生肺纖維化的過程中發(fā)揮的具體作用及分子細(xì)胞機(jī)制還有待進(jìn)一步研究明確。

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(學(xué)術(shù)編輯：杜飛)

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郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

To evaluate the effects of mitophagy in paraquat-induced rat pulmonary fibrosis model

LIU Kai-xiang,ZHAN Zhi-peng,XIE Xi-sheng

(DepartmentofNephrology,TheSecondClinicalMedicalSchoolofNorthSichuanMedicalCollege,NanchongCentralHospital,Nanchong637001,Sichuan,China)

Objective：To investigate the effect of mitophagy on the occurrence of pulmonary fibrosis in paraquat poisoning by observe the changes of JC-1， PINK1，Parkin and the reactive oxygen species(ROS)in different stages of paraquat-induced rat pulmonary fibrosis model.Methods：42 adult male sprague-dawley (SD) rats were randomly divided into normal group(n=6) and PQ group(n=36).PQ group rats were divided into six time points:2 h,12 h,24 h,72 h,7 d,14 d,each time point includes 6 rats.20% PQ solution with adose of 50 mg/kg were selected for once administration gavage to establish PQ poisoning model,through the detection of red blood cell ROS concentration by flow cytometry,HE staining and Masson staining of lung tissue damage was observed after PQ poisoning,JC-1 staining was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential changes in lung tissue,PINK1,Parkin protein was detected by Western blot.Results:Compared with normal group,the degrees of pulmonary fibrosis was gradually increased with the increase of PQ poisoning time,the difference was significant (P<0.05).In the PQ groups, the positive rate of ROS fluorescence intensity increased significantly at 2h after poisoning,and peaked at 12 h after poisoning, and then decrease gradually(P<0.05),the difference between normal group and 14 d after poisoning has no statistical significance (P>0.05).The ratio of JC-1,red green fluorescence in lung tissue of PQ group was lower than that of control group,and Western and blot indicated that the expression of PINK1 and Parkin protein increased with the duration of poisoning, and the difference was statistically significant (P<0.01).Pearson test shows there is a negative correlation between the red green fluorescence ratio and PINK1,Parkin and the pathology score of pulmonary fibrosis.(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01).In 12 h after PQ poisoning,there is a negative correlation between the ratio of the positive rate of ROS fluorescence intensity in erythrocyte and the red green fluorescence (r=-0.712,P<0.01)，and a positive correlation between the positive rate of ROS fluorescence intensity and PINK1,Parkin and the pathology score of pulmonary fibrosis(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01;r=0.602,P<0.05).Conclusion:The mitophagy and oxidative stress were induced by PQ poisoning. The generation of ROS closely related to the development of autophagy in mitochondria and is involved in the development of pulmonary fibrosis in PQ rats.

Paraquat;Pulmonary fibrosis;Mitophagy; PINK1;Parkin;Oxidative stress

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.003

四川省科技廳基金項(xiàng)目(2011JTD0014)；南充市科技局基金項(xiàng)目(2015-855)

2016-08-26

劉開翔(1990-)，男，碩士研究生。E-mail:254442802@qq.com

謝席勝，E-mail:xishengx@163.com

時(shí)間：2017-6-21 18∶09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.006.html

1005-3697(2017)03-0324-05

R595.4

A