改進的變色酸分光光度法測海南粗榧生物堿總堿含量

王峰 喬飛 江雪飛

摘要：以傳統(tǒng)測定海南粗榧生物堿的方法為對照，參照改良的測甲醛含量的方法對其進行優(yōu)化，以建立安全、快捷、準(zhǔn)確測定海南粗榧生物堿總堿含量的新方法。結(jié)果表明，新方法兼?zhèn)湟陨?種方法的優(yōu)點，同時又避免了其缺點，具體表現(xiàn)為（1）用磷酸、過氧化氫取代98%濃硫酸，更安全；（2）用微波加熱取代水浴加熱，更快捷；（3）增加了揮發(fā)干甲醇溶劑的試驗步驟，排除了甲醇溶劑的干擾，更準(zhǔn)確；（4）試驗進一步明確了最佳加熱時間為35 s，最佳檢測波長為558 nm。結(jié)果還表明，新方法在0～20 μg/mL范圍內(nèi)，三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.018 4x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 5；重復(fù)性檢測樣品的RSD=0.59%；標(biāo)樣回收率98.85%～106.86%，且24 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法無顯著差異。綜上，新方法安全、快捷、可靠，可作為測定海南粗榧生物堿總堿含量的新方法。

關(guān)鍵詞：生物堿；總堿含量；海南粗榧；變色酸分光光度法；測定方法改進

中圖分類號： R284.1文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0146-04

海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis）為三尖杉科三尖杉屬孑遺植物，是三尖杉科分布位置最南的樹種，主產(chǎn)于我國海南省，為國家二級重點保護植物[1-2]。自20世紀(jì)70年代至今，科研人員從海南粗榧的樹皮、莖、葉、種子中已分離鑒定出50種生物堿，其中三尖杉堿3位羥基被?；蟮娜馍减A、高三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿和異三尖杉酯堿經(jīng)動物試驗和臨床實踐證實，對各類白血病及急性淋巴病的治療有明顯療效[3-5]，是目前抗癌最有潛力的自然藥源之一。因而，加強對海南粗榧資源的保護和開發(fā)利用研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。然而不同產(chǎn)地、不同樹齡、不同部位的海南粗榧生物堿的含量差異很大，因而建立準(zhǔn)確、快捷、安全的測定海南粗榧生物堿含量的方法，不僅有利于開展海南粗榧生物堿分布、影響生物堿含量的因素等各方面的研究工作，而且有利于對海南粗榧及其同屬植物資源開展藥用價值的評價工作。

目前分析植物生物堿及其制劑的方法主要有滴定法、分光光度法（酸性染料比色法）、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、紅外光譜法等[6]。其中分光光度法因其投資成本低、操作簡便、適用于總堿測定而被廣泛應(yīng)用。海南粗榧生物堿分子中含有亞甲二氧基結(jié)構(gòu)，亞甲二氧基在酸性條件下能水解生成甲醛，甲醛與變色酸反應(yīng)可生成紫色絡(luò)合物，因而可以通過變色酸分光光度法測定其含量[7]。目前測定海南粗榧生物堿總堿含量的方法就是參考傳統(tǒng)測定甲醛的變色酸分光光度法建立的（以下簡稱“方法1”）[7]，該方法具有價格便宜、操作簡單、反應(yīng)色澤靈敏和選擇性好等優(yōu)點，但最大的缺點是試驗過程中需要使用熱濃硫酸氧化與脫水，具有潛在的危險性、腐蝕性，并且需要水浴加熱顯色，試驗耗時長。

近年來，測定甲醛的變色酸分光光度法已經(jīng)得到改良，如試驗過程中的濃硫酸被磷酸取代，水浴加熱被微波加熱取代等，既增加了試驗的安全性，又縮短了試驗時間，提高了測定效率[8-12]。至于海南粗榧生物堿總堿含量能否用改良測甲醛的方法（以下簡稱“方法2”）[13]進行測定，如果能用，試驗條件需要哪些優(yōu)化等問題，都有待試驗驗證。本研究擬以方法1為對照，優(yōu)化方法2的試驗條件，以期建立一種安全、快捷又準(zhǔn)確的測定海南粗榧生物堿含量的方法（以下簡稱“方法3”）。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

主要儀器：紫外分光光度計（Beckman DU800），微波爐，水浴鍋。

主要試劑：變色酸（臨用前現(xiàn)配成0.1 g/mL溶液），過氧化氫（臨用前現(xiàn)配成0.025 moL/L溶液），濃硫酸（98%），磷酸（86%），甲醇（99.9%），三尖杉堿標(biāo)樣（購自上海源葉生物科技有限公司），除三尖杉堿標(biāo)樣、甲醇為色譜純外，其他試劑均為分析純。

1.2植物材料

本試驗以海南粗榧的嫩枝、葉片為材料，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶植物園（儋州），將采摘的嫩枝、葉片迅速置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于105 ℃殺青，80 ℃烘干后研磨成細粉備用。

1.3試驗設(shè)計

首先以三尖杉堿標(biāo)樣為試驗材料，參照方法1、方法2制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)試驗比對結(jié)果進一步對方法2的試驗試劑、檢測波長、加熱時間、試驗過程等各條件進行逐一優(yōu)化，綜合各優(yōu)化條件建立方法3。再以三尖杉堿標(biāo)樣、海南粗榧嫩枝、葉片提取的樣液為試驗材料，對方法3的重復(fù)性、標(biāo)樣回收率、有色化合物的穩(wěn)定性等各方面進行檢驗，最后以方法1的測定結(jié)果為參照，判斷方法3的準(zhǔn)確性，以期建立一種安全、準(zhǔn)確、便捷的測定海南粗榧生物堿總堿含量的新方法。

1.4試驗方法

1.4.1三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法精確稱取10.0 mg三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇并定容至5 mL容量瓶中，配制成濃度為2 mg/mL的母液。再將母液分別稀釋成濃度梯度為0、250、500、1 000、2 000 μg/mL的工作液，各1 mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法方法1[7]：分別取按“1.4.1”節(jié)配制的不同濃度梯度的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 100 μL，放入50 mL燒杯中，加現(xiàn)配的500 μL 0.1 g/mL變色酸溶液，再加入3.5 mL 98%濃硫酸，搖勻，于沸水浴中加熱20 min，取出后迅速用冷水浴冷卻，再加3 mL蒸餾水搖勻，待冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶內(nèi)并加水定容，于 570 nm 處比色，以三尖杉堿濃度為橫坐標(biāo)、D570 nm為縱坐標(biāo)制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

方法2[13]：分別取按“1.4.1”節(jié)配制的不同濃度梯度的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，放入50 mL燒杯中，加新配制的300 μL 0.1 g/mL變色酸溶液，加入3 mL 86%濃磷酸，70 μL 0.025 mol/L過氧化氫，搖勻，于1 200 W微波爐中加熱35 s，取出后室溫下冷卻，再加蒸餾水3 mL搖勻，待冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶內(nèi)并加水定容，于570 nm處比色，以三尖杉堿濃度為橫坐標(biāo)、D570 nm為縱坐標(biāo)制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3海南粗榧嫩枝、葉片中生物堿的提取方法[14]分別稱取“1.2”節(jié)制備的海南粗榧嫩枝、葉片干粉3 g，加2 mL 28%的氨水，加30 mL三氯甲烷后，用磁力攪拌器攪拌均勻，浸泡過夜后于3 000 r/min離心15 min，取三氯甲烷層溶液 10 mL，于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)干三氯甲烷，殘渣再用甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至1 mL小容量瓶中備用。試驗設(shè)3次重復(fù)。海南粗榧生物堿總堿含量以三尖杉堿計[7]。

2結(jié)果與分析

2.12種方法制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

用方法1建立的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）的相關(guān)系數(shù) r=0.998 8，回歸方程為y=0.020 5x。用方法2建立的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）的相關(guān)系數(shù)r=0.931 0，回歸方程為 y=0.015 3x。通過比較發(fā)現(xiàn)，將測甲醛的方法2直接用于測定三尖杉堿時，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)有所降低，與方法1的0.998 8相差較大，有待改良。分析可能導(dǎo)致這種結(jié)果的原因較多，因此擬從樣品前處理溶劑、加熱時間、比色波長等逐一進行優(yōu)化。

2.2樣品前處理溶劑的優(yōu)化

有研究表明，甲醇作為溶劑可參與變色反應(yīng)[15-16]，那么在制備三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液時所用的甲醇溶劑是否也參與了變色反應(yīng)，從而干擾了試驗結(jié)果，導(dǎo)致方法2制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相

關(guān)系數(shù)較低？為排除這一可能干擾，本研究分別以各100 μL甲醇、乙醇、叔丁醇為樣液，用方法2分別測定其吸光度。圖3結(jié)果表明，3種溶劑確實在570 nm波長下檢測時都存在吸收峰，即它們均有可能參與顯色反應(yīng)，從而對測定三尖杉堿含量的結(jié)果造成干擾。

為排除溶劑干擾影響試驗準(zhǔn)確性的問題，本研究擬在正常制備三尖杉標(biāo)準(zhǔn)溶液后，增加1個試驗步驟，即對于制備好的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液首先通過通風(fēng)揮發(fā)干其溶劑甲醇，再繼續(xù)用方法2制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，揮發(fā)干甲醇溶劑后所建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r由原來的0.931 0提高到0.999 7，經(jīng)方差分析，兩者差異達到顯著水平（P<0.05）。

2.3最佳微波加熱時間的確定

方法2中的微波加熱時間即為有色化合物的顯色時間，加熱時間過短，顯色反應(yīng)不充分，時間過長，又會出現(xiàn)炭化反應(yīng)[13]，因而本試驗擬對方法3的微波加熱時間進行篩選。試驗設(shè)定微波加熱功率為1 200 W，微波加熱時間分別設(shè)0、10、15、25、30、35、40[JP3]、45、50、55、60 s，共11個處理。取 2 000 μg/mL

三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，揮發(fā)干甲醇后，用方法2比較不同加熱時間測得的D570 nm變化。

圖5結(jié)果表明，隨著加熱時間的增加，D570 nm也隨之提高，但不同時間段D570 nm提高的幅度并不一致；大致變化趨勢表現(xiàn)為在加熱0～10 s范圍內(nèi)，D570 nm緩慢提高；在10～30 s范圍內(nèi)，D570 nm快速提高；30 s后D570 nm增幅則逐漸趨于平穩(wěn)。經(jīng)Logistic方程擬合發(fā)現(xiàn)，加熱22 s時，D570 nm達最大值的50%；加熱35 s時，D570 nm則已達最大D570 nm的80%；而當(dāng)加熱時間超過40 s后，反應(yīng)體系出現(xiàn)了炭化反應(yīng)，即有黑色顆粒物生成，從而導(dǎo)致測得的D570 nm比實際值增大。綜上，最終確定測定三尖杉堿時最佳的微波加熱時間為35 s。

2.4最佳檢測波長的確定

隨著反應(yīng)體系中溶劑的種類、濃度及樣品溶液成分的改變，都會導(dǎo)致吸光度變化，最佳檢測波長也會隨之發(fā)生變化[8]。本試驗擬對方法3的最佳檢測波長進行篩選，吸取100 μL 2 000 μg/mL三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，通風(fēng)揮發(fā)干甲醇后，用方法2在400～800 nm波長范圍內(nèi)連續(xù)掃描測定有色化合物的吸光度。結(jié)果表明：在400～558 nm范圍內(nèi)，隨著檢測波長增大，測得的吸光度也隨之增加；當(dāng)波長超過558 nm后，隨著波長的增大，吸光度反而減小，即方法3反應(yīng)獲得的有色化合物在波長558 nm處有最大吸收峰（圖6）。

2.5方法3的確定

取適量供試樣品溶液，放入50 mL燒杯中，揮發(fā)干樣品溶液中的甲醇溶劑后，加新配制的300 μL 0.1 g/mL變色酸溶液，再加入3 mL 86%濃磷酸、70 μL 0.025 mol/L過氧化氫，搖勻，于1 200 W微波爐中加熱35 s，取出后加3 mL蒸餾水搖勻，室溫下冷卻，最后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶加水定容，于558 nm處比色。其中三尖杉堿的檢測線性范圍為0～20 μg/mL。

2.6方法3的檢驗

2.6.1方法3制作三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗由方法3制作的三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）的回歸方程為y=0.018 4x，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，達到顯著水平（P<0.05）。說明在0～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，三尖杉堿的濃度與方法3測得的吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以通過該比色方法測定樣品中三尖杉堿含量。

2.6.2方法3的重復(fù)性檢驗用方法3對2 000 μg/mL三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進行6次重復(fù)測定。由表1可見，6次重復(fù)測定的D570 nm變化范圍為0.423 7～0.433 6，平均D2.6.3方法3的標(biāo)樣回收率檢驗用方法3分別測定已知含堿量的樣液及添加標(biāo)樣后的樣液，通過計算標(biāo)樣回收率檢驗方法3的準(zhǔn)確性，試驗設(shè)3次重復(fù)。具體試驗步驟：取已知含堿量的海南粗榧嫩枝和葉片樣品溶液各20 μL，分別添加 25 μL 1 000 μg/mL三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，用方法3測定其D570 nm并計算標(biāo)樣回收率。結(jié)果表明，方法3測得的海南粗榧嫩枝、葉片樣品中的標(biāo)樣平均回收率分別為106.86%、98.85%，RSD分別為3.31%、4.78%，說明方法3的系統(tǒng)誤差較小，符合試驗要求。

2.6.4方法3的有色化合物穩(wěn)定性檢驗將方法3反應(yīng)獲得的有色化合物放置不同時間后再比色測定吸光度，檢驗方法3反應(yīng)獲得有色化合物的穩(wěn)定性。本試驗分別以 2 000 μg/mL 三尖杉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液、海南粗榧嫩枝、葉片提取液為試樣，用方法3反應(yīng)生成有色化合物，分別在常溫下放置1、2、4、6、8、12、24 h后測定其吸光度D570 nm，試驗設(shè)3次重復(fù)。由表2可知，3種樣品反應(yīng)的有色化合物在放置不同時間后測得的D570 nm的RSD分別為1.61%、1.23%、1.28%，反應(yīng)絡(luò)合物基本穩(wěn)定。說明用方法3測定三尖杉堿時獲得的有色化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定性很好。

2.6.5方法3與方法1測定結(jié)果的比較以海南粗榧的嫩枝、葉片提取液為試驗材料，分別用方法1、方法3測定其生物堿總堿含量。由圖8可見，用方法1測得的嫩枝、葉片的生物堿含量分別為0.281 1%、0.350 3%，用方法3測得的嫩枝、葉片的生物堿含量分別為0.242 4%、0.267 4%，由此可知，方法3測得的D570 nm均比方法1的低，但經(jīng)方差分析，2種方法測的結(jié)果差異并不顯著，說明方法3、方法1均可用于測定海南粗榧生物堿總堿含量。

[TP王峰8.tif]

3討論與結(jié)論

三尖杉生物堿僅存于三尖杉科植物中，由Wall等于1954年首次發(fā)現(xiàn)[17]，我國于20世紀(jì)70年代起開展相關(guān)研究，并利用濃硫酸處理檢測甲醛方法對國內(nèi)不同種三尖杉植物中的三尖杉總堿含量進行了系統(tǒng)檢測，結(jié)果表明：三尖杉生物堿總堿含量在0.1%～0.4%范圍內(nèi)[18]，這與本試驗用磷酸處理的變色反應(yīng)檢測結(jié)果一致。三尖杉生物堿總堿的含量隨著產(chǎn)地、植株年齡等變化，并且隨著誘導(dǎo)方法的不同有變化[19]?？焖勹b定三尖杉生物堿的含量對于評估收獲時期、誘導(dǎo)效果有重要意義。

Eegriwe于1937年建立了用變色酸光度法測定甲醛含量的方法[20]，該方法被不斷優(yōu)化并廣泛應(yīng)用于食品、化工、環(huán)境中甲醛含量的測定[21-22]，并且該方法還進一步被用于其他結(jié)構(gòu)中含有亞甲二氧基化合物的測定[23]。由于海南粗榧生物堿總堿均含有亞甲二氧基結(jié)構(gòu)，本研究參考優(yōu)化測定甲醛的方法，建立了測定海南粗榧生物堿總堿的方法，該方法準(zhǔn)確、快捷、安全，并且與傳統(tǒng)方法相比可取得一致的結(jié)果。

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