腐植酸紫外—熒光特性及生物農(nóng)藥制備的研究

腐植酸紫外—熒光特性及生物農(nóng)藥制備的研究

方冬冬 王 杰 周霞萍*

(華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院 上海 200237)

泥炭和褐煤是腐植酸的主要來(lái)源。通過(guò)紫外-熒光光譜分析等可差異性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸。腐植酸具有多種生物活性組分，利用工程化的分枝桿菌可定向降解得到某些甾類(lèi)化合物，利用特異性酵母菌的異源合成可得到萜類(lèi)和腐植酸萜類(lèi)組分，通過(guò)濃縮、分離、純化等處理工藝，可以制備具有抗菌，改善植物營(yíng)養(yǎng)條件的生物農(nóng)藥。

腐植酸 紫外-熒光分析 生物農(nóng)藥

定向降解是一種在催化劑(酶)反應(yīng)的條件下，利用鍵能的強(qiáng)弱，將原物質(zhì)中存在的結(jié)構(gòu)單元或明確的化合物質(zhì)選擇性的反應(yīng)解析或解離出來(lái)。運(yùn)用分枝桿菌等代謝工程微生物的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將泥炭、褐煤中的黑腐酸降解轉(zhuǎn)化為棕腐酸組分，同時(shí)探索各種甾類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)單一的甾類(lèi)藥物或藥物中間體，可便于甾類(lèi)物質(zhì)的高效提取，同時(shí)實(shí)現(xiàn)甾類(lèi)物質(zhì)的高值化利用，是很有意義的。

異源合成通過(guò)構(gòu)建目的產(chǎn)物的重組微生物工程菌，利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)珍稀萜類(lèi)等，而且效果呈幾何級(jí)倍增。腐植酸原產(chǎn)植物的珍稀萜產(chǎn)量極低，直接提取效率低、成本也高。而通過(guò)微生物的代謝工程技術(shù)，以及微生物對(duì)萜類(lèi)物質(zhì)的高效特異性富集和轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)腐植酸中珍稀萜類(lèi)化合物的高效提取和高值化利用，是一個(gè)極富挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域。萜類(lèi)化合物作為生物農(nóng)藥的組成部分，具有抑制有害菌群生長(zhǎng)、改善自然界碳循環(huán)等作用。

裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被應(yīng)用于研究腐植酸大分子的結(jié)構(gòu)組成特征。但是，直接用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究腐植酸的組成特征還是比較少的[1]。本文通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、紅外、紫外-可見(jiàn)、分子熒光光譜等表征腐植酸降解產(chǎn)物中某些甾類(lèi)成分和性質(zhì)，以及表征酵母菌異源合成的某些腐植酸萜類(lèi)。并在此基礎(chǔ)上[2]，進(jìn)行腐植酸生物農(nóng)藥的制備研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

泥炭：取自云南中電新能源有限公司；

褐煤：取自云南德坤生物科技有限公司(泥炭、褐煤工業(yè)分析和元素分析如表1所示)；

金銀花秸稈：取自上海崇明前進(jìn)農(nóng)場(chǎng)，作風(fēng)干處理；

果皮、果渣：為市售巨峰葡萄的殘余物；

乙醇、乙酸乙酯、葡萄糖等試劑，均采用華東理工大學(xué)采購(gòu)的分析純藥品；

分枝桿菌(Mycobacterium)：華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所提供的工程菌株；

酵母菌(Saccharomyces)：上海立波啤酒廠提供菌種后，由華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所改性。

表1 原料分析Tab.1 Analysis of raw materials

1.2 腐植酸的化學(xué)表征

根據(jù)在不同溶劑中的溶解度，將腐植酸分為黃腐酸、棕腐酸和黑腐酸。實(shí)驗(yàn)采用不同溶劑對(duì)泥炭、褐煤進(jìn)行溶解，超聲波振蕩，過(guò)濾，精制。所得樣品通過(guò)Varian Cary 60型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，確定激發(fā)波長(zhǎng)，再用分子熒光光譜儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，掃描速度為1000 nm/min，掃描光譜儀器自動(dòng)進(jìn)行校正。

1.3 由腐植酸得到的甾類(lèi)、萜類(lèi)的分析

1.3.1 甾類(lèi)的分析

實(shí)驗(yàn)選用工程化分枝桿菌(Mycobacterium)，菌株培養(yǎng)至OD600為2～3，甘油濃度50%，于-40 ℃凍存。通過(guò)種子培養(yǎng)基活化，接種活化后的分枝桿菌于30 mL培養(yǎng)基中，加入滅菌后的黑腐酸，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)7天。降解完全后，取500 μL降解產(chǎn)物于潔凈離心管中，加入250 μL乙酸乙酯，充分振蕩，離心9000 rpm，3 min，萃取液通過(guò)Agilent 6890-5973N，HP-5MS色譜柱( 30 m×250 μm×0.25 μm)，氣化溫度280 ℃，載氣流速 0.7 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，質(zhì)譜電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍(m/z)33～500。

1.3.2 萜類(lèi)的分析

酵母菌(Saccharomyces)作為真菌，具有成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，其甲羥戊酸途徑為異源萜類(lèi)化合物的合成提供了前體。通過(guò)甲羥戊酸途徑，酵母菌可以高效合成萜類(lèi)化合物[3，4]。利用秸稈和果皮作為泥炭、褐煤的輔助發(fā)酵原料，通過(guò)育菌和馴化等改性生物工程，在特定條件下實(shí)現(xiàn)酵母菌異源合成萜類(lèi)，確定腐植酸萜類(lèi)的主要成分，并比較其對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐植酸的熒光性質(zhì)表征

腐植酸分子中含有大量的苯環(huán)、稠苯環(huán)和雜環(huán)，環(huán)之間以橋鍵連接，環(huán)及支鏈上有羧基、酚羥基、醌基、甲氧基等各種官能團(tuán)，具有較特殊的熒光性質(zhì)。

圖1是先根據(jù)紫外-可見(jiàn)吸收光譜確定了泥炭黑腐酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)是273 nm，褐煤黑腐酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)是274 nm，而后進(jìn)行熒光光譜分析。從圖1可以看出，泥炭黑腐酸熒光光譜峰有較好的對(duì)稱性。隨著濃度的增加，黑腐酸的熒光強(qiáng)度增加，溶液中的熒光基團(tuán)含量也增多，濃度達(dá)到一定程度時(shí)，黑腐酸分子聚集，導(dǎo)致熒光自猝滅[5]。激發(fā)波長(zhǎng)也會(huì)隨濃度的增大而增大，出現(xiàn)輕微的紅移[6]。

圖1 不同濃度泥炭黑腐酸的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of different concentrations of humic acids from peat

實(shí)驗(yàn)選用0.01%泥炭或褐煤與溶劑混合。除了濃度的影響外，溫度和pH值對(duì)黑腐酸的熒光強(qiáng)度也有一定的影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞概率增加，使無(wú)輻射躍遷增加，黑腐酸的熒光強(qiáng)度降低[7]。而在不同pH顯示的酸性溶液中，因分子和離子間的平衡改變，使熒光強(qiáng)度也有差異。

圖2中黑腐酸的熒光發(fā)射光譜峰值出現(xiàn)在450～480 nm之間，這是由于黑腐酸具有多種熒光發(fā)色基團(tuán)[8]。圖中545 nm處為瑞利散射的倍頻峰。

從圖2可以看出，泥炭和褐煤棕腐酸在360 nm左右有熒光峰，而黃腐酸沒(méi)有。棕腐酸其余的熒光峰與黃腐酸相似，可能是因?yàn)辄S腐酸也一部分溶于醇，致使棕腐酸精制樣品中含有一部分黃腐酸。從圖2還可以看出，泥炭和褐煤的黃腐酸熒光光譜也有極高的相似性。黃腐酸的發(fā)光譜峰相對(duì)棕腐酸稍有紅移，這是由于極性分子電子云對(duì)熒光分子的影響，π→π*躍遷需要的能量差ΔE減小，躍遷概率增加，使熒光光譜發(fā)生紅移，甚至猝滅。

圖2 泥炭、褐煤棕腐酸和黃腐酸的熒光圖Fig.2 Fluorescence spectra of humic acids, hymatomelanic acids and fulvic acids

2.2 腐植酸甾類(lèi)農(nóng)藥的分析及制備

泥炭腐植酸具有多種生物活性成分，通過(guò)工程化分枝桿菌的定向降解，得到的結(jié)果如圖3所示。

圖3 分枝桿菌降解前后的泥炭腐植酸GC/MS分析Fig.3 GC/MS analysis of samples before and after the microbial degradation

圖3顯示的是泥炭腐植酸降解前后的色譜總離子流圖。在降解產(chǎn)物中共檢測(cè)出20多種物質(zhì)，包括烷烴、有機(jī)酸、酮、醇、酯、萜類(lèi)和甾類(lèi)化合物。根據(jù)峰面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)百分含量。相比腐植酸降解前，定向降解后的萃取液中檢出多種新物質(zhì)，其出峰時(shí)間在25 min左右，分子量在239～446，這些小分子物質(zhì)是腐植酸的大分子物質(zhì)經(jīng)分枝桿菌降解生成的。

烷基取代苯酚是腐植酸中常見(jiàn)的化合物，一般認(rèn)為苯酚類(lèi)物質(zhì)可能來(lái)源于蛋白質(zhì)、聚羧酸、碳水化合物或木質(zhì)素等。降解前，出峰時(shí)間為15.62 min的物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚，相對(duì)含量為1.15%，降解后，其相對(duì)含量為2.46%，可解釋為腐植酸在分枝桿菌定向降解過(guò)程中，部分黑腐酸組分降解為棕腐酸級(jí)分，包括2，4-二叔丁基苯酚成分。張新慧等考察2，4-二叔丁基苯酚對(duì)植物根際微生物生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的2，4-二叔丁基苯酚能促進(jìn)土壤微生物數(shù)量的顯著增加[9]。

降解產(chǎn)物中檢出一些含氮物質(zhì)，可表明氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)參與了泥炭腐植酸的形成。這些含氮物質(zhì)可以為植物提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在出峰時(shí)間21.66 min處，檢出有淚杉醇，相對(duì)含量為2.27%，這是一種雙環(huán)二萜類(lèi)化合物，可干擾細(xì)菌代謝，達(dá)到抗菌效果。同時(shí)檢出類(lèi)似豆甾醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，出峰時(shí)間為24.49 min，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，豆甾醇可以作為農(nóng)業(yè)除草劑和殺蟲(chóng)劑的原料，抑制黃瓜炭疽病、小麥赤霉病、玉米大斑病孢子萌發(fā)，同時(shí)還能較好地抑制番茄灰霉病菌絲的生長(zhǎng)[10]。

麥角甾類(lèi)也從降解產(chǎn)物中檢出，作為農(nóng)藥，其抑制劑活性高、不易產(chǎn)生抗藥性。烯唑醇和咪鮮胺等麥角甾醇脫甲基抑制劑對(duì)葡萄膠孢炭疽菌具有敏感性，供試菌株對(duì)咪鮮胺的EC50值在0.01～1.58 mg/L之間，高于其對(duì)烯唑醇(EC50 0.05～25.45 mg/L)的敏感性。田間試驗(yàn)表明科學(xué)合理地應(yīng)用麥角甾醇脫甲基抑制劑防治葡萄炭疽病，可延緩或避免菌株抗藥性的產(chǎn)生，減小對(duì)潛在抗性菌株的選擇性壓力[11]。

分枝桿菌定向降解泥炭腐植酸得到的甾類(lèi)，經(jīng)濃縮、分離、純化等過(guò)程可以得到甾類(lèi)原藥。向甾類(lèi)原藥中加入惰性填料和一定量的分散劑，按比例經(jīng)充分混合粉碎后，達(dá)到一定粉粒細(xì)度。這些粉狀農(nóng)藥可以直接施于植物根部，被根系吸收，也可加水濕潤(rùn)、分散，噴灑施用。粉狀甾類(lèi)農(nóng)藥具有儲(chǔ)運(yùn)方便、安全的特點(diǎn)，包裝材料容易處理，對(duì)植物也較安全。

2.3 腐植酸萜類(lèi)農(nóng)藥的分析及制備

利用改性后的酵母菌對(duì)褐煤的異源合成，在添加秸稈、果皮等輔料的條件下進(jìn)行。試驗(yàn)得到的萜類(lèi)化合物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4)可通過(guò)核磁共振波譜法(NMR)、高級(jí)液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)和紅外光譜(IR)確認(rèn)(圖5)。

圖4 腐植酸萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure diagrams of terpenoids in humic acids

圖5 利用IR標(biāo)譜檢索到的腐植酸中的萜類(lèi)及C-27甾類(lèi)物Fig.5 Terpenoids and C-27 steroid of humic acid retrieved using IR

萜類(lèi)、腐植酸萜類(lèi)組分對(duì)膠孢炭疽菌的初步抑制試驗(yàn)，是在溫度30 ℃，抑制時(shí)間8 h，以活菌對(duì)照106cfu/mL的條件下得到的。不同濃度萜類(lèi)對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率見(jiàn)表2。可以看出，隨著萜類(lèi)濃度的升高，其對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率先升高后下降，其中以0.005 μg/mL的萜類(lèi)對(duì)膠孢炭疽菌的抑制效果最好，抑制率為95.7%。

表2 不同濃度萜類(lèi)對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率Tab.2 Inhibition rates of different concentrations of terpenoids in humic acids upon colletotrichum gloeosporioides

萜類(lèi)、腐植酸萜類(lèi)組分的親脂性強(qiáng)，可透過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，干擾病原微生物的正常生理代謝，對(duì)病原微生物起到防御作用。研究表明，腐植酸含氧單萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)稗草有抑制作用。不同萜類(lèi)物質(zhì)處在不同濃度時(shí)，“抑草”的效果存在差異性。幾種萜類(lèi)物質(zhì)組合后對(duì)稗草的最高抑制率為93.96%[12]。

酵母菌異源合成得到的萜類(lèi)、腐植酸萜類(lèi)組分，經(jīng)濃縮、分離、純化等可得到萜類(lèi)原藥[13]。向原藥中加入非離子表面活性劑，如吐溫、脂肪胺、甘油脂肪酸酯類(lèi)，以水為介質(zhì)，超微粉碎制成粘稠狀可流動(dòng)的懸浮液，噴灑于作物表面，可吸附于微粒表面形成不同的分散體系，改善植物葉片上生物農(nóng)藥的分布和滲透，提高利用率。

3 結(jié)論

(1) 紫外-熒光光譜分析等可差異性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸。

(2) 分枝桿菌(Mycobacterium)定向降解泥炭腐植酸得到了20多種組分，其中的甾類(lèi)化合物包括豆甾醇衍生物以及麥角甾醇等。

(3) 通過(guò)改性酵母菌(Saccharomyces)的異源合成實(shí)驗(yàn)，得到的萜類(lèi)和褐煤腐植酸萜類(lèi)組分，對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率可達(dá)95.70%。

(4) 初步研究了分支桿菌和改性酵母菌降解腐植酸生成甾類(lèi)原藥和萜類(lèi)原藥，為腐植酸制備生物農(nóng)藥和腐植酸在農(nóng)藥上的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)理論基礎(chǔ)。

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UV-f l uorescence Characteristics and Biological Pesticide Research on Humic Acid

Fang Dongdong, Wang Jie, Zhou Xiaping*
(College of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science andTechnology, Shanghai,200237)

Humic acids are mainly derived from peat and lignite. The difference of surface characteristics of black humic acid, brown humic acid and fulvic acid in peat and lignite was analysed by the UV-f l uorescence spectrum. Humic acids have many biological active ingredients. Steroid compounds could be obtained by engineered mycobacteria directional degradation, and humic acid terpenoids could be obtained through heterologous biosynthesis by specif i c saccharomycetes. The fermented products were antimicrobial, and can improve the conditions of plant nutrition. Through the enrichment, separation and purif i cation processes, they could be used as biological pesticide.

humic acids; UV-f l uorescence analysis; biological pesticide

TQ314.1，F(xiàn)767.2

1671-9212(2017)03-0044-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.005

2015-10-23

方冬冬，女，1992年生，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楦菜嵛锢砘瘜W(xué)性質(zhì)及生物農(nóng)藥的制備。*通訊作者：周霞萍，女，教授，E-mail：ecust_zxp@163.com。