大麥皮殼率快速測(cè)定方法研究

龔強(qiáng)，王國(guó)榮

李博，徐延浩 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長(zhǎng)江大學(xué))，湖北 荊州 434025；

長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025

大麥皮殼率快速測(cè)定方法研究

龔強(qiáng)，王國(guó)榮

李博，徐延浩 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長(zhǎng)江大學(xué))，湖北 荊州 434025；

長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025

大麥皮殼率測(cè)定主要有氨水浸泡法和千粒重量法，但均不適合進(jìn)行快速、高通量樣品分析。纖維素是大麥皮殼的主要化學(xué)成分。采用新型纖維素溶解體系，探討了快速、穩(wěn)定和高通量測(cè)定大麥皮殼率的方法。結(jié)果表明，NaOH溶液、NaClO溶液、NaOH/尿素體系都能用于測(cè)定大麥皮殼率，但堿性次氯酸鈉法效率更高。通過比較NaOH濃度、NaClO濃度以及處理時(shí)間對(duì)大麥皮殼率測(cè)定的影響，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，經(jīng)過2min的短沸是一個(gè)比較快速穩(wěn)定的方案。比較堿性次氯酸鈉法與氨水浸泡法、千粒重量法、NaOH/尿素法的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)堿性次氯酸鈉法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、效率高，最適合作為快速、穩(wěn)定、大批量測(cè)定大麥皮殼率的方法。

大麥；皮殼率；堿性次氯酸鈉法；纖維素溶解體系

大麥皮殼率是指皮大麥籽粒的皮殼重占籽?？傊亓康谋壤４篼湹钠ぢ首兓艽?，占粒重的10%～20%左右。釀造啤酒用大麥要求皮重不高于8%～9%[1]。皮殼率高，不僅降低粒重影響產(chǎn)量，在麥?zhǔn)爝^程中遇陰雨易感染赤霉病,而且降低籽粒品質(zhì)與發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率[2]。皮殼中含有硅酸、花色苷、單寧和苦味物質(zhì),部分可溶性物質(zhì)在糖化時(shí)溶解在麥芽汁中,氧化而成褐色,損害啤酒的色澤和風(fēng)味，厚殼大麥制造的啤酒色澤深,風(fēng)味不純,并且容易混濁[3]。前人對(duì)大麥皮殼的遺傳及其與其他農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性已有較多研究[1,4～7]，但關(guān)于皮殼率的分子遺傳機(jī)制還未見報(bào)道。

大麥皮殼率測(cè)定方法主要有氨水浸泡法(簡(jiǎn)稱SAA法)和千粒重量法。SAA法不傷種子內(nèi)核，用種量少，但需要手工剝殼，費(fèi)時(shí)、費(fèi)工且難以完全去除種皮；千粒重量法使用的50%硫酸溶液消解種殼，去殼完全，但腐蝕性強(qiáng)，易導(dǎo)致皮殼率偏高，降低測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。這2種方法對(duì)大群體的皮殼率進(jìn)行分析不適用，限制了皮殼率遺傳QTL定位等工作的開展，需要開發(fā)一種快速、穩(wěn)定且能大批量測(cè)定大麥皮殼率的方法。

大麥皮殼的化學(xué)組成主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，還有少量的無(wú)機(jī)鹽和花色苷、單寧等多酚物質(zhì)[8]。由此可知，大麥皮殼率測(cè)定主要涉及種皮和果皮中纖維素分子的溶解問題。近年來，新型的纖維素溶解體系不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的磷酸溶解法得到改進(jìn)，并發(fā)展出低溫NaOH(LiOH)/尿素體系[9]。應(yīng)用新型的纖維素溶解體系去探索建立大麥皮殼率測(cè)定的方法是一個(gè)值得嘗試的領(lǐng)域。

隨著大麥分子遺傳育種水平的提高，通過千粒重來負(fù)向篩選低皮殼率的方法已不能滿足現(xiàn)代大麥育種的需求，迫切需要建立快速、穩(wěn)定和高通量的皮殼率測(cè)定方法，對(duì)皮殼率的分子遺傳機(jī)制進(jìn)行解析，開發(fā)皮殼率相關(guān)的分子輔助選擇育種標(biāo)記。本研究探討了堿性次氯酸鈉和NaOH尿素體系測(cè)定大麥皮殼率的方法，綜合比較氨水浸泡法、千粒重量法、堿性次氯酸鈉法和NaOH尿素法測(cè)定皮殼率的準(zhǔn)確度和精確度，提出了一種快速、穩(wěn)定和高通量的皮殼率測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大麥鄂啤2號(hào)，2015年5月收獲后晾曬、除雜后置實(shí)驗(yàn)室保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別采用氨水浸泡法、千粒重法、堿性次氯酸鈉法、NaOH尿素溶解法對(duì)大麥皮殼率進(jìn)行測(cè)定，比較不同方法對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響。對(duì)氨水浸泡法，比較不同濃度氨水和不同處理時(shí)間下皮殼率測(cè)定結(jié)果的差異；對(duì)堿性次氯酸鈉法，比較不同處理時(shí)間、不同NaClO濃度、不同NaOH用量下皮殼率測(cè)定結(jié)果的差異，探索最優(yōu)的皮殼率測(cè)定方案。

1)氨水浸泡法。參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法，取100粒種子置于80℃水浴條件下浸泡，設(shè)置3個(gè)時(shí)間梯度(40、60、80min)和4個(gè)氨水濃度梯度(5%、8%、12%、15%)，比較手工去殼的難易程度及皮殼率的差異。

2)千粒重法。按標(biāo)準(zhǔn)程序[8]，取15g左右麥粒于室溫下在50%硫酸溶液中浸漬5h，并攪動(dòng)，最后用水充分洗滌直至所有麥皮脫離，通過去皮前后的大麥千粒重量計(jì)算出皮殼率。

3)堿性次氯酸鈉法。將15g左右大麥種子置于NaOH和NaClO混合液中，慢慢加熱沸騰，攪拌直至皮殼完全去除，置于水中充分清洗，從而去殼。設(shè)置時(shí)間(2～6min)、NaClO濃度(10%、20%、30%、40%)、NaOH(2、3、4g)3個(gè)因素的梯度試驗(yàn)，探索最優(yōu)的堿性次氯酸鈉處理方案。

4)NaOH/尿素溶解法。參照呂昂等[10]溶解天然纖維素的方法并略作修改。將15g左右種子置于7%氫氧化鈉和12%尿素水溶液中，在-10℃左右震蕩處理5h，再用50℃左右溫水充分沖洗，測(cè)定其皮殼率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨水法測(cè)定條件對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加處理時(shí)間，基本不影響皮殼率測(cè)定結(jié)果；氨水濃度增加對(duì)皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響也不大(表1)。方差分析結(jié)果(表2)表明不同處理時(shí)間和氨水濃度對(duì)皮殼率的影響均未達(dá)到顯著水平(α=0.05)。氨水浸泡使大麥種殼松動(dòng)，但還必須加以手工去殼才能測(cè)定皮殼率，這是氨水法效率不高的關(guān)鍵點(diǎn)所在。盡管氨水濃度對(duì)皮殼率測(cè)定沒有影響，但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，15%的氨水處理與5%的氨水處理相比，皮殼松動(dòng)效果顯著提高，極大提高了手工去殼的速度，從而提高了氨水法的效率。

表1 不同氨水濃度和時(shí)間處理下測(cè)定的大麥皮殼率%

表2 不同氨水濃度和時(shí)間處理下大麥皮殼率的方差分析

注：顯著水平α=0.05；NS表示無(wú)顯著性差異。

2.2 堿性次氯酸鈉法測(cè)定條件對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響2.2.1 NaOH、NaClO及其混合液對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響

NaOH和NaClO溶液加熱沸騰處理都能去掉大麥的皮殼，NaOH溶液會(huì)使皮殼脫落，而NaClO溶液會(huì)使皮殼分解為絮狀物，逐漸溶解。20%NaClO和2%NaOH的時(shí)間(1～6min)梯度試驗(yàn)表明，樣品皮殼率的測(cè)定結(jié)果隨著處理時(shí)間的增加而增加，1～4min皮殼率增加較快，之后皮殼率的增加較慢，但總的皮殼率水平高于氨水法(圖1)。20%NaClO處理，皮殼只是部分溶解，皮殼比較厚的腹溝處去殼效果較差(圖1a)；2%NaOH處理測(cè)定的皮殼率較20%NaClO高，去殼效果較好，但腹溝處仍有部分殘留(圖1b)。

圖1 NaClO、NaOH及其組合沸騰4min溶解大麥皮殼的去殼效果

次氯酸鈉在堿性條件下穩(wěn)定性最好,能充分發(fā)揮其對(duì)蛋白質(zhì)纖維的氧化降解作用[11]。因此，設(shè)計(jì)2%NaOH和20%、30%、40%NaClO配合測(cè)定的時(shí)間(1～6min)梯度試驗(yàn)。結(jié)果表明，NaOH和NaClO配合使用，提高了對(duì)大麥皮殼溶解的速度，樣品的皮殼率在3～4min內(nèi)趨于恒定，隨后迅速上升，且高于正常的皮殼率水平(圖2)。堿性次氯酸鈉溶液去殼效果要優(yōu)于單獨(dú)使用NaOH或NaClO(圖1c)。

圖2 20%NaClO、2%NaOH和不同濃度NaClO配合2%NaOH處理測(cè)定的皮殼率

2.2.2 堿性次氯酸鈉法測(cè)定大麥皮殼率的條件優(yōu)化

圖3 NaClO、NaOH和沸騰時(shí)間3因素組合處理對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響

從圖2可以看出，隨著濃度的提高和時(shí)間的延長(zhǎng)，皮殼率總體呈現(xiàn)先升高，后趨于穩(wěn)定，最后又略微升高的趨勢(shì)。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)大麥的去殼效果也越來越好，但高濃度和長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)導(dǎo)致大麥胚嚴(yán)重受損、脫落，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了進(jìn)一步探討NaOH濃度、NaClO濃度和處理時(shí)間對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響，從中選擇去殼效果好且經(jīng)濟(jì)高效的處理，設(shè)置了NaOH濃度(2%、3%、4%)、NaClO濃度(10%、20%、30%、40%)和沸騰時(shí)間(2、3、4、5、6min)3變量的60個(gè)組合進(jìn)行處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過直方圖統(tǒng)計(jì)(圖3)。結(jié)果表明，不同的組合處理下，鄂啤2號(hào)的皮殼率分布在9.87%～16.75%的范圍內(nèi)，皮殼率主要集中在11.38%～14.39%的范圍內(nèi)，概率為80%。值得注意的是，皮殼率低于11.38%的樣本存在部分皮殼殘留，皮殼率高于14.39%的樣品存在明顯的籽粒糊粉層甚至是胚的受損。統(tǒng)計(jì)分析表明，10%～30%次氯酸鈉顯著影響皮殼率測(cè)定結(jié)果，而40%次氯酸溶液對(duì)皮殼率測(cè)定結(jié)果沒有顯著影響；NaOH濃度的變化對(duì)皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響達(dá)到極顯著差異；2min處理對(duì)皮殼率測(cè)定結(jié)果沒有顯著影響，其他時(shí)間處理則對(duì)皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響達(dá)到極顯著水平。

從上述試驗(yàn)組合中選擇了20%NaClO+4%NaOH沸騰處理2min等6個(gè)去殼效果較好的皮殼率測(cè)定方案進(jìn)行分析(表3)。結(jié)果表明，處理5和處理6與處理1和處理2的皮殼率相比較高，達(dá)到顯著水平，但6種處理的去殼效果差別不大，都能輕松完全地去除皮殼。綜合處理時(shí)間和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，經(jīng)過2min的短沸，可以作為堿性次氯酸鈉法快速測(cè)定大麥皮殼率的一個(gè)通用方案。

表3 6種不同實(shí)驗(yàn)處理測(cè)定的皮殼率

注：min即沸騰處理時(shí)間。

2.3 NaOH尿素處理對(duì)大麥皮殼率測(cè)定結(jié)果的影響

使用NaOH尿素低溫體系處理后，大麥的皮殼并不能完全自行脫落，必須使用50℃左右溫水充分沖洗，皮殼才能輕松脫落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NaOH/尿素體系測(cè)定的皮殼率為(14.90±0.55)%。與氨水法和堿性次氯酸鈉法相比，NaOH/尿素法得到的皮殼率偏高，觀察發(fā)現(xiàn)處理后大麥的胚會(huì)受到損傷且部分溶解，這可能是測(cè)定的皮殼率較高的原因?？s短處理的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)其脫殼效果較差，皮殼不能完全從籽粒上脫離。

2.4 氨水浸泡法、千粒重法、NaOH/尿素溶解法、堿性次氯酸鈉法處理測(cè)定皮殼率的差異

分別用千粒重法、氨水法、堿性次氯酸鈉法和NaOH/尿素溶解法對(duì)大麥皮殼率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，這4種方法測(cè)定的皮殼率大小表現(xiàn)為：NaOH/尿素溶解法>千粒重法>堿性次氯酸鈉法>氨水浸泡法，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值最大的為氨水浸泡法，最小的為千粒重法，其次為堿性次氯酸鈉法。綜合比較來看，次氯酸鈉法最適合作為一種快速、穩(wěn)定、能大批量測(cè)定大麥皮殼率的方法。

表4 千粒重法、氨水法、NaOH/尿素溶解法和堿性次氯酸鈉皮殼率結(jié)果結(jié)果比較

3 討論

千粒重法測(cè)定的皮殼率偏高，這可能是因?yàn)?0%的硫酸溶液腐蝕性強(qiáng)，能同時(shí)溶解纖維素和木質(zhì)素，長(zhǎng)時(shí)間的處理在去除皮殼的同時(shí)會(huì)損失糊粉層和部分大麥仁。NaOH/尿素溶解法在去殼的同時(shí)對(duì)胚有損傷，這可能是測(cè)定的皮殼率偏高的原因。其次，NaOH/尿素溶解法需要在低溫長(zhǎng)時(shí)間處理，對(duì)設(shè)備要求高，耗時(shí)長(zhǎng)，不適合大批量皮殼率的測(cè)定。堿性次氯酸鈉法主要溶解纖維素，處理時(shí)間短，對(duì)大麥仁的損傷小，經(jīng)過處理后大麥仍然是堅(jiān)硬完整的，只要控制好時(shí)間，不同批次之間測(cè)定值比較穩(wěn)定。氨水法處理過程會(huì)產(chǎn)生刺鼻氣味，處理后種子表面仍有一層內(nèi)種皮，而且腹溝的種皮不容易剝除，皮殼會(huì)有所損失，加上需要人為去殼，皮殼率精確度差，導(dǎo)致相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值偏大，皮殼率也偏低。結(jié)果準(zhǔn)確性不如千粒重法、NaClO堿液法。相對(duì)于千粒重法，堿性次氯酸鈉法更適合作為大批量處理的方法。

大麥皮殼率測(cè)定主要涉及大麥皮殼的溶解問題，皮殼經(jīng)氨水處理會(huì)增大皮殼的表面積和孔隙度，會(huì)部分溶解木質(zhì)素，表面堅(jiān)硬性質(zhì)發(fā)生改變，從而可以脫殼[12]；纖維素在堿液中會(huì)生成堿性纖維素而溶解[13]。NaClO溶液中游離的Cl-與纖維素的OH-基中的H原子和O原子發(fā)生作用，分子間氫鍵斷裂，纖維素溶解。低溫下氫氧化鈉水合物與纖維素上羥基通過氫鍵驅(qū)動(dòng)自組裝形成包合物，從而破壞纖維素原有的分子內(nèi)和分子間氫鍵，最終溶解纖維素[10]。可見，纖維素溶解化學(xué)的發(fā)展是推動(dòng)大麥皮殼率測(cè)定方法改進(jìn)的基礎(chǔ)。

大麥皮殼作為大麥粒重的重要組成成分，占粒重的10～20%，皮殼富含纖維素、木質(zhì)素和很多微量礦物元素。Tae Hyun等[12]研究表明大麥皮殼的70%左右是可利用的糖類，可以發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇；Bledzki[14]將大麥皮殼融入聚丙烯材料中，形成的復(fù)合材料比軟木復(fù)合材料抗拉強(qiáng)度提高了10%，其他性能也有所提升。本研究還發(fā)現(xiàn)，2%的NaOH將皮大麥煮沸2min左右就能脫下大部分的皮殼而皮殼溶解較少，從而盡可能多地保留大麥皮殼，使其能在后續(xù)加工中得到充分利用。隨著生物能源利用和高分子材料的興起，大麥及其皮殼的應(yīng)用將更加廣泛，未來若能開發(fā)出控制皮殼基因的分子標(biāo)記來輔助選擇育種，將會(huì)推動(dòng)大麥的飼用、啤用、食用、工業(yè)應(yīng)用方向的專向育種，培育出皮殼率含量符合需要的品種。

[1]俞志隆,徐阿炳,袁妙葆,等.大麥粒重與皮殼重的遺傳分析[J].遺傳,1988，(3):6～9.

[2]徐紹英,丁守仁.影響大麥粒重的若干因素的探討[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1979，(1):41～46.

[3]朱睦元,徐阿炳,俞志隆,等.啤酒大麥若干品質(zhì)與農(nóng)藝性狀的遺傳分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),1989，(5):3～15.

[4]朱睦元,徐阿炳,袁妙葆,等.若干啤酒麥芽品質(zhì)性狀的遺傳研究[J].大麥科學(xué),1989，(2):16～21.

[5]陸美琴,丁守仁.二棱大麥粒重、皮殼率和粒形性狀的遺傳分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1991，(4):10～14.

[6]徐紹英,陳文華,張偉梅,等.二棱大麥籽粒外觀品質(zhì)性狀的遺傳研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1994，(6):593～598.

[7]謝敬萱,張明生.大麥的幾種子粒品質(zhì)性狀間相關(guān)性及其影響因素的初步研究[J].作物雜志,1988，(3):13～14.

[8]管敦儀.啤酒工業(yè)手冊(cè)[M].北京:輕工業(yè)出版社,1982:827.

[9]孫玉山,徐紀(jì)剛,李昭銳,等.新溶劑法纖維素纖維開發(fā)概況與展望[J].紡織學(xué)報(bào),2014，(2):131～137.

[10]呂昂,張俐娜.纖維素溶劑研究進(jìn)展[J].高分子學(xué)報(bào),2007，(10):43～50.

[11]邰文峰,楊偉忠,石紅,等.毛粘混紡產(chǎn)品定量分析方法的研究[J].印染助劑,2006，(5):47～49.

[12]Kim Tae Hyun,Taylor Frank,Hicks Kevin.Bioethanol Production from Barley Hull Using SAA (soaking in Aqueous Ammonia) Pretreatment[J].Bioresource Technology,2007,99:5694～5702.

[13]李冬娜,馬曉軍,喬華.天然纖維素新溶劑體系的研究現(xiàn)狀及展望[J].中國(guó)包裝工業(yè),2012，(15):21～24.

[14]Bledzki Andrzej K,Mamun Abdullah A,Volk Jürgen.Barley Husk and Coconut Shell Reinforced Polypropylene Composites:the Effect of Fibre Physical,Chemical and Surface Properties[J].Composites Science and Technology,2010,70:840～846.

[編輯] 余文斌

2017-03-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201212)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金課題(20114220120003)。

龔強(qiáng)(1995-)，男，碩士生，研究方向?yàn)橹参锓肿佑N。通信作者：徐延浩，xyh09@yangtzeu.edu.cn。

S512.3

A

1673-1409(2017)14-0047-05

[引著格式]龔強(qiáng)，王國(guó)榮，李博，等.大麥皮殼率快速測(cè)定方法研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2017，14(14)：47～51.