超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定金屬罐內(nèi)壁涂層中三聚氰胺及其類似物遷移檢測技術(shù)研究

張雷雷，夏靜，關(guān)書會，張京, 張巖(.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室,河北 石家莊 05009；.河北冠卓檢測科技有限公司，河北 石家莊 05009)

超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定金屬罐內(nèi)壁涂層中三聚氰胺及其類似物遷移檢測技術(shù)研究

張雷雷1，夏靜1，關(guān)書會1，張京2, 張巖1
(1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室,河北 石家莊 050091；2.河北冠卓檢測科技有限公司，河北 石家莊 050091)

本研究建立了金屬罐體內(nèi)層涂料中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測技術(shù)。通過對不同提取溶液模擬金屬灌裝飲料的生產(chǎn)流程，對其中模擬物進行測試，采用正離子掃描和負離子掃描的方式進行儀器條件研究，確定了三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的監(jiān)測模式和特征離子對，并進行了MRM模式定性定量分析。該方法的檢出限為5.0～25μg/L; 線性范圍0.5～200μg/ L內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。實驗結(jié)果表明，灌裝飲料使用的金屬罐在特定條件下會發(fā)生三聚氰胺的遷移，存在食品安全風(fēng)險，同時未檢出其類似物的存在。

三聚氰胺；三聚氰胺類似物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

引言：

自“三鹿”事件以來，對于奶制品乃至食品中三聚氰胺的分析方法已出現(xiàn)了很多種[1]，但國內(nèi)對于三聚氰胺的分析方法大多集中在對三聚氰胺單一化合物的分析[2-4]。隨著西方發(fā)達國家在對寵物食品產(chǎn)品的檢測結(jié)果表明除三聚氰胺以外[5]，其類似物——三聚氰胺二酰胺、三聚氰胺一酰胺及三聚氰酸的存在也會導(dǎo)致動物及人體受到健康威脅[6]。研究表明除去人為添加因素，目前唯一能直接帶入到食品中的途徑是通過食品包裝材料。發(fā)生這一現(xiàn)象的原因與三聚氰胺在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用有關(guān)[7]。世界各國特別是美國、歐盟、日本等發(fā)達國家的分析與研究結(jié)果表明，與食品接觸的器皿、餐廚具和包裝容器以及包裝材料中有害元素、有害物質(zhì)會遷移至食品中，這一現(xiàn)象已成為人們對食品安全一個新的關(guān)注點[8]。針對這一事實，歐盟早在2002年就在DirectiveECNo2002/72中規(guī)定，三聚氰胺及其類似物在食品接觸材料中的遷移量不超過30mg/kg[9]，我國于2009年9月1日實行的GB9690-2009《食品容器、包裝材料用三聚氰胺-甲醛成型品衛(wèi)生標準》規(guī)定三聚氰胺單體遷移量為0．2mg/dm2(條件為4%乙酸水，60℃，2h)[10]。而我國目前針對食品容器中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺的有關(guān)報道很少，多集中在對三聚氰胺的遷移進行的報道[11-13]。

本研究依據(jù)GB23296.1-2009中規(guī)定的四種食品模擬物進行三聚氰胺及其類似物的遷移試驗[14]。通過試驗比對發(fā)現(xiàn)，如果嚴格按照相關(guān)國家衛(wèi)生標準的試驗條件對包裝容器進行檢測，一般不會發(fā)生三聚氰胺遷移或遷移量很小，但是如果按照食品生產(chǎn)過程中要使用的溫度條件對同樣的包裝材料進行前處理，會發(fā)生三聚氰胺遷移，而且采用不同的提取溶劑其遷移量會有不同程度的變化，這將為食品行業(yè)帶來一定的安全隱患。因此本試驗結(jié)果不僅可以為食品包裝材料生產(chǎn)企業(yè)、食品生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的技術(shù)支持，而且為食品中三聚氰胺及其類似物的非人為添加來源研究提供最新試驗數(shù)據(jù)，為相關(guān)國家標準改進提供試驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀：LC-30AD型，日本島津公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：8030型，日本島津公司；

高速冷凍離心機：RT15T高速冷凍離心機，上海天美公司；

氮吹儀：美國Organomaion Assiciates公司；

超聲波水浴器：德國IKA公司。

甲醇、乙腈、乙酸、乙醇：色譜純；

三聚氰胺標準品：購自瑞士Fluka公司，純度≥99.0%;

三聚氰酸標準品：購自瑞士Fluka公司，純度≥98.0%;

三聚氰酸一酰胺標準品：購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99%;

三聚氰酸二酰胺標準品：購自瑞士Fluka公司，純度≥97.7%。

標準溶液的儲備液：分別稱量10.0mg(精確到0.1mg)的標準品，三聚氰胺(MEL)、三聚氰酸(CYA)、三聚氰酸一酰胺(ADE)和三聚氰酸二酰胺(ANE)用二乙胺+水(20+80)溶液進行溶解，并用乙腈水(50+50)溶液配成濃度均為1000μg/mL的溶液。

混合標準中間溶液：分別移取四種標準儲備液1.0mL于100mL容量瓶中，用提取劑定容，充分搖勻，配制濃度為10.0μg/mL的混合標準液的中間溶液。0℃～4℃冷藏避光保存，有效期1個月。

標準溶液工作曲線：用流動相將三聚氰胺及其類似物標準儲備液稀釋成濃度為10μg/mL的標準使用混合溶液，再逐級稀釋得到三聚氰胺濃度為0.5μg/L，1.0μg/L，5μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺濃度為1.0μg/L，5.0μg/L，10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L；三聚氰酸二酰胺濃度為2μg/L，10μg/L，20μg/L，40μg/L，80μg/L，160μg/L的標準工作液。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品

空白罐體由兩個廠家提供,均為金屬罐體。

1.2.2 食品模擬物的選擇

本實驗中選取了水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄欖油標準品作為食品模擬物。

1.3 實驗條件

1.3.1 浸泡條件

本次試驗中選取水、65%乙醇水、4%乙酸及橄欖油作為食品模擬物，各取四種模擬物250mL于金屬罐中，將金屬罐放于生產(chǎn)流水線中密封并模擬生產(chǎn)過程，其后選取裝有橄欖油的金屬罐置于95℃下浸泡24h，其他三種模擬物的金屬罐置于70℃下浸泡2h。之后取出各種提取液待測。

1.3.2 樣品前處理

將1.3.1中得到的水、65%乙醇水、4%乙酸三種模擬物混勻后用0.22μm的有機濾膜直接過膜進樣品瓶中，待分析；準確稱取橄欖油模擬提取物5.0g，先加入5mL異辛烷，充分混合，后加入5mL10%異丙醇，70℃水浴振蕩40min，離心，分層，取下層，過0.22μm的有機濾膜，裝入樣品瓶中待測。

1.3.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(50mm×2.1mm，1.7μm);流動相:10mmol/L乙酸銨水溶液+乙腈，洗脫條件見表1，為梯度洗脫，流速為0.3mL/min;柱溫:25℃;進樣量:1μL。

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

實驗采取電離方式是電噴霧電離，掃描方式是正離子模式和負離子模式同時掃描：離子噴霧電壓:4kV;霧化氣和干燥氣均為氮氣，霧化氣壓力為0．28MPa;干燥氣流速:15L/min，霧化器流速：3L/min；溫度400℃;碰撞氣為氮氣，壓力為0．2MPa;掃描方式為多反應(yīng)檢測(MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

三聚氰胺及其類似物的相對分子質(zhì)量較小，而且分子結(jié)構(gòu)均含有氨基，具有較強的極性和親水性，因此很難在傳統(tǒng)的C8和C18反相色譜柱有所保留，而對于常用來分離三聚氰胺的強陽離子交換柱利用的是陽離子交換和反相保留的機理，但也僅對三聚氰胺類陽離子化合物有很強的保留，對于三聚氰酸不能保留[16]。親水作用分離色譜是一種能夠針對極性化合物分離的理想的方法，在親水色譜系統(tǒng)中，有機溶劑為弱洗脫溶劑，水溶劑為強洗脫溶劑[17]。該實驗則采用了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱、選取乙酸銨緩沖溶液作為水相，乙腈作為有機相進行分離優(yōu)化，并通過降低乙腈的比例來實現(xiàn)親水色譜柱對于物質(zhì)的保留，而結(jié)果顯示，三聚氰酸因其結(jié)構(gòu)特性會最先出峰，隨著乙腈比例的不斷變化，三聚氰胺和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的分離峰形尖銳。因此得到的梯度洗脫條件可以在1.5分鐘內(nèi)實現(xiàn)四種物質(zhì)的分離。其TIC總離子流圖可見圖1所示。

圖1 三聚氰胺及其類似物的TIC總離子流圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別對三聚氰胺及其類似物在正、負離子模式下進行了母離子全掃描，仔細分析所得到的一級質(zhì)譜圖分析得出，三聚氰胺正離子模式下的離子峰強度比負模式下離子峰強度高出2-3個數(shù)量級，而三聚氰酸則不同，三聚氰酸一酰胺和三聚氰胺二酰胺在正負模式下的分子離子峰的強度相差不大，于是最終選定在正模式下進行試驗。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰胺二酰胺的母離子峰分別為m/z 127.1、m/z 127.85、m/z 129.1、m/z128.1，再分別對母離子進行子離子掃描，選擇豐度最強的碎片離子m/z85.00、m/z41.90、m/z87.00、m/z86.00作為定量離子，其MRM圖2中所示。具體的質(zhì)譜分析多反應(yīng)檢測條件見表2所示：

表2 三聚氰胺及其類似物的MRM監(jiān)測條件

圖2 三聚氰胺及其類似物的MRM質(zhì)譜圖及子離子掃描圖

2.3 線性方程與檢出限

配制三聚氰胺及其衍生物系列濃度的標準工作溶液，并按照前述方法進行處理和測定。以被分析目標物質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別得到MEL，ANE，ADE和CYA的檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和線性方程，詳見表3中。

表3 不同模擬物中三聚氰胺及其衍生物的檢出限及線性方程

2.4 提取溶劑的選擇與實際罐體的測定

國家標準GB9690-2009、GB/T23296.1-2009的遷移實驗列表中，選取了四種模擬物(水、65%乙醇水、4%乙酸水及橄欖油)于70℃浸泡2h的替代試驗條件，而由于三聚氰胺單體的遷移量，尤其在橄欖油中的遷移量較低，使用已有的國家標準方法對食品模擬物中的三聚氰胺單體分析時，測定下限較高，大部分的遷移測定結(jié)果都處于未檢出的狀態(tài)，為了更好的研究金屬罐中三聚氰胺及其類似物的遷移研究，將橄欖油中遷移實驗的浸泡溫度升至95℃并延長浸泡溫度至24h，通過對四種溶劑中三聚氰胺及類似物的含量進行測定，結(jié)果見表3所示，可以得出65%乙醇水在對罐體中對三聚氰胺及其類似物的提取效果最好，可以用來對金屬罐體進行篩選研究。

通過65%乙醇水對金屬罐體中三聚氰胺及其類似物的提取實驗結(jié)果可以看出，金屬罐體的內(nèi)壁三聚氰胺涂層中可以檢出有微量的三聚氰胺，而并未檢出三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺，從而可以推斷出食品用帶三聚氰胺涂層的金屬罐體在生產(chǎn)的過程中不會產(chǎn)生三聚氰胺的類似物。而三聚氰胺的遷移量也因生產(chǎn)廠家不同，含量有所不同。

表4 不同提取溶劑對實際金屬罐中三聚氰胺及其類似物的測定實驗結(jié)果

注：N.D.表示未檢出,當檢驗結(jié)果低于檢出限時均為未檢出。

3 結(jié)論

通過應(yīng)用本方法針對金屬罐內(nèi)層涂料的三聚氰胺及其類似物進行檢測，找到了適合檢測的最佳提取試劑，并發(fā)現(xiàn)確實存在三聚氰胺的遷移，而其它其類似物并未發(fā)現(xiàn)有殘留，這不僅說明了市售飲料灌裝用的金屬罐存在著將三聚氰胺遷移至飲料中的危險，同時也印證了飲料生產(chǎn)過程由于不存在三聚氰胺向類似物轉(zhuǎn)化的條件而并未檢出三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺。因此，可提醒廣大飲料企業(yè)在選擇金屬罐的過程中要關(guān)注涂層中三聚氰胺的含量，并應(yīng)該嚴格控制生產(chǎn)過程中的各個環(huán)節(jié)，防止三聚氰酸等類似物的出現(xiàn)進而危害消費者的健康。

[1] TSAI I L,SUN S W,LIAO H W,et al.Rapid analysis of melamine in infant formula by sweeping micellar electrokinetic chromatography[J].J Chromatogr A, 2009,1216(47):8296-8303.

[2] Wang jinyan, JIANG Lianmei,CHU Qingcui,et al. Residue analysis of melamine in milk products by micellar electrokinetic capillary chromatography with amperometric detection[J].Food Chemistry,2010,121(1):215-219.

[3] Dorne JL, Doerge DR,Vandenbroeck M,et.al.Rencent advances in the risk assessment of melamine and cyanuric acid in animal feed[J].Toxicol Appl Pharmacol,2013,270(3):218-229.

[4] Chik Z,Haron DE,Ahmad ED et al.Analysis of melamine migration from melamine food contact articles.[J].Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2011,28(7):967-973.

[5] HELLER DN, NOCHETTO CB.Simultaneous determination and confirmation of melamine and cyanuric acid in animal feed by witterionic hydrophilic interaction chromatography and tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2008,22(22):3624-3632.

[6] EHLING S,TEFERA S,HO IP.High-performance liquid chromatographic method for the simultanous detection of the adulteration of cereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline,ammelide,and cyanuric acid[J].Food Additives and Contaminants,2007,24(12):1319-1325.

[7] 井偉，陳旻實,李小晶,等.HPLC同時檢測食品接觸材料中三聚氰胺與三聚氰酸單體遷移量[J].分析試驗室，2011, 30(4): 34-38.

[8] 尹中,韋何雯.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定灌裝飲料罐內(nèi)涂層中三聚氰胺的遷移量[J].化學(xué)分析計量,2011,20(4):86-88.

[9] 徐彥輝,陳戈,顧亮，等.金屬罐內(nèi)層涂料三聚氰胺遷移量的測定[J].包裝與食品機械,2011,29(3):66-68.

[10] 《食品容器、包裝材料用三聚氰胺-甲醛成型品衛(wèi)生標準》GB9690-2009.

[11] Wu YN,Zhao YF,Li JG; A survey on occurrence of melamine and its analogues in tainted infant formula in China.[J].Biomed Environ Sci,2009,22(2):95-99.

[12] 王紅松, 陳燁,劉君峰.金屬食品包裝罐中三聚氰胺遷移規(guī)律的研究[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2011,21(8):2085-2086.

[13] 林華,陳長虹,李小晶,等.食品及食品接觸材料中三聚氰胺及其類似物色譜檢測方法研究進展[J]. 食品科學(xué)，2012, 33(23):380-388.

[14] 《食品接觸材料 塑料中受限物質(zhì) 塑料中物質(zhì)向食品及食品模擬物特定遷移試驗和含量測定方法以及食品模擬物暴露條件選擇的指南》GB23296.1-2009.

Determination of melamine and analogues in Food contact materials by liquid chromatography tandom mass spectrometry

ZHANG Lei-lei，XIA Jing，GUAN Shu-hui，ZHANG Jing，ZHANG Yan
(1.HebeiFoodInspectionAndResearchInstitute，HebeiFoodSafetyKeyLaboratory，ShijiazhuangHebei050091,China;2.HebeiGuanzhuoDestingTechnologyCo,LtdShijiazhuangHebei050091,China)

A new method using liquid chromatography Tandom Mass Spectrometry to analyse migration of melamine, cyanuric acid, ammelide cyanuric acid amide in metal tank inner coatings.Through a series of experiments to simulate metal filling beverage production process with different extraction solution, we got a conclusion that it will cause migration of melamine in the food producing, packaging and sterilization.The electrospray ionization source in positive and negative ion mode was used for multiple reaction monitoing mode.These four componnts showed good liner relationships with the correlation coefficients more than 0.995.The limits of detection were all in the range of 5.0～25μg/L.These will bring food safety problem which can not be ignored.The experimental results showed that melamine can be detected but its analogues does not exsit in the tank.

Melamine; Melamine analogues; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2017-05-12

張雷雷(1977-),男，山西長治市人，主要從事食品安全檢測技術(shù)研究.

張 巖，E-mail:zhangyan@nepp.con.cn

1001-9383(2017)02-0052-09

O657.6

A