高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張志強+李思思+李輝+梁魁景+劉言+王婷婷+由明揚

摘要：為篩選淀粉酶高產(chǎn)菌株，通過比較水解圈與菌落的直徑比及3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色法所測酶活性高低，篩選得到高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株WB-4。通過單因素試驗，得到該菌株的最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨。利用Plackett-Burman進行顯著因素篩選，發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度為顯著因素。利用響應(yīng)面法對顯著因素進行優(yōu)化，得到菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件為可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，溫度 31.12 ℃，淀粉酶活性 365.12 U/mL，酶活性提高了1.33倍。

關(guān)鍵詞：高產(chǎn)淀粉酶菌株；響應(yīng)面法；Plackett-Burman因素篩選；發(fā)酵條件優(yōu)化；工業(yè)化應(yīng)用

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0221-03

淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一類酶的總稱[1]。淀粉酶來源極其廣泛，不僅動物的唾液、胰臟富含淀粉酶，植物體內(nèi)也含有豐富的淀粉酶，但是，目前商業(yè)化生產(chǎn)的淀粉酶主要由微生物發(fā)酵提煉所得[2]。自從19世紀初德國科學(xué)家Kirchhoff發(fā)現(xiàn)淀粉酶以來，有關(guān)淀粉酶的研究報道逐年增加，淀粉酶的應(yīng)用也越來越廣泛。特別是在釀造工業(yè)、紡織、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)保、洗滌劑等方面得到了廣泛的應(yīng)用[3]。近年來，雖然我國淀粉酶的品種、產(chǎn)量不斷增加，但是與國外相比，我國的淀粉酶品種相對偏少、產(chǎn)量偏低[4]。為了適應(yīng)經(jīng)濟快速發(fā)展對淀粉酶的需求，本試驗對河北省衡水市周邊采集到的樣品進行分離篩選，并利用響應(yīng)面法進一步提高其產(chǎn)量，以期為淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用提供支持。

1材料與方法

1.1樣品

試驗所用樣品采集地點為河北省衡水市某面粉廠、某食品加工廠、某學(xué)校食堂。

1.2培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，3 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，2 g/L 可溶性淀粉，20 g/L瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，其他成分同篩選培養(yǎng)[LL]基。

1.3試驗方法

1.3.1產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選初篩：取1 g不同地點采集的樣品溶解于9 mL滅菌蒸餾水中，然后進行梯度稀釋，直到10-7稀釋度為止。取0.1 mL不同稀釋倍數(shù)的樣液涂布到篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)數(shù)天，劃線純化，直到獲得單菌落為止。將得到的單菌落接種到篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，經(jīng)碘液染色后根據(jù)水解圈的大小，初步篩選出產(chǎn)淀粉酶的菌株。

復(fù)篩：將初篩到的菌株接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于5 000 r/min離心 10 min，取上清液測定酶活性，選取酶活性較高的菌株作為試驗菌種。

1.3.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.2.1單因素試驗在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別加入05%不同碳源（麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、乳糖）替換其碳源成分，進行碳源優(yōu)化試驗。在最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，分別以不同氮源（硝酸銨、尿素、硫酸銨、胰蛋白、牛肉膏、蛋白胨）替換培養(yǎng)基中氮源成分，進行氮源優(yōu)化試驗。

1.3.2.2篩選顯著因素用Design Expert 7.0軟件中的Plackett-Burman對可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、牛肉膏含量、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、初始pH值等7個因素進行設(shè)計，每個因素分別按低水平（-1）、高水平（+1）進行設(shè)計（表1），

1.3.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化以“1.3.2.2”節(jié)篩選到的顯著因素為基礎(chǔ)，利用中心組合設(shè)計原理，對選取的顯著因素從5個水平進行考察，確定最優(yōu)條件，并驗證其準確性。

1.3.3淀粉酶活性測定淀粉酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[5]。酶活性單位定義：1 U（單位酶活）表示在試驗條件下1 min釋放出1 μmol還原糖需要的酶量。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

樣品經(jīng)涂布及多次純化后，將得到的單菌落接種到篩選培養(yǎng)基上，進行淀粉酶水解圈試驗。經(jīng)初步篩選共有32株菌株產(chǎn)生了透明圈，其中水解圈/菌落直徑比（即D/d值）大于2的菌株共有8株，分別命名為WB-1、WB-2、WB-3、WB-4、WB-5、WB-6、WB-7、WB-8；D/d值最大的為 WB-3，其次為WB-4，再次為WB-2（表2）。因此，初步篩選這3株菌株進行復(fù)篩。

將初篩得到的3個菌株WB-2、WB-3、WB-4接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時間后，進行酶活性測定。結(jié)果顯示，WB-2、WB-3、WB-4的酶活性分別為126.4、137.3、156.5 U/mL。水解圈的大小在一定程度上可以反映酶活性的高低，但是卻不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力的強弱，其原因可能是不同菌株在生長、產(chǎn)酶速度上存在差異、菌苔的大小及其在平板上的堆積情況存在差異，此外，還有可能是由于固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件存在差異等[6]。因此，在選擇菌株時不能以水解圈的大小作為唯一標準。雖然WB-4的 D/d 值小于WB-3，本試驗綜合考慮水解圈大小及產(chǎn)酶能力的高低，最終選擇WB-4作為目的菌株。

2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1單因素試驗用6種不同碳源替換搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，測定上清液淀粉酶活性。從圖1可以看出，以可溶性淀粉作為碳源時，酶活性最高，乳糖次之，甘油最低，因此選擇可溶性淀粉作為碳源。

用6種不同氮源替換搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，于 30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，測定上清液淀粉酶活性。從圖2可以看出，以蛋白胨作為氮源時，淀粉酶活性最高，以牛肉膏作為氮源時也能取得較好的效果。而以硫酸銨、硝酸銨、尿素等無機物質(zhì)作為氮源，產(chǎn)酶效果較差。因此，本試驗選擇蛋白胨作為氮源。

2.2.2顯著因素的篩選利用Design Expert 7.0軟件中的Plackett-Burman對7個因素進行設(shè)計，具體方案及結(jié)果見表3、表4。一般認為P值>F值小于0.05，說明該因素為顯著因素。由表4可以看出，可溶性淀粉含量、蛋白胨含量及溫度的P值>F值的值分別為0.006 2、0.046 1、0.015 0，說明這3個因素為顯著因素，因此選擇可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度進行進一步的優(yōu)化試驗。

2.2.4驗證模型的可靠性通過該模型擬合得出生產(chǎn)淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件：可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，溫度31.12 ℃，預(yù)測最高淀粉酶活性為 371.89 U/mL。在最佳培養(yǎng)條件下得到的淀粉酶活性為 365.12 U/mL，與預(yù)測的最佳淀粉酶活性相差很小，說明該模型可用于淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。

3結(jié)論

筆者所在課題組對河北省衡水市周邊采集到的樣品進行篩選。在綜合考慮初篩及復(fù)篩的結(jié)果后，決定將WB-4作為

目的菌株進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。對菌株進行單因素優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman確定了可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度為顯著因素。利用響應(yīng)面法對3個顯著因素進行優(yōu)化，通過分析顯著因素與酶活性之間的關(guān)系，建立了兩者之間的數(shù)學(xué)模型，通過響應(yīng)面法的分析得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，培養(yǎng)溫度 31.12 ℃，預(yù)測最高酶活性為371.89 U/mL，實測值為 365.12 U/mL，相差較小，說明優(yōu)化結(jié)果可信。通過優(yōu)化使得淀粉酶活性由最初的156.5 U/mL提高到365.12 U/mL，提高了1.33倍，效果明顯，為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供了有力的支持。

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江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]施磊，扶教龍，吳晨奇，等. 產(chǎn)輔酶Q10根瘤土壤桿菌的紫外誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：224-228.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.10.062

產(chǎn)輔酶Q10根瘤土壤桿菌的紫外誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

施磊， 扶教龍， 吳晨奇， 錢大偉， 徐敏強， 鞠鑫， 李良智

（蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009）

摘要：以根瘤土壤桿菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外誘變、平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終獲得1株輔酶Q10高產(chǎn)菌株 Q-6，其輔酶Q10產(chǎn)量為11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高92.57%，且其遺傳性穩(wěn)定，可用于進一步研究。然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到生產(chǎn)輔酶Q10的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方（葡萄糖35.46 g/L、酵母浸膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4·7H2O 0.39 g/L），在此培養(yǎng)基下輔酶Q10產(chǎn)量最高，為1132 mg/L，較單因素試驗最高值提高8.53%。

關(guān)鍵詞：根瘤土壤桿菌；輔酶Q10；紫外誘變；響應(yīng)面分析法；發(fā)酵培養(yǎng)基

中圖分類號： Q935文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0224-05

輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）別稱癸烯醌、泛醌，它是人類生命不可缺少的重要元素之一，能激活人體細胞，同時還能提高人體免疫力并增強人體活力，現(xiàn)在醫(yī)學(xué)上廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病的治療[1]，除此之外，輔酶Q10還具有抗氧化性、延緩衰老和增強人體活力等功能，所以現(xiàn)在它已經(jīng)在食品和化妝品領(lǐng)域得到大量應(yīng)用。輔酶Q10的制備有化學(xué)法、動植物組織提取法和微生物發(fā)酵法3種方法[2-4]。因為使用前2種方法合成輔酶Q10時的成本較高，并且會產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性也不是很高，所以現(xiàn)在微生物發(fā)酵法被認為是最具有前途的一種生產(chǎn)方式。本試驗選擇根瘤土壤桿菌為出發(fā)菌株，該菌是目前研究CoQ10生物發(fā)酵法較常用的菌種[5-7]。通過紫外照射誘導(dǎo)變異和平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩相結(jié)合的方法，以期獲得CoQ10高產(chǎn)菌，為提高CoQ10工業(yè)生產(chǎn)效率打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種與試劑

根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens 1.1701）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏于筆者所在試驗室。輔酶Q10標準品（美國Sigma 公司），分析純。其他藥品和試劑，均為分析純或化學(xué)純。

1.1.2培養(yǎng)基

（1）平板培養(yǎng)基。葡萄糖5 g/L，酵母膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（2）斜面培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（3）種子培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Na2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3試驗設(shè)備

紫外分光光度計（UV-2450，日本島津）；可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床（上海躍進醫(yī)療器械廠）；數(shù)顯pH計（上海天達儀器有限公司）；生物傳感分析儀等。

1.2方法

1.2.1菌種活化

將保存的原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，將接種后的斜面試管置于恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃下培養(yǎng)48 h，之后再進行第2、第3次傳代培養(yǎng)，放入冰箱冷藏待用。

1.2.2種子液培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基中接1環(huán)菌種于種子培養(yǎng)基中，將接好種的三角瓶放入搖床中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，種子培養(yǎng)基為250 mL錐形三角瓶中裝入50 mL培養(yǎng)基。

1.2.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)是將培養(yǎng)好種子培養(yǎng)液按10%（體積分數(shù)）接種量的接入裝有50 mL發(fā)酵液的 250 mL 三角瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后進行相關(guān)參數(shù)測定。

1.2.4皂化法提取輔酶Q10

將菌體移入250 mL磨口錐形瓶內(nèi)，在錐形瓶中加入2.5 g KOH、0.7 g焦性沒食子酸、19 mL 甲醇、7mL蒸餾水，然后混勻，在90 ℃水浴鍋中回流 30 min，用自來水迅速冷卻到常溫，倒入分液漏斗中，在分液漏斗中加入40 mL石油醚，劇烈振蕩5 min，進行輔酶Q10的萃取，連續(xù)萃取2次，最后把萃取液合并，用蒸餾水洗滌到中性；然后加入5 g無水硫酸鈉，干燥并使液體澄清；再用50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，并且完全揮發(fā)，再加入5 mL無水乙醇，放入冰箱中冷凍，使膽固醇等雜質(zhì)析出，過濾，濾液定容至 10 mL，進行測量。

1.2.5輔酶Q10產(chǎn)量的測定

參照紫外分光光度法[8]。

1.2.6菌株生長曲線的繪制

進行紫外誘變時，通常在細胞對數(shù)期進行紫外照射導(dǎo)致發(fā)生突變的概率較大，因此須要確定出發(fā)菌株的生長曲線。吸取5 mL生理鹽水注入活化好的根瘤土壤桿菌斜面種子中，用竹簽或接種針將菌落刮下，將菌懸液轉(zhuǎn)移至空試管中用振蕩器混勻，從中吸取1 mL菌懸液（按2%接種量）接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，每間隔2 h 取9 mL種子液于事先已稱好的10 mL離心管中，于4 000 r/min下離心15 min。洗滌后離心，重復(fù)2次，烘干測干質(zhì)量，并且計算菌體濃度。將各時段的菌體濃度作為縱坐標，培養(yǎng)時間作為橫坐標，繪制出發(fā)菌株的生長曲線。

1.2.7紫外誘變方法

1.2.7.1菌懸液的制備

取10 mL處于對數(shù)生長期（培養(yǎng)12 h）的發(fā)酵液，加入進無菌離心管中，10 000 r/min下離心20 min，去除上清液，收集菌體，菌體用10 mL生理鹽水洗滌離心3次，然后重新懸于10 mL無菌生理鹽水中，備用。使用血球計數(shù)板，在顯微鏡下直接計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為“億個/mL”。

1.2.7.2紫外誘變

開啟20 W的紫外線燈預(yù)熱10～15 min，取3 mL制備好的菌懸液，置于1個直徑為6 cm的空培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在離紫外燈30 cm的地方，分別振蕩照射0、30、60、90、120、150、180 s，然后在黑暗中分別取0.1 mL處理菌液涂布于平板培養(yǎng)基上，用黑紙包好，30 ℃下倒置培養(yǎng)48 h，計數(shù)，繪制致死率曲線。同時，作對照試驗，對照組菌懸液不進行紫外照射，其他操作相同。致死率[9]計算公式為：致死率=（對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100%。在正式試驗時，選取致死率為80%的處理時間進行誘變，其余操作同上。

1.2.7.3初篩

根據(jù)致死率曲線，將誘變后的菌液涂布于篩選平板培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)48 h；挑取生長快、菌落大的單菌落，接入斜面，30 ℃培養(yǎng)48 h，置于4 ℃冰箱保藏，以備復(fù)篩。

1.2.7.4復(fù)篩

將初篩得到的突變株菌株逐個接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，離心收集菌體，利用醇堿皂化法提取輔酶Q10，測定菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量。

1.2.7.5突變株穩(wěn)定性試驗

利用斜面培劃線接種進行傳代試驗，30 ℃下培養(yǎng)48 h；分別測定第2、第4、第6代的輔酶Q10產(chǎn)量，比較其產(chǎn)輔酶Q10的穩(wěn)定性。

1.2.8發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.8.1發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗

本試驗選擇培養(yǎng)基中對發(fā)酵影響最大的葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 等4種成分，分別考察其不同濃度對誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響。其中，葡萄糖濃度為10、20、30、40、50 g/L，酵母膏濃度為5、7.5、10、12.5、15 g/L，Na2HPO4濃度為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 g/L，MgSO4·7H2O濃度為0.3、0.4、0.5、06、0.7 g/L。

1.2.8.2發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O為考察因素，采用Design-Expert軟件[10]中的中心組合設(shè)計（central composite design，CCD），設(shè)計4因素5水平的響應(yīng)面分析[11]試驗，其試驗因子和編碼水平見表1。

2結(jié)果與分析

2.1生長曲線

從圖1可以看出，出發(fā)菌株在4 h后開始進入對數(shù)期，18 h 后進入穩(wěn)定期。處于對數(shù)期的細胞中DNA復(fù)制較為活躍，對各種理化刺激較為敏感，出現(xiàn)突變的概率較大，因此選取4～18 h的細菌培養(yǎng)液進行紫外誘變出現(xiàn)變異的概率較大。

2.2紫外照射致死率曲線

從圖2可以看出，當輻照時間為120 s時，約97%的根瘤土壤桿菌致死。這幾年通過對紫外線誘變效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，提高產(chǎn)量的正向突變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負突變則較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中[12]。因此，本研究選取的誘變劑量為紫外線照射60～90 s，致死率約為70%～83%，此時發(fā)生正向突變的概率較大。

2.3紫外誘變菌株篩選結(jié)果

將經(jīng)過紫外誘變[13]處理后的菌懸液直接涂布于平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，從平板上挑取27株生長良好的單菌落，對這27株菌株進行搖瓶復(fù)篩，測定輔酶Q10產(chǎn)量，篩選結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，有7株突變株輔酶Q10的產(chǎn)量有所提高，正突變率約為26%。其中，6號突變株Q-6表現(xiàn)最突出，輔酶Q10的產(chǎn)量達到11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高了9251%，誘變結(jié)果最好，所以選擇突變株Q-6進行遺傳穩(wěn)定性研究。

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1葡萄糖濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，隨葡萄糖濃度的增加，輔酶Q10產(chǎn)量增大，當葡萄糖濃度達到30 g/L時，輔酶Q10產(chǎn)量達到最大，為（10.05±0.301 5）g/L；當葡萄糖濃度繼續(xù)加大時，輔酶Q10產(chǎn)量反而下降，這可能是由于在發(fā)酵過程中添加過多葡萄糖而引起的“葡萄糖效應(yīng)”，進而影響菌體生長和代謝產(chǎn)物的形成。因此，確定本試驗葡萄糖濃度為30 g/L。

2.5.2酵母膏濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，當酵母膏濃度低于12.5 g/L時，輔酶Q10產(chǎn)量不斷增大；當酵母膏濃度達到12.5 g/L時，輔酶Q10產(chǎn)量達到最大，產(chǎn)量為（10.42±0.312 6）g/L；當葡萄糖濃度繼續(xù)加大時，輔酶Q10產(chǎn)量反而下降，這可能是由于酵母膏成分復(fù)雜，在發(fā)酵后期底物消耗不完，某些成分抑制菌體生長及產(chǎn)物的合成。所以，酵母膏濃度定為12.5 g/L。

2.5.3Na2HPO4濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖6可以看出，當Na2HPO4濃度為1.6 g/L時，產(chǎn)量達到最大，此時輔酶Q10產(chǎn)量為（10.43±0.312 9）g/L；但繼續(xù)加大Na2HPO4濃度時，輔酶Q10產(chǎn)量逐漸下降，這表明過多的Na2HPO4并不利于提高輔酶Q10產(chǎn)量，只有適宜的Na2HPO4濃度才有利于輔酶Q10的形成。所以，在本試驗考察范圍內(nèi)，Na2HPO4最佳濃度為1.6 g/L。

2.5.4MgSO4· 7H2O濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，輔酶Q10產(chǎn)量隨MgSO4·7H2O濃度的升高，先升高后降低，并當MgSO4·7H2O濃度達到0.4 g/L時，輔酶Q10產(chǎn)量達到最大，此時產(chǎn)量為（10.23±0.306 9）g/L。這可能是由于較低濃度的Mg2+能夠促進輔酶Q10的形成，而當濃度達到一定高度時，又會抑制輔酶Q10的形成。所以，本試驗可把MgSO4·7H2O濃度定為0.4 g/L。

2.5.5響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成

2.5.5.1模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素結(jié)果，采用Design-Expert軟件對葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4· 7H2O的濃度進行優(yōu)化，試驗結(jié)果如表3所示。

用Design-Expert軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可以得到輔酶Q10

[FK（W+45mm][TPSL77.tif]

產(chǎn)量（Y）對葡萄糖濃度（A）、酵母膏濃度（B）、Na2HPO4濃度（C）、[CM（23*2]MgSO4· 7H2O濃度（D）的回歸方程為：Y=-49.20+

0.50A+2.60B+32.82C+49.17D+5.20AB-0.07AC-003AD+0.29BC-0.23BD-2.67CD-5.50A2-012B2-10.43C2-52.85D2，對試驗結(jié)果進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果如表4所示。

對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，一次項D（MgSO4· 7H2O濃度），交互項AC、BC對輔酶Q10產(chǎn)量影響顯著，平方項A2、B2、C2、D2對輔酶Q10產(chǎn)量影響極顯著。模型P值<0.000 1，是極顯著的，而失擬項的P值=0.789 2，是不顯著的，說明該方程的擬合度較好；模型的決定系數(shù)R2=0.976 1，表明該模型能較好地預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基組分與輔酶Q10產(chǎn)量的關(guān)系；模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0953 7，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述試驗結(jié)果。

2.5.5.2響應(yīng)面優(yōu)化及分析

根據(jù)CCD試驗設(shè)計結(jié)果作出三維響應(yīng)面（圖8至圖13），它們分別反映了葡萄糖濃度（A）、酵母膏濃度（B）、Na2HPO4濃度（C）、MgSO4· 7H2O濃度（D）這4個因素的兩兩交互作用對產(chǎn)量的影響。

2.5.5.3優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證

根據(jù)所得的模型，由響應(yīng)面分析法求得優(yōu)化后4種成分的最佳濃度為：葡萄糖35.46 g/L、酵母膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4· 7H2O 0.39 g/L，預(yù)測得到輔酶Q10最高產(chǎn)量為11.28 mg/L。為了證實試驗結(jié)果的可靠性，按上述最終培養(yǎng)基參數(shù)進行驗證試驗，3次重復(fù)試驗的輔酶Q10產(chǎn)量的平均值為11.32 mg/L，與預(yù)測值接近，表明模型是可行有效的，具有一定的實踐價值。

[BT1-*8][STHZ]3結(jié)論

采用紫外誘變，經(jīng)過平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終獲得1株輔酶Q10高產(chǎn)菌株Q-6，其輔酶Q10產(chǎn)量為11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高92.57%，且其遺傳性穩(wěn)定。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到生產(chǎn)輔酶Q10的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖35.46 g/L、酵

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