采用iTRAQ技術(shù)研究柚皮苷對煙熏所致小鼠急性肺部炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

李泮霖，廖弈秋，劉宏，云莎，李沛波，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源與利用重點實驗室，廣東 廣州 510275)

采用iTRAQ技術(shù)研究柚皮苷對煙熏所致小鼠急性肺部炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

李泮霖，廖弈秋，劉宏，云莎，李沛波，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源與利用重點實驗室，廣東 廣州 510275)

采用iTRAQ技術(shù)，分析柚皮苷對煙熏誘導(dǎo)急性肺部炎癥小鼠肺組織中蛋白表達的影響。20只Balb/c小鼠隨機分為模型組和柚皮苷組，每組10只，煙熏誘導(dǎo)急性肺部炎癥。柚皮苷組每天于煙熏前按60 mg/kg灌胃給藥，模型組給予等量生理鹽水。最后一次煙熏16 h后處死小鼠，取肺組織進行iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，通過定性定量分析篩選差異表達蛋白。共鑒定小鼠肺組織蛋白3 528個，從中找出與柚皮苷作用相關(guān)的差異表達蛋白64個，其中表達上調(diào)的蛋白29個，下調(diào)蛋白35個。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要與炎癥介質(zhì)一氧化氮釋放和促氧化因子同型半胱氨酸代謝相關(guān)，可能是柚皮苷發(fā)揮減輕肺部炎癥及肺組織損傷、促進炎癥消退作用的重要環(huán)節(jié)；鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、表觀遺傳調(diào)控及核糖體蛋白功能調(diào)節(jié)也與柚皮苷的抗炎作用有密切聯(lián)系。實驗結(jié)果顯示Arg1、Bhmt、Gnmt等蛋白有可能為柚皮苷抗肺部炎癥作用的重要分子靶點，并為闡明柚皮苷的抗炎作用機制提供了基礎(chǔ)。

柚皮苷；iTRAQ；肺部炎癥；蛋白表達

柚皮苷為一種二氫黃酮類化合物，是嶺南道地藥材化橘紅的主要活性成分。本課題組前期對柚皮苷的藥理活性進行了深入研究，結(jié)果表明，柚皮苷除了具有顯著的止咳、祛痰作用外[1-10]；還對急慢性呼吸系統(tǒng)炎癥有明顯的抑制作用，同時還能促進炎癥的消退[11-14]。同位素標(biāo)記相對和絕對定量(Isobaric Tags For Relative And Absolute Quantitation，iTRAQ)技術(shù)是近年來發(fā)展的一種新的蛋白質(zhì)定性定量檢測技術(shù)[15]，通過同位素標(biāo)記精確地測量蛋白表達量的變化，具有蛋白覆蓋廣、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點，為發(fā)現(xiàn)和驗證藥物靶標(biāo)及分子作用機制提供了重要手段；iTRAQ技術(shù)在中藥研究的應(yīng)用尚處于發(fā)軔階段[16-18]。本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過分析柚皮苷對急性肺部炎癥小鼠肺組織蛋白表達的影響，探討柚皮苷抗肺部炎癥的作用機制，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性Balb/c小鼠20只，SPF級，體質(zhì)量17～19 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2014-0002。

1.2 儀器

煙熏箱(實驗室自制不銹鋼箱，0.8 m×0.8 m×1 m)，手持式激光粒子計數(shù)器(3016IAQ，美國Lighthouse公司)，電子分析天平(MS205 Du，瑞士梅特勒-托利多公司)，-80 ℃超低溫冰箱(DW-86L338，青島海爾特種電器有限公司)。

1.3 試劑

柚皮苷(本實驗室提取，HPLC純度為98.8%)，軟裝椰樹牌香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量13 mg，廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)，w=0.9%氯化鈉注射液(廣東利泰制藥股份有限公司)，PBS緩沖液(上海GOYBIO生物公司)。

1.4 實驗環(huán)境

經(jīng)過中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)，實驗動物飼養(yǎng)于中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中藥與海洋實驗室SPF級動物房，實驗單位使用許可證編號：SYXK(粵)2014-0200。購買實驗動物后，先在新環(huán)境下適應(yīng)1周再開始實驗，實驗過程中采取適當(dāng)?shù)姆椒p輕動物所受的傷害。

2 實驗方法

2.1 受試藥物的配制

稱取適量的柚皮苷，加生理鹽水配制成6 mg/mL的混懸液。

2.2 動物分組及給藥

20只Balb/c小鼠隨機分為2組，每組10只，分別為模型組柚皮苷組。每天第一次煙熏前1 h灌胃給藥，灌胃體積為每10 g體質(zhì)量0.1 mL，模型組給予等量生理鹽水。柚皮苷給藥劑量為60 mg/kg。

2.3 煙熏造模方法[19]

動物先于新環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后開始煙熏造模。每天煙熏2次，間隔4 h，每次采用8支香煙熏1 h，連續(xù)5 d。煙熏時除正常組外，將動物同時放入煙熏箱中，全身曝露于煙霧環(huán)境中，期間動物可在籠內(nèi)自由活動。煙熏時，將香煙插于插孔上并點燃，迅速關(guān)閉箱門。同位于煙熏箱內(nèi)的香煙插孔和出氣口由通氣管路連接，部分通氣管路延伸至箱外，中間連接一個腳踏式打氣筒，用以產(chǎn)生單向氣流。通過踩踏打氣筒，單向氣流由香煙插孔進入，同時帶出香煙煙氣，再由出氣口鼓入箱內(nèi)，產(chǎn)生煙熏環(huán)境。煙熏箱外圍有一層水冷夾層，可維持箱內(nèi)溫度于26 ℃左右；同時采用手持激光粒子計數(shù)器監(jiān)測箱內(nèi)空氣顆粒物濃度。

2.4 iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

2.4.1 組織采集 最后一次煙熏16 h后，脫頸椎處死小鼠，剪開胸腔，取出左右肺組織，迅速置于冰上，并用冰PBS緩沖液洗凈殘血，放入封口袋內(nèi)保存于-80 ℃冰箱，用于蛋白質(zhì)組學(xué)測定。

2.4.2 蛋白提取 小鼠肺組織加入含蛋白酶抑制劑的裂解液后，利用TissueLyser組織勻漿機進行裂解。裂解液25 000×g離心20min，小心移取上清液，加入5倍體積的冷丙酮，混勻，于-20 ℃放置過夜。混合液再次離心，取沉淀用裂解液溶解，加入10mmol/LDDT溶液，于56 ℃放置1h，以減少多肽間的二硫鍵。再加入55mmol/L的IAM溶液，避光放置45min后，加入5倍體積的冷丙酮，于-20 ℃放置2h。離心，取沉淀加入裂解液溶解，即得樣品的蛋白溶液。

2.4.3 蛋白消化 從每個樣品中分別精確取出100μg蛋白，按照蛋白和酶的質(zhì)量比為20∶1的比例加入胰蛋白酶，于37 ℃消化4h；再次按相同比例加入胰蛋白酶，繼續(xù)消化8h。

2.4.4iTRAQ標(biāo)記 根據(jù)iTRAQReagent8-plexKit提供的操作方法進行iTRAQ標(biāo)記。將胰蛋白酶消化后的樣品真空離心干燥，殘渣加0.5mol/L的TEAB溶液復(fù)溶，加入不同的同位素標(biāo)簽，孵育2h。標(biāo)記后的樣品隨后進行反相色譜分級。

2.4.5 反相色譜樣品分級 在質(zhì)譜分析之前，對胰蛋白酶肽處理后的復(fù)雜混合物進行分段，以提高全蛋白質(zhì)組的覆蓋率。采用ShimadzuLC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)，PhenomenexGeminiC18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以5%乙腈-95%H2O(體積比，pH9.8)為流動相A，以5%H2O-95%乙腈(體積比，pH9.8)為流動相B。孵育后的樣品加流動相A至2mL，洗脫梯度為：0～10min，φ=5%流動相B；10～50 min，φ=5%～35%流動相B；50～51 min，φ=35%～95%流動相B；51～54 min，φ=95%流動相B；54～55 min，φ=95%～5%流動相B；55～65 min，φ=5%流動相B，流速1 mL/min。通過監(jiān)測214 nm下的吸光度進行組分收集，每1 min收集1個組分。將收集到的組分合并為20個，真空干燥。

2.4.6 LC-Triple TOF 5600-MS/MS檢測 采用LC-20AD nanoHPLC納升級高效液相色譜(Shimadzu，Kyoto，Japan)，C18富集柱(2 cm)，C18分析柱(長18 cm，內(nèi)徑75 μm，自制)。每個組分用含φ=2%乙腈和φ=0.1%甲酸的水溶液重新混懸，20 000 ×g離心10min，多肽終質(zhì)量濃度約為0.5μg/μL，取上清液進樣分析。以φ=0.1%甲酸水溶液為流動相A，以含φ=0.1%甲酸的乙腈為流動相B。樣品以8 μL/min上樣4 min，分析洗脫梯度為：0～0.1 min，φ為5%～10%流動相B；0.1～40 min，φ為10%～32%流動相B；40～44 min，φ為32%～55%流動相B；44～45 min，φ為55%～80%流動相B；41～50 min，φ=80%流動相B；50～50.1 min，φ為80%～5%流動相B；50.1～60 min，φ=5%流動相B。流速300 nL/min。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Triple TOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX，Concord，ON)采集，配有Nanospray Ⅲ納升流速離子源(AB SCIEX，Concord，ON)和石英發(fā)射器(New Objectives，Woburn，MA)。操作控制軟件為Analyst 1.6(AB SCIEX，Concord，ON)。質(zhì)譜參數(shù)為：離子噴霧電壓2.4 kV，氣簾氣35 psi，霧化氣18 psi，加熱溫度150 ℃，分辨率約為30 000。全掃時間為250 ms，當(dāng)離子強度超過150 counts/s且?guī)?～5個正電荷時觸發(fā)IDA采集，每次最多可進行30個子離子掃描?？偛杉芷跒?.3 s，Q2傳輸窗口為100(100%)。采用波動的碰撞能量對所有母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離。

2.5 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜檢測源文件首先用ProteoWizard軟件中的msConvert工具轉(zhuǎn)換為MGF格式，然后使用Mascot(version 2.3.02)軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索。根據(jù)QC控制結(jié)果的可靠性，判斷是否要重新分析。蛋白鑒定至少要有一個特異肽段。采用結(jié)合Mascot Percolator和高級統(tǒng)計算法的IQuant軟件[20]對不同同位素標(biāo)記的肽段的MS/MS信號進行定量分析，以差異倍數(shù)≥1.2(上調(diào))或≤0.8(下調(diào))，且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達蛋白。進一步對差異表達蛋白進行GO(Gene Ontology)富集分析，并利用STRING10.0數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行相互作用分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)定性鑒定及定量分析

通過iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LC-Triple TOF-MS/MS技術(shù)，共鑒定到3 528種肺組織蛋白。按照上述差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)，與模型組相比，柚皮苷組共檢測到64個差異表達蛋白，其中表達上調(diào)的蛋白29個，下調(diào)蛋白35個(表1)。

3.2 差異表達蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

對差異表達蛋白進行GO富集分析，結(jié)果表明，差異蛋白的分子功能主要富集于轉(zhuǎn)移酶活性、乙醛脫氫酶活性、鈣依賴蛋白結(jié)合活性、激酶調(diào)節(jié)活性等(表2)，提示其可能具有調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激、信號傳導(dǎo)等功能；差異蛋白參與的生物過程主要與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的表觀遺傳修飾、對外界刺激的應(yīng)答及氧化應(yīng)激相關(guān)(表3)。

表1 64個差異表達蛋白Table 1 Sixty-four differentially expressed proteins

續(xù)表1

UniprotID蛋白名稱蛋白縮寫相對分子質(zhì)量/103唯一肽段數(shù)比值1)Q61176Arginase-1Arg134.960.694Q91Y97Fructose-bisphosphatealdolaseAldob39.970.691Q7TNB2PutativeuncharacterizedproteinTnnt116.610.686P97298Pigmentepithelium-derivedfactorSerpinf146.220.685Q8CAA7Glucose1,6-bisphosphatesynthasePgm2l129.410.683P43030Chemokine(C-X-Cmotif)ligand7,isoformCRA_bPpbp12.620.677Q64735X/YproteinCr1l37.710.676Q8C196Carbamoyl-phosphatesynthase[ammonia]Cps1165.7290.659P54869Hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase,mitochondrialHmgcs257.350.634Q9QXF8GlycineN-methyltransferaseGnmt33.130.597P16460ArgininosuccinatesynthaseAss146.810.585P14246Solutecarrierfamily2,facilitatedglucosetransportermember2Slc2a257.510.577Q9DBT9DimethylglycinedehydrogenaseDmgdh97.440.547Q91WK1SPRYdomain-containingprotein4Spryd423.410.444Q14BK3Testis-expressedsequence35proteinTex3521.910.398Q60766Immunity-relatedGTPasefamilyMprotein1Irgm132.510.377O35490Betaine-homocysteineS-methyltransferase1Bhmt45.470.349Q3MJ13ProteinWdr72Wdr72126.710.162

1)為柚皮苷組蛋白表達量與模型組蛋白表達量之比

表2 差異表達蛋白的分子功能分析Table 2 Molecular function enrichment analysis results of differentially expressed proteins

表3 差異表達蛋白的生物過程分析Table 3 Biological process enrichment analysis results of differentially expressed proteins

利用STRING10.0數(shù)據(jù)庫對差異蛋白間的相互作用進行分析，結(jié)果如圖1所示。相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的節(jié)點蛋白包括上調(diào)蛋白：鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶(Otc)，核糖體蛋白L15(Rpl15)，核糖體蛋白L30(Rpl30)，鈣調(diào)蛋白(Calm1)，組蛋白H1.3(Hist1h1d)，組蛋白H1.4(Hist1h1e)，組蛋白H1.5(Hist1h1b)，組蛋白H2A(Hist2h2aa1)，核心組蛋白H2A.1(H2afy)，組蛋白H4(Hist2h4)；以及下調(diào)蛋白：二甲基甘氨酸脫氫酶(Dmgdh)，甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Bhmt)，精氨酸酶1(Arg1)，甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(Gnmt)，氨基甲酰磷酸合成酶(Cps1)，肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈9(Myl9)。這些蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)與炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)的生成、促氧化因子同型半胱氨酸(Hcy)代謝途徑、鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、表觀遺傳調(diào)控及核糖體蛋白功能關(guān)聯(lián)密切，提示可能為柚皮苷抗肺部炎癥的重要作用環(huán)節(jié)。

圖1 差異表達蛋白的相互作用分析Fig.1 The results of protein-protein interactions of differentially expressed proteins

4 討 論

藥物作用于人體時必然會引起分子、細胞、器官等多個層面狀態(tài)和功能的改變，而這些變化的直接作用者主要就是蛋白質(zhì)，其表達水平、存在方式以及相互作用等直接與生物功能相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)即是以一種基因組所表達的全部蛋白質(zhì)為研究對象，從整體角度研究蛋白質(zhì)表達差異與其功能關(guān)聯(lián)性的技術(shù)手段。其中，定量蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以精確測量樣品中所有蛋白質(zhì)在不同狀態(tài)下表達水平的動態(tài)變化，對于疾病生物標(biāo)志物及藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)等研究具有十分重要的意義，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要方向。目前基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法兩大類，非標(biāo)記法樣品前處理及數(shù)據(jù)采集方法較簡單，對變化倍數(shù)較高的蛋白質(zhì)定量準(zhǔn)確度較好[21]，但對質(zhì)譜儀器的重現(xiàn)性要求很高；而標(biāo)記法需要使用價格較高的標(biāo)記試劑，但受儀器重現(xiàn)性的影響小，定量精密度較好，例如iTRAQ技術(shù)可以在一針內(nèi)比較至多8個樣品的信息，更適合于多個處理間及樣品隨時間變化情況的比較。因此本研究利用iTRAQ技術(shù)，從蛋白水平上發(fā)現(xiàn)與柚皮苷抗炎作用相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)及其功能。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的節(jié)點蛋白Arg1、Otc、Bhmt、Gnmt等可能在柚皮苷抗肺部炎癥的作用的發(fā)揮中扮演重要角色。

Arg1為一種精氨酸酶亞型，可催化水解精氨酸生成鳥氨酸與尿素，在氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)給予氣道高反應(yīng)和炎性因子分泌的始動因子IL-13，可導(dǎo)致小鼠肺組織中Arg1水平明顯增高[22]。而當(dāng)肺泡上皮細胞中Arg1過度表達時，可導(dǎo)致NO生成減少、NF-κB活性增強，從而促進氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生[23]。說明炎癥發(fā)生時會伴隨Arg1表達上調(diào)，Arg1表達的變化又與肺部NO釋放密切相關(guān)。本實驗柚皮苷給藥后，小鼠肺組織中Arg1表達下調(diào)，表明柚皮苷可能通過抑制Arg1表達，提高體內(nèi)NO濃度、抑制NF-κB活化，從而抑制香煙煙霧引起的促炎因子分泌，發(fā)揮抗炎作用。這也與本課題組前期藥理實驗結(jié)果一致[14,24]。此外，Arg1水解精氨酸產(chǎn)生的鳥氨酸，可進一步水解為腐胺等聚肽類及脯氨酸[25]，這兩類物質(zhì)分別可通過促進細胞增殖和膠原蛋白生成而導(dǎo)致氣道重塑[26]。本實驗中，柚皮苷給藥后一方面Arg1表達下調(diào)，使得聚肽及脯氨酸等促進氣道重塑的代謝產(chǎn)物生成減少；另一方面Otc表達上調(diào)，Otc可催化鳥氨酸向瓜氨酸轉(zhuǎn)化，從而使鳥氨酸向聚肽及脯氨酸水解減少。因此柚皮苷可能通過Arg1與Otc共同作用，減輕氣道重塑。

在氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)方面，柚皮苷同時影響了Hcy代謝通路中關(guān)鍵的代謝酶和甲基化酶Bhmt和Gnmt。在常見的呼吸系統(tǒng)疾病中，Hcy可通過氧化應(yīng)激、妨礙內(nèi)皮損傷的修復(fù)、改變基因組甲基化水平等機制影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[27]。例如，在COPD患者中，Hcy因代謝途徑受損而在體內(nèi)積聚，同時肺部氧化應(yīng)激增強[28]。Hcy還可干擾抗氧化劑谷胱甘肽的合成[29]，促進促炎細胞因子IL-6的分泌和表達[30]，進一步加重組織損傷和炎癥反應(yīng)。柚皮苷給藥后，小鼠肺組織中Bhmt、Gnmt表達水平均下調(diào)，已知Bhmt、Gnmt表達水平與小鼠組織Hcy水平呈正相關(guān)[31]，由此推測小鼠肺組織中Hcy水平也相應(yīng)下降，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減弱。因此，柚皮苷可能通過調(diào)節(jié)Hcy代謝途徑，降低小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平，起到減輕組織損傷及促進損傷修復(fù)的作用。

其他關(guān)鍵的差異表達蛋白還包括Calm1、組蛋白H1.3、H1.4、H1.5、H2A、H2A.1、H4以及核糖體蛋白Rpl15、Rpl30。Calm1為一種鈣調(diào)蛋白，可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與介導(dǎo)很多生物過程，包括炎癥反應(yīng)、物質(zhì)代謝、細胞凋亡、細胞骨架調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳導(dǎo)及免疫反應(yīng)等。組蛋白表達水平的變化一方面說明柚皮苷可能抑制了組蛋白降解和細胞凋亡，對肺組織損傷具有保護作用；另一方面也表明柚皮苷的作用可能與表觀遺傳調(diào)控相關(guān)。核糖體蛋白除組成核糖體、參與蛋白質(zhì)的生物合成之外，還參與DNA修復(fù)、細胞發(fā)育調(diào)控和細胞分化等核糖體外功能。例如已有研究表明核糖體蛋白質(zhì)Rpl15的甲基化及缺失與非小細胞肺癌有密切聯(lián)系[32]。因此，鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、表觀遺傳調(diào)控及核糖體蛋白功能的調(diào)節(jié)也可能是柚皮苷的抗炎作用的重要環(huán)節(jié)。

iTRAQ定量分析結(jié)果仍需要進一步的驗證，通常采用傳統(tǒng)的免疫學(xué)定量檢測方法如Western和ELISA等，但由于對抗體的依賴，無法進行大規(guī)模的目標(biāo)蛋白驗證。而利用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)技術(shù)可以更好地對定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進行靶向驗證。MRM是近年來發(fā)展起來的針對靶標(biāo)分子進行質(zhì)譜分析的技術(shù)，通過質(zhì)譜檢測靶標(biāo)蛋白的母離子和子離子的響應(yīng)，從而獲取靈敏度高、重現(xiàn)性好的的定性定量信息[33]。與iTRAQ等全譜型的蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比，MRM更偏重于對有限的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行較準(zhǔn)確的定量測定，因此很適合用于對iTRAQ結(jié)果進行驗證。下一步我們也將利用MRM，對分析得到的關(guān)鍵蛋白進行靶向驗證，更深入地探討柚皮苷抗肺部炎癥的分子機制。

中藥化橘紅用于治療呼吸系統(tǒng)疾病歷史悠久，柚皮苷為其最主要的活性成分，具有顯著的止咳、祛痰和抗炎作用。本研究采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過分析柚皮苷對急性肺部炎癥小鼠肺組織蛋白表達的影響，找出64個與柚皮苷作用相關(guān)的蛋白，這些蛋白參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、信號傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的表觀遺傳修飾等多個環(huán)節(jié)，可能與柚皮苷減輕炎癥造成的肺組織損傷、促進炎癥消退加快康復(fù)進程的作用相關(guān)；Arg1、Bhmt、Gnmt等蛋白有可能為柚皮苷抗肺部炎癥作用的重要分子靶點。本研究為柚皮苷抗肺部炎癥的分子機制研究提供了重要的依據(jù)和線索。應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)學(xué)可以全面、快速地了解藥物多途徑的作用機制，可進一步嘗試用于中藥復(fù)方多成分多靶點作用機制的研究，為科學(xué)解釋中藥的復(fù)雜作用機制提供依據(jù)。

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Naringin’s influence on the protein expressions in the lung tissues of cigarette smoke induced acute lung inflammation in mice by iTRAQ technology

LI Panlin, LIAO Yiqiu, LIU Hong, YUN Sha, LI Peibo, SU Weiwei

(School of Life Sciences, Sun Yat-sen University∥Guangdong Engineering and Technology Research Center for Quality and Efficacy Re-Evaluation of Post-Marketed TCM∥Guangdong Key Laboratory of Plant Resources，Guangzhou 510275，China)

The naringin’s influence on the protein expressions in the lung tissues of cigarette smoke induced acute lung inflammation in mice was examined by iTRAQ technology. Twenty Balb/c mice were randomly divided into the model group and the naringin group with ten mice in each group. Naringin was administered by gavage at a dose of 60 mg·kg-1·d-1before smoke treatment, while mice in model group were given normal saline. All mice were sacrificed 16 h after the last smoke treatment. The lung tissues were collected and analyzed by iTRAQ technology. Differentially expressed proteins were screened through identification and quantification analysis. As a result, a total of 3 528 proteins were identified, of which 64 proteins were differentially expressed after administration of naringin, including 29 up-regulated and 35 down-regulated proteins. Bioinformatics analysis indicated that these differentially expressed proteins were mainly associated with the release of inflammatory mediator nitric oxide and the metabolism of pro-oxidant agent homocysteine. These may provide an important contribution to naringin’s effects on the protection of lung tissue injury caused by inflammation and promotion of inflammation resolution. Arg1, Bhmt and Dnmt may play important roles in the therapeutic effects of naringin on the lung inflammation diseases. The present study could provide a useful basis for the mechanism study of naringin.

naringin; iTRAQ; lung inflammation; protein expressions

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.04.017

2016-09-18 基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81374041)

李泮霖(1989年生)，女；研究方向：中藥學(xué)；E-mail：lipanlin@gmail.com

蘇薇薇(1959年生)，女；研究方向：創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)、中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價； E-mail：lsssww@126.com

R965

A

0529-6579(2017)04-0102-09