VEGF抑制劑阿西替尼對人胃癌細(xì)胞周期及凋亡的影響

袁春秀，王寧菊，吳 婧

VEGF抑制劑阿西替尼對人胃癌細(xì)胞周期及凋亡的影響

袁春秀，王寧菊，吳 婧

目的 研究VEGF抑制劑阿西替尼( Axitinib)對人胃癌細(xì)胞AGS細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法 采用流式細(xì)胞儀檢測0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的阿西替尼作用AGS細(xì)胞24 h后對細(xì)胞周期的影響；采用同樣方法檢測該藥對AGS細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 阿西替尼將AGS細(xì)胞抑制在G2/M期，并呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿西替尼引起AGS細(xì)胞的凋亡，隨著給藥濃度增加，AGS細(xì)胞凋亡率也隨之增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 阿西替尼通過把胃癌AGS細(xì)胞阻滯在G2/M期而抑制細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡。

胃癌AGS細(xì)胞系；Axitinib；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

胃癌是全球消化道常見腫瘤之一，目前已成為世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤。至今其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，從腫瘤細(xì)胞學(xué)角度，本質(zhì)在于細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)失控[1]。近年來腫瘤靶向藥物的研究取得了很大進(jìn)展。阿西替尼( Axitinib) 是一種以酪氨酸激酶為靶向、抑制血管生成的新抗腫瘤藥，主要作用靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-2[2]。目前已用于晚期腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌治療中[3-5]，但Axitinib在胃癌治療方面的作用仍不清楚。本研究以體外培養(yǎng)人胃癌AGS細(xì)胞為研究對象，觀察Axitinib對胃癌細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：人胃癌AGS細(xì)胞系購自美ATCC公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Corning Cellgro，細(xì)胞凋亡試劑盒購于美國BD Biosciences公司。阿西替尼購自美國 Glaxo Smith Kline公司，胎牛血清(FBS)、PBS、RNase A、細(xì)胞周期測試PI均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中加入10%FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液備用。從-80 ℃冰箱中取出AGS胃癌細(xì)胞，放入 37℃水浴鍋中復(fù)蘇， 1 000 min離心5 min，棄上清液，用10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞種于培養(yǎng)瓶中；再置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2天觀察細(xì)胞生長情況。更換培養(yǎng)液，每3 d傳代1次，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)胞周期的檢測：將AGS細(xì)胞接種于六孔板中，細(xì)胞長至80%，用濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib處理24 h后，再用胰酶消化收集細(xì)胞至流式管中，使用預(yù) 冷的PBS緩沖液洗2遍；加入75%冰乙醇，在4 ℃冰箱固定過夜。第2天，使用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入500 μl PBS[含50 μg/mL碘化丙錠(PI)和50 μg/mL RNase A]，4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的測定：將AGS細(xì)胞接種于六孔板中，細(xì)胞長至80%，用濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L的Axitinib處理24 h后，再用胰酶消化收集細(xì)胞至流式管中，使用預(yù)冷的PBS緩沖液洗2遍。每個(gè)流式管中加入結(jié)合緩沖液400 μl，震蕩重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin- V-FITC，4 ℃冰箱避光孵育15 min；再加入碘化丙錠(PI)5 μl， 4 ℃孵育15 min(避光)。用預(yù)冷PBS洗一遍細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 Axitinib改變?nèi)宋赴〢GS細(xì)胞周期的分布：采用流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示Axitinib處理AGS細(xì)胞24 h后明顯將AGS細(xì)胞阻滯在G2 /M期，與0 μM比較，存在濃度依賴性。用0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L的Axitinib處理AGS細(xì)胞24 h后，隨著濃度升高，細(xì)胞處于G2 /M期比例增多(圖1，目錄后)，分別為(15.13±1.29)%、(30.5±0.68)%、(78.92±0.75)%(P<0.05)；而處于G1期和S期的細(xì)胞比例，隨著濃度增高而下降 (P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度Axitinib對AGS細(xì)胞周期(24 h)的影響

2.2 Axitinib誘導(dǎo)人胃癌AGS細(xì)胞的凋亡：用流式細(xì)胞儀檢測AGS細(xì)胞凋亡，隨著給藥濃度(0.1 μmol/L、1 μmol/L及5 μmol/L)的增加，AGS細(xì)胞凋亡率(早期+晚期)也隨之增加。與對照組比較，在5 μM濃度時(shí)，細(xì)胞凋亡率增加了近3.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度Axitinib對AGS細(xì)胞凋亡(24 h)的影響

3 討論

Axitinib是一種小分子TKI,主要靶向于VEGFR酪酸激酶、抑制血管生成的小分子抗癌藥[5],可介導(dǎo)多條信號通路抑制諸多受體酪氨酸激酶，包括血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、血小板源生長因子受體(PDGFR)、纖維母細(xì)胞生長因子受體(FGFR)、表皮生長因子受體(EGFR),以及整合蛋白等細(xì)胞表面受體[6]，這些受體和病理性血管的發(fā)生、 腫瘤發(fā)生及生長有關(guān)。已有研究報(bào)道，在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤異種移植模型中，Axitinib表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性與抑制血管生成的作用[7-12]。

本研究通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示各濃度Axitinib試驗(yàn)組細(xì)胞在G2 /M期的分布比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Axitinib可特異性地將胃癌AGS細(xì)胞阻滯在G2 /M期,通過改變腫瘤細(xì)胞周期來發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究還表明Axitinib可誘導(dǎo)人胃癌AGS細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。

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Effect of VEGF inhibitor Axitinib on cell cycle and apoptosis of gastric cancer cell line

YUANChunxiu，WANGNingjiu，WUJing.

1.DepartmentofOncology,GeneralHospitalNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia,China

WANGNingju,Email:doctorning@163.com

Objective To study the effect of VEGF inhibitor-Axitinib on the cell cycle and apoptosis of the AGS cell.Method The effect of axitinib on the cell cycle and apoptosis were analyzed using the flow cytometer by double staining with annexinV and propidium iodide.Results Axitinib can induce the cell-cycle of the AGS cell in G2/M phase and can induce the apoptosis in AGS cell，which were concentration-dependent.Conclusion Axitinib can inhibit the proliferation of AGS by arresting the cells in G2/M phase and inducing the apoptosis.

Axitinib;Gastriccancer;Cellcycle;Apoptosis

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0494

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，寧夏 銀川 750004

袁春秀(1976-)，女，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床與應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。

王寧菊，Email：doctorning@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.012.html

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2016-07-11 [責(zé)任編輯]馬興忠