參麥注射液對線粒體毒素致豚鼠藥物性耳聾模型的影響

王秋榮，朱紅玲，陳德森

(1.十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

參麥注射液對線粒體毒素致豚鼠藥物性耳聾模型的影響

王秋榮1，朱紅玲1，陳德森2

(1.十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

目的觀察參麥注射液對豚鼠藥物性耳聾眼肌前庭誘發(fā)肌源性電位(oVEMP)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響，分析其作用機制。方法將30只健康雄性豚鼠經(jīng)聽泡骨窗向圓窗龕滴入0.5 mol/L的3-硝基丙酸(3-NP)6 μL造成藥物性耳聾，將其中24只成模豚鼠采用隨機數(shù)表法分為模型組和參麥組。另取12只健康雄性豚鼠不做處理作為對照組。參麥組按0.5 m L/kg經(jīng)尾靜脈注射參麥注射液，模型組注射等體積生理鹽水，治療7 d。觀察豚鼠前庭功能受損行為學(xué)改變，采用氣導(dǎo)短純音誘發(fā)豚鼠治療前后oVEMP、記錄其主要參數(shù)N1和P1潛伏期、N1和P1振幅、N1-P1波間期并計算oVEMP引出率，記錄聽性腦干反應(yīng)(ABR)波Ⅲ反應(yīng)閾及在80 dB nHL短聲刺激時Ⅰ～Ⅵ波潛伏期，監(jiān)測豚鼠局部腦血流(rCBF)，采用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測耳蝸VEGF及VEGF-mRNA表達(dá)。結(jié)果治療后，參麥組的N1和P1振幅分別為(10.22±0.74)μV和(11.03±0.82)μV，oVEMP引出率為(92.01± 8.72)%，rCBF為(77.21±8.36)m L/(100 g·m in)，比模型組的(7.03±0.52)μV、(8.95±0.54)μV、(43.32±5.77)%、(57.73± 6.21)m L/(100 g·min)明顯提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；N1和P1潛伏期分別為(10.14±1.97)ms和(9.52± 1.04)ms，ABRⅡ波為(1.37±0.19)ms，Ⅲ波潛伏期為(3.01±0.35)ms，Ⅰ～Ⅲ波間期為(2.02±0.24)ms，比模型組的(13.54±2.98)ms、(12.30±1.81)ms、(3.72±0.26)ms、(4.39±0.33)ms、(3.03±0.22)ms明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ABRⅢ波反應(yīng)閾為(31.47±4.63)dB，比模型組的(50.42±5.41)dB明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；VEGF和VEGF-mRNA分別為(18.42±1.34)GAPDH和(39.01±2.05)、比模型組的(10.71±1.23)GAPDH和(28.04±1.96)明顯高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論參麥注射液可提高耳蝸受損組織血流量，改善受損內(nèi)耳血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞和前庭神經(jīng)功能的再生和修復(fù)，對線粒體毒素誘導(dǎo)藥物性耳聾模型豚鼠有一定的治療作用。

藥物性耳聾；參麥注射液；眼肌前庭誘發(fā)肌源性電位；血管內(nèi)皮生長因子；聽性腦干反應(yīng)

藥物性耳聾是指使用耳毒性藥物所引起的感音神經(jīng)性聾，濫用耳毒性藥物是我國聾兒的主要病因[1]。如氨基糖甙類、非氨基糖甙類抗菌素、水楊酸鹽、利尿劑、抗腫瘤藥物、中藥等均可能導(dǎo)致藥物性耳聾[2]。這類藥物均有可能造成內(nèi)耳微循環(huán)障礙、內(nèi)耳毛細(xì)胞變性壞死并最終導(dǎo)致高頻聽力漸向低頻擴(kuò)展的聽力損失[3-4]。研究表明，腦干可接受雙側(cè)耳蝸傳入的語聲刺激信息，并對其進(jìn)行處理整合，故記錄聽性腦干反應(yīng)(ABR)可客觀地反映刺激聲信息的聽覺信息[5]。而眼肌前庭誘發(fā)肌源性電位(oVEMP)主要評估前庭及橢圓囊上神經(jīng)功能，可客觀地反映患者前庭功能[6]。兩者對診斷及評估聽力損傷程度具有重要意義[7]。在治療藥物性耳聾時，除及時停用耳毒性藥物外，還應(yīng)及時消除其對內(nèi)耳微循環(huán)的影響，促進(jìn)聽力恢復(fù)。中藥制劑參麥注射液具有可靠的擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的功能，臨床上有報道其具有治療耳聾的作用[8-9]。由于其對于藥物性耳聾的影響及其機制鮮有研究，為研究其是否具有治療藥物性耳聾的作用，本實驗建立豚鼠藥物性耳聾模型，經(jīng)尾靜脈注射參麥注射液進(jìn)行治療，系統(tǒng)觀察其對豚鼠藥物性耳聾的影響，為其臨床治療此類疾病提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及藥品聽性腦干反應(yīng)誘發(fā)電位儀(丹麥，MEDSEN-MCU90型)；佳能5D MarkⅢ單反相機(日本)；3-硝基丙酸(3-NP，南京森貝伽生物科技有限公司)；參麥注射液(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：010873)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及VEGF-mRNA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物36只雄性豚鼠，體質(zhì)量190～210 g，實驗動物由十堰市太和醫(yī)院科研動物房提供[SYXK(鄂) 2011-0031]，動物造模和實驗觀察在標(biāo)準(zhǔn)實驗室進(jìn)行[SCXK(鄂)2011-0008]。

1.3 豚鼠SSNH模型制備及分組隨機抓取30只豚鼠，造模前夜禁食不禁水。用2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，豚鼠麻醉后取臥位用小動物定位儀固定，剃去左耳局部鼠毛、皮膚用碘伏消毒后鋪無菌巾，在手術(shù)顯微鏡下切開皮膚，從耳后入路暴露左耳聽泡，小心尋找圓窗龕。找到圓窗龕后先滴入6 μL的3-NP，然后在圓窗龕上放入一小塊浸泡有飽和3-NP的明膠海綿，貼敷30 m in后取出，將術(shù)中翻轉(zhuǎn)的豚鼠肌肉組織覆蓋于聽泡骨窗，然后縫合切口，再次碘伏消毒。本手術(shù)為無菌手術(shù)，不需要注射抗生素[10]。以術(shù)后24 h有中、重度聽力減退，聽力閾值提高達(dá)50%以上，動物出現(xiàn)自發(fā)性眼震和嚴(yán)重步態(tài)障礙(轉(zhuǎn)圈行為、頭部傾斜和桶狀翻滾)等前庭功能受損改變者為造模成功[11]。本實驗豚鼠全部存活，其中有27只出現(xiàn)典型眩暈等前庭功能受損癥狀，造模成功率為90%，挑選其中24只，按隨機原則均分為模型組和參麥組，每組12只。

1.4 治療方法參麥組豚鼠按2 m L/(kg·d)的劑量從尾靜脈注射參麥注射液，用藥劑量是按成人體表面積換算而來。模型組術(shù)后按2 m L/(kg·d)的劑量從尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液作為對照，兩組均連續(xù)給藥治療7 d。

1.5 檢測指標(biāo)和方法

1.5.1 ABR、oVEMP和局部腦血流(rCBF)測試方法術(shù)前、術(shù)后1 d和治療7 d后分別進(jìn)行ABR測試參照文獻(xiàn)[12]：用80 dB nHL短聲刺激，記錄豚鼠Ⅰ～Ⅳ波潛伏期，記錄Ⅲ波反應(yīng)閾。記錄電極置于頭頂皮膚，參考電極置于耳廓，接地電極均置于鼻尖，極間電阻和電阻均≤5 kQ，記錄ABR各波潛伏期及波間期。前庭功能受損行為學(xué)觀察：用佳能5D MarkⅢ單反相機記錄豚鼠眼震現(xiàn)象及行為學(xué)反應(yīng)：嚴(yán)重步態(tài)障礙(轉(zhuǎn)圈行為、頭部傾斜和桶狀翻滾)，表明單側(cè)前庭功能受損，動物出現(xiàn)眩暈癥狀；輕度步態(tài)障礙(僅有頭部傾斜)，動物出現(xiàn)輕度眩暈癥狀。采用氣導(dǎo)短純音誘發(fā)豚鼠治療前后oVEMP、記錄其主要參數(shù)N1和Pl潛伏期、N1和Pl振幅、N1-Pl波間期并計算oVEMP引出率，同時監(jiān)測豚鼠rCBF[13]。

1.5.2 RT-PCR兩組豚鼠在給藥前及給藥后7 d各取6只，在ABR、oVEMP和rCBF測試完后斷頭處死，取豚鼠耳蝸放入預(yù)冷勻漿液中，研磨后5 000 r/m in低溫離心20 m in，提取上清液總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 m in后，按95℃30 s、58℃30 s、72℃30 s擴(kuò)增40個循環(huán)，最后72℃延伸10 m in、50℃2 m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，拍照后采用美國Bio-Rad蛋白凝膠分析軟件Quantity One對電泳條帶進(jìn)行吸光度掃描分析，以內(nèi)參β-actin吸光度值進(jìn)行校正，計算VEGF及VEGF-mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用Dunnet t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 兩組動物前庭功能受損行為學(xué)比較模型組和參麥組動物造模后1 d均記錄到豚鼠有眼震現(xiàn)象，并出現(xiàn)嚴(yán)重步態(tài)障礙(轉(zhuǎn)圈行為、頭部傾斜和桶狀翻滾)等前庭功能受損行為學(xué)改變，表明兩組均有單側(cè)前庭功能受損，動物出現(xiàn)眩暈癥狀，說明用3-NP造模成功可靠。治療后，模型組眼震現(xiàn)象及前庭功能受損無明顯改善，參麥組自發(fā)性眼震現(xiàn)象全部消失，步態(tài)基本恢復(fù)正常，前庭功能受損明顯改善，僅有3只有輕度眩暈癥狀(頭部傾斜)。

2.2 參麥注射液對豚鼠oVEMP引出率及相關(guān)參數(shù)的影響模型組豚鼠N1和Pl振幅、oVEMP引出率明顯降低，N1和Pl潛伏期延長，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。參麥組N1和Pl振幅及oVEMP引出率均明顯提高，N1和Pl潛伏期縮短，與同組治療前和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 參麥注射液對豚鼠Ⅰ～Ⅵ波潛伏期及Ⅲ波間期的影響對照組豚鼠Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期治療前后無明顯改變。模型組豚鼠Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期均延長，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。參麥組Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期均明顯縮短，與同組治療前和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

注：與對照組比較，aP＜0.05；與同組治療前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

2.4參麥注射液對豚鼠rCBF和ABR波Ⅲ反應(yīng)閾的影響對照組豚鼠rCBF和ABR治療前后無明顯改變。模型組rCBF降低、ABRⅢ波反應(yīng)閾顯著增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。參麥組治療后rCBF明顯提高，ABRⅢ波反應(yīng)閾降低，與同組治療前和模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但ABRⅢ波反應(yīng)閾未降到正常值，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

2.5 參麥注射液對豚鼠VEGF及VEGF-mRNA表達(dá)的影響模型組豚鼠VEGF及VEGF-mRNA治療后低表達(dá)，與同組治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。參麥組治療后VEGF及VEGF-mRNA高表達(dá)，與同組治療前和模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

表3 治療前后豚鼠80 dB nHL短聲刺激時Ⅰ～Ⅵ波潛伏期及Ⅰ～Ⅲ波間期比較(ms，n=6)

表3 治療前后豚鼠80 dB nHL短聲刺激時Ⅰ～Ⅵ波潛伏期及Ⅰ～Ⅲ波間期比較(ms，n=6)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與同組治療前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

組別對照組時間治療前治療后t值P值模型組治療前治療后t值P值參麥組治療前治療后t值P值Ⅰ(ms) 1.03±0.12 1.09±0.14 0.325 0.534 1.13±0.17 1.11±0.13 0.257 0.603 1.02±0.10 1.05±0.14 0.317 0.542Ⅱ(ms) 1.04±0.11 1.01±0.09 0.197 0.726 3.25±0.21a3.72±0.26a2.231 0.022 3.19±0.22a1.37±0.19bc1.903 0.018Ⅲ(ms) 2.86±0.15 2.93±0.11 0.417 0.591 4.73±0.25a4.39±0.33a3.024 0.000 4.25±0.37a3.01±0.35bc1.302 0.024Ⅳ(ms) 3.92±0.23 3.89±0.21 0.539 0.395 3.81±0.26 3.93±0.25 0.419 0.575 3.86±0.31 3.89±0.29 0.624 0.340Ⅰ～Ⅲ波間期1.82±0.09 1.86±0.27 0.370 0.522 2.21±0.26a3.03±0.22a2.470 0.015 3.09±0.19a2.02±0.24bc3.215 0.000

注：與對照組比較，aP＜0.05；與同組治療前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

表5 治療前后豚鼠VEGF及VEGF-m RNA表達(dá)比較(，n=6)

表5 治療前后豚鼠VEGF及VEGF-m RNA表達(dá)比較(，n=6)

注：與對照組比較aP＜0.05；與同組治療前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05。

組別對照組時間治療前治療后t值P值模型組治療前治療后t值P值參麥組治療前治療后t值P值VEGF(GAPDH) 16.72±2.26 17.43±2.47 0.503 0.482 9.37±0.81a10.71±1.23a2.703 0.014 9.62±1.01a18.42±1.34bc1.750 0.025 VEGF-mRNA 37.02±4.28 36.56±5.03 0.734 0.114 26.71±1.78a28.04±1.96a1.725 0.020 25.24±1.47a39.01±2.05bc1.021 0.035

3 討論

參麥注射液是紅參和麥冬兩味中藥制成的注射用滅菌注射液，主要有效藥理成分為人參皂甙、麥冬皂甙等，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、清除氧自由基、改善心、腦供血不足等作用[14]。研究表明，3-NP是呼吸鏈琥珀脫氫酶不可逆性抑制劑，可抑制ATP酶活性，造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致前庭功能興奮性降低而出現(xiàn)聽力下降和自發(fā)性眼震及眩暈等癥狀[15]。本實驗經(jīng)聽泡骨窗向圓窗龕滴入3-NP造成藥物性耳聾動物模型，經(jīng)尾靜脈注射參麥注射液進(jìn)行治療，通過誘導(dǎo)oVEMP，ABR潛伏期、反應(yīng)閾，并通過記錄rCBF等指標(biāo)來觀察是否有改善聽力前庭功能受損的作用，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

經(jīng)7 d治療，參麥組前庭功能受損行為學(xué)改變明顯好轉(zhuǎn)，N1和Pl振幅、oVEMP引出率和rCBF明顯提高，N1和Pl潛伏期、ABRⅡ波、Ⅲ波潛伏期和Ⅰ～Ⅲ波間期均明顯縮短，ABRⅢ波反應(yīng)閾明顯降低，VEGF及VEGF-mRNA高表達(dá)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，迷路動脈是內(nèi)耳血供的重要動脈，且其側(cè)支循環(huán)血管比較纖細(xì)，微循環(huán)障礙性疾病均可造成血管水腫、痙攣，耳蝸血流急劇減少，耳蝸螺旋器毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)供血不足可導(dǎo)致基底膜毛細(xì)胞變性、水腫、脫落和功能喪失，聽神經(jīng)萎縮、變性、壞死而最終導(dǎo)致聽力喪失[16]。在本實驗中，一方面，參麥注射液吸收后產(chǎn)生活血化瘀的作用，通過改善微循環(huán)來增加內(nèi)耳血供，并有可能通過促進(jìn)ATP酶活性恢復(fù)，增強鈉鉀ATP酶活力，改善組織能量代謝，促進(jìn)耳蝸螺旋器毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)功能恢復(fù)[17]。VEGF是促血管生長因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、再生功能，并參與動脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)[18]。在本實驗中，參麥組治療后VEGF及VEGF-mRNA治療后高表達(dá)，提示參麥注射液具有促進(jìn)VEGF的分泌、誘導(dǎo)缺血區(qū)的血管再生，促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[19]。在應(yīng)用參麥注射液后，rCBF明顯提高，rCBF增加后缺氧狀態(tài)得以改善后，這對提高耳蝸螺旋器毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)血供、改善缺血缺氧耳蝸組織的能量代謝，改善病灶區(qū)缺血、水腫，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)起到至關(guān)重要的作用[8]。oVEMP和ABR在評價神經(jīng)傳導(dǎo)功能方面具有指導(dǎo)意義，ABR可客觀反映聽力[20]。正常耳oVEMP可引導(dǎo)出來，oVEMP引出率低預(yù)示聽力損失嚴(yán)重且難以恢復(fù)，引導(dǎo)不出則聽力完全喪失[21-22]。參麥組治療后，內(nèi)耳缺氧狀態(tài)改善，螺旋神經(jīng)功能得以恢復(fù)，故參麥組oVEMP電位得以引出，且oVEMP引出率提高，ABRⅢ波反應(yīng)閾降低，聽力提高。

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Effects of Shenmai injection on drug induced deafness in guinea pigs induced by m itochondrial toxin.

WANG Qiu-rong1,ZHU Hong-li1,CHEN De-sen2.1.Department of ENT,Shiyan Taihe Hospital,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.The Clinical Medicine College of Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

Objective To observe the effect of Shenmai injection on guinea pig grow th factor drug deafness ocular vestibular evoked myogenic potentials and vascular endothelial cells,and to analysis its mechanism.Methods A total of 30 healthy male guinea pigs were injected w ith 0.5 mol/L 3-nitropropionic acid(3-NP)6 μL into the round w in-dow niche to cause drug-induced deafness through transbullar bone-w indow,24 of them were random ly divided into the model group and Shenmai group.Another 12 healthy male guinea pigs were selected as the control group.Shenmai group was injected w ith 0.5 m L/kg Shenmai Injection through tail vein,and the model group was injected w ith the same volume of normal saline,for 7 d.The behavioral changes of guinea pig vestibular dysfunction were observed.Ocular vestibular evoked myogenic potentials(oVEMP)in guinea pigs was induced by tone burst,the main parameters of N 1 and Pl,N1 and Pl latency,amplitude,N1-Pl wave duration were recorded,and the oVEMP formation rate was calculated.The waveⅢthreshold value of auditory brainstem response(Auditory brainstem,response,ABR)andⅠ～Ⅵlatency of 80 dB nHL of short sound stimulation were recorded.Regional cerebral blood flow in guinea pigs(rCBF)was monitored,the reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect the expression of VEGF in cochlea and VEGF-mRNA.Results After the treatment,N1 and Pl amplitude,oVEMP formation rate,rCBF wave of the Shenmai group were respectively(10.22±0.74)μV,(11.03±0.82)μV,(92.01±8.72)%,(77.21±8.36)m L/(100 g·min),which were significantly higher than corresponding(7.03±0.52)μV,(8.95±0.54)μV,(43.32±5.77)%,(57.73±6.21)m L/(100 g·m in) of the model group(P＜0.05).The N1 and Pl latency,ABRⅡwave,Ⅲwave latency,Ⅰ～Ⅲwave interval of the Shenmai group were respectively(10.14±1.97)ms,(9.52±1.04)ms,(1.37±0.19)ms,(3.01±0.35)ms,(2.02±0.24)ms,which were significantly shorter than corresponding(13.54±2.98)ms,(12.30±1.81)ms,(3.72±0.26)ms,(4.39±0.33)ms,(3.03± 0.22)ms of the model group(P＜0.05).ABR waveⅢthreshold of the Shenmai group was(31.47±4.63)dB,which was significantly lower than(50.42±5.41)dB of the model group(P＜0.05).VEGF and VEGF-mRNA in the Shenmai group were respectively(18.42±1.34)GAPDH and(39.01±2.05),which were significantly higher than(10.71±1.23)GAPDH and(28.04±1.96)in the model group(P＜0.05).Conclusion Shenmai injection can improve the blood flow of the cochlea damaged tissue and the vascular endothelial function of the damaged inner ear,and promote the regeneration and repair of the hair cells in the cochlea and vestibular nerve function,which has certain therapeutic effect on the mitochondrial toxin-induced deafness model guinea pig.

Drug deafness;Shenmai injection;Ocular vestibular evoked myogenic potentials(oVEMP);Vascular endothelial grow th factor(VEGF);Auditory brainstem response

R-332

A

1003—6350（2017）13—2071—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.13.002

2017-01-05)

湖北省教育廳基金（編號：B20122423）

陳德森。E-mail：wangxinlingjob@126.com