母豬流行性腹瀉返飼后免疫應(yīng)答評估

簡義虎，李潤成，胡仕鳳，葛 猛，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 湖南 長沙 410128）

母豬流行性腹瀉返飼后免疫應(yīng)答評估

簡義虎，李潤成，胡仕鳳，葛 猛，余興龍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 湖南 長沙 410128）

當(dāng)前，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）流行廣、危害嚴(yán)重。除進(jìn)行疫苗免疫工作外，返飼常常做為豬場控制豬流行性腹瀉的重要手段。筆者用6頭育肥后期豬模擬母豬返飼（攻毒）實(shí)驗(yàn)，研究母豬返飼后排毒情況與血清抗體消長變化，來探究母豬返飼最佳時(shí)機(jī)以及如何避免返飼帶來的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明，試驗(yàn)豬在返飼后第2、3天相繼發(fā)生腹瀉并檢測到PEDV，在返飼后11 d豬血清中IgG抗體明顯上升,并在攻毒后第20天IgA與IgG檢測值均達(dá)到峰值,在攻毒后第15天唾液與糞便均檢測不到病毒。說明，生產(chǎn)上在產(chǎn)前15 d到30 d之間返飼效果較好，病毒感染仔豬的風(fēng)險(xiǎn)最低。為臨床防控該病提供理論依據(jù)。

母豬；流行性腹瀉；返飼

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病具有極高的感染性，可引起豬群發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉，特別是7日齡以內(nèi)哺乳仔豬，致死率極高[1]。本病雖多發(fā)生于寒冷季節(jié)，但在夏季也存在感染發(fā)病的情況[2]。該病已經(jīng)被加拿大、亞洲、及其他歐洲國家報(bào)道,2013在美國也報(bào)道過該疾病，并在一年的時(shí)間里對美國的養(yǎng)豬業(yè)造成高達(dá)9億～18億美元的經(jīng)濟(jì)損失[3]。對于PED防治問題，仍然困擾著國內(nèi)大多數(shù)豬場,現(xiàn)市場上對于防治PED的疫苗雖有很多,但是PEDV還是出現(xiàn)于免疫豬群中,說明疫苗免疫保護(hù)效果不佳。特別在2010年以后我國PED的發(fā)病趨勢更加嚴(yán)重,不同階段的豬群均出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐與脫水,部分豬場初生仔豬的死亡率高達(dá)100%,對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要診斷試劑

PEDV檢測膠體金購自Bionovet公司；RNA提取試紙盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試紙盒購自美國Thermo Scientfic；PCR MIX購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。檢測引物見參考文獻(xiàn)[2]，引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 樣品

收集攻毒后實(shí)驗(yàn)豬的腹瀉糞便與唾液，以及攻毒前后攻毒豬血清。

1.2 方法

1.2.1 返飼及采樣方案

1）返飼前病料處理：取PEDV陽性初生仔豬腸道以及內(nèi)容物300 g，經(jīng)病原檢測無豬瘟、豬偽狂犬和藍(lán)耳病病原后，加入300 mL含青鏈霉素各60萬單位的生理鹽水，用組織搗碎機(jī)勻漿，取1 mL勻漿后的病料于-80 ℃保存，配合熒光定量PCR[5]測定返飼病料中病毒的拷貝數(shù)，返飼病料及時(shí)保存于4 ℃，并在1 h內(nèi)進(jìn)行返飼。

2）返飼：豬舍提前3 d徹底消毒，并用大量清水將豬舍沖洗干凈，為了促進(jìn)豬發(fā)生腹瀉，在生豬運(yùn)輸前不控料、運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后馬上進(jìn)行返飼，并且不進(jìn)行控料和胃腸功能調(diào)理工作。用保定繩對豬上顎進(jìn)行保定，并抬高豬的頭部，每頭豬緩慢灌服100 mL返飼病料，灌服時(shí)不斷輕輕揉捏豬喉頭，加快豬的吞咽動(dòng)作避免浪費(fèi)。

3）返飼后飼養(yǎng)管理：6頭豬分為3欄飼喂（欄舍寬2 m，長2.5 m），攻毒期間打開豬舍內(nèi)兩個(gè)吊扇（美的牌屋頂式吊扇調(diào)至最高檔），返飼期間氣溫為19～25 ℃，返飼后每天早上8點(diǎn)到夜晚10點(diǎn)，每隔3 h用冷水沖洗豬舍與豬臀部，返飼后第4天停止對豬與豬舍涼水沖洗，并關(guān)閉豬舍內(nèi)的吊扇。腹瀉期間讓豬只自由采食，腹瀉第2天在飼料中添加適量的紅糖與食用鹽，腹瀉好轉(zhuǎn)后每天分2次飼喂，并停止使用紅糖與食用鹽，攻毒后第6天給生豬飼喂含益生菌的飼料添加劑，調(diào)節(jié)胃腸道功能。

4）樣本采集：腹瀉期間每隔3 h收集一次腹瀉糞便并做好標(biāo)記，腹瀉好轉(zhuǎn)后每隔7 d收集一次糞便和肛門拭子，并用唾液收集條采集唾液，樣本收集后全部保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 病原檢測

1)將攻毒后生豬第一次腹瀉的糞便進(jìn)行收集，并用韓國金諾生產(chǎn)的膠體金PEDV檢測試劑盒按說明書進(jìn)行檢測；

2)將攻毒后第3天與第6天6頭豬腹瀉糞便，以及攻毒后第15天6頭豬的唾液與肛門拭子。分別按照RNA提取試劑盒與RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，采用RT-PCR方法檢測PEDV，同時(shí)對攻毒后第3天的腹瀉樣品用熒光定量PCR測定病毒的CT值與拷貝數(shù)。

1.2.3 血清抗體檢測

攻毒后每隔4～7 d對豬耳緣靜脈采集一次血清，將采集的血清按本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[6]，進(jìn)行PEDV IgG、IgA抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 攻毒后第一次腹瀉糞便PEDV膠體金檢測結(jié)果

在攻毒后第2天有5頭豬發(fā)生腹瀉，第3天6頭豬全部發(fā)生腹瀉，取攻毒后第一頭腹瀉豬的糞便進(jìn)行PEDV檢測，結(jié)果在膠體金的質(zhì)控帶與檢測帶都出現(xiàn)了陽性條帶，說明攻毒后第1頭腹瀉豬的糞便為PED陽性，部分檢測結(jié)果見圖1。

2.2 攻毒后第3天腹瀉糞便PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

分別采取6頭豬攻毒后第3天的排泄物，經(jīng)RT-PCR （30循環(huán)）檢測，各個(gè)樣品在477 bp處均有一條特異性條帶，說明6份樣本PEDV檢測均為陽性（圖2），攻毒后第6天的腹瀉糞便檢測帶信號稍弱一些，攻毒后第15天收集的唾液與糞便棉簽PEDV全陰性。

由圖1的結(jié)果可知，在第1頭腹瀉豬的糞便中可檢測到PEDV，故在圖2中沒有設(shè)置陽性對照樣品，攻毒后第3天豬腹瀉糞便經(jīng)RT-PCR檢測中條帶很亮，可以說明6頭豬已全部感染PEDV并出現(xiàn)排毒；而攻毒后第15天的唾液與糞便棉簽檢測全陰，說明6頭豬體內(nèi)已無PEDV。

2.3 返飼病料與部分腹瀉樣品熒光定量PCR檢測結(jié)果

利用熒光定量PCR檢測技術(shù)，分別對返飼病料與攻毒后第3天6頭豬的腹瀉糞便進(jìn)行檢測，其病毒檢測的CT值與拷貝數(shù)如表1所示。

2.4 血清抗體IgA、IgG檢測結(jié)果

將攻毒前后6頭豬所采集血清分別進(jìn)行PED抗體檢測,并求出血清中IgA與IgG平均 OD值，結(jié)果見表2、圖3。由表2和圖3可見在攻毒后11 d豬血清中IgG抗體明顯上升,并在攻毒后第20天IgA與IgG檢測值均達(dá)到峰值。

3 分析與討論

國外豬場在發(fā)生PED時(shí)，通常采用返飼技術(shù)控制了疫情，例如美國在2013年暴發(fā)PED，就是采取返飼措施及時(shí)控制了疾病[7]，而國內(nèi)豬場很少有成功利用返飼的案例，可能主要有2個(gè)方面原因的影響，一方面說明部分豬場在返飼的技術(shù)上缺乏正確的指導(dǎo)方案；另一方面暗示著部分豬場擔(dān)憂返飼的安全性。

目前國內(nèi)雖有上市的PEDV弱毒疫苗，但是效果仍在觀察中，并且不能口服免疫，在這種情況下，返飼可作為一種選擇。國外也有學(xué)者研究PEDV的攻毒實(shí)驗(yàn)，例如：在De Arriba ML PEDV接種試驗(yàn)中，仔豬的腹瀉持續(xù)時(shí)間平均時(shí)間為1.7 d，持續(xù)排毒時(shí)間平均為5.4 d[8]。由于本試驗(yàn)為了模擬寒冷的天氣，對攻毒豬采取了沖涼水與風(fēng)扇降溫，從而使本試驗(yàn)豬腹瀉時(shí)間比De Arriba M L接種PEDV的試驗(yàn)豬要長，根據(jù)各個(gè)豬場飼養(yǎng)管理的不同,腹瀉持續(xù)時(shí)間不等,一般在腹瀉一周以內(nèi)逐漸好轉(zhuǎn)[9]。臨床上在促進(jìn)豬群同期感染后，還需采取適當(dāng)措施避免腹瀉過度，例如對母豬返飼后，可通過加強(qiáng)隔離與消毒，改善環(huán)境溫度與控制飼喂量，以及在飼料中添加一些微生態(tài)制劑，可以縮短母豬腹瀉與排毒時(shí)間，并且同樣能達(dá)到返飼效果。

圖2 攻毒后6頭豬第3天的排泄物RT-PCR檢測結(jié)果

表1 檢測返飼病料與攻毒后第3天腹瀉糞便的病毒CT值與拷貝數(shù)

表2 攻毒前后血清抗體檢測平均OD值

圖3 表2中數(shù)據(jù)對應(yīng)的矩形圖

由于試驗(yàn)動(dòng)物是育肥后期豬，每次沖水就有豬站立排糞，能清楚的記錄腹瀉時(shí)間與對應(yīng)豬編號，使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。雖然本試驗(yàn)不能確定母豬攻毒后第幾天停止排毒，但是可以明確母豬在攻毒后臨床表現(xiàn)腹瀉癥狀時(shí)，就開始向外界排毒，并且在攻毒后15 d的唾液與糞便中無PEDV。然而臨床上攻毒15 d后，對攻毒豬仍然不能掉以輕心，在4 ℃ pH=5～9的條件下，PEDV可在污染的泥土中至少存活28 d[10]，由表1可知，返飼后第3天腹瀉糞便中病毒的拷貝數(shù)與返飼病料相當(dāng)，說明豬舍環(huán)境中可能有大量病毒粒子的存在，為了防止PEDV在豬場的傳播，母豬在攻毒后需對豬只體表與豬舍加強(qiáng)消毒，及時(shí)處理腹瀉糞便，可以降低病毒感染其他豬群的風(fēng)險(xiǎn)。

由圖3可知﹕母豬在攻毒后抗體在11～30 d，血清中IgA與IgG的抗體滴度維持在較高的水平，結(jié)合試驗(yàn)豬攻毒后第15天排泄物病原檢測結(jié)果。對于母豬的返飼工作，可在其妊娠期的84到99 d之間進(jìn)行返飼，尤其是對于一些正在發(fā)生PED的豬場，可對所有處于產(chǎn)前15 ～30 d的妊娠母豬進(jìn)行返飼，能夠及時(shí)地減少損失。這一觀點(diǎn)也與Olanratmanee E[11]得出的結(jié)果相符合，用7 201頭母豬在產(chǎn)前不同時(shí)期進(jìn)行返飼，其中返飼對妊娠61～90 d母豬的流產(chǎn)率最低。

劉秋菊[6]用16頭60日齡左右的仔豬做攻毒試驗(yàn)中，仔豬IgG抗體在攻毒后第16天達(dá)到最高，其檢測OD均值為1.0左右。根據(jù)圖3所示，在攻毒后第42天母豬的血清IgG抗體OD均值為0.98，盡管在PEDV防治措施中，主要靠腸道的黏膜免疫（IgA抗體），但初乳中若含有較高滴度的IgG抗體，對仔豬同樣具有保護(hù)作用[12]，由此推出：母豬在返飼后的第11～42天，初乳中的抗體對哺乳仔豬有一定的保護(hù)作用，為了延長返飼后抗體保護(hù)時(shí)間，可在返飼后30～42 d進(jìn)行組織滅活苗的加強(qiáng)免疫。

在過去的十年里，泰國也推薦利用返飼來撲滅商業(yè)豬群暴發(fā)的PED[11]。返飼是一把雙刃刀，并不是所有場都適合返飼，必需在配合實(shí)驗(yàn)室檢測的條件下，確定返飼病料中無豬瘟、偽狂犬與豬藍(lán)耳病病原，才可利用返飼控制PED在本場的流行。

[1] LI Z L,ZHU L, MA J Y, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[2] 簡義虎.胡仕鳳.李潤成,等.湖南省豬流行性腹瀉發(fā)病情況分析[J]. 豬業(yè)科學(xué),2016,33,(11)﹕76-77.

[3] LANGEL S N,PAIM F C,LAGER K M,et al.Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)﹕ Historical And Current Concepts[J]. Virus research, 2016,226﹕93-107.

[4] LI Z L,ZHU L,MA J Y,et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China[J]. Virus genes, 2012, 45(1)﹕ 181-185.

[5] 張?zhí)锷?豬流行性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ和Taq-Man熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D] .南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[6] 劉秋菊. 豬流行性腹瀉病毒IgG、IgA抗體檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[7] 本刊編輯.加拿大豬流行性腹瀉生物安全控制的關(guān)鍵措施[J].豬業(yè)科學(xué),2014,31(4)﹕29.

[8] DE ARRIBA M L, CARVAJAL A, POZO J, et al. Lymphoproliferative responses and protection in conventional piglets inoculated orally with virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus[J]. Journal of virological methods, 2002, 105(1)﹕ 37-47.

[9] WANG X, NIU B, YAN H, et al. Genetic properties of endemic Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains isolated since 2010[J]. Archives of virology, 2013, 158(12)﹕ 2487-2494.

[10] JUNG K, SAIF L J. Porcine epidemic diarrhea virus infection﹕ Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis[J]. The Veterinary Journal, 2015, 204(2)﹕ 134-143.

[11] O L A N R A T M A N E E E, KUNAVONGKRIT A, TUMMARUK P.Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows[J]. Animal reproduction science, 2010,122(1)﹕ 42-51.

[12] [美]齊默爾曼（Jeffrey J.Zimmerman）等主編，趙德明等主譯.豬病學(xué)[M].10版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014：531.

2017-03-03)

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目，編號2016GK4015

簡義虎(1989—)，男，河南信陽人，碩士研究生，1519780050@qq.com；

*通信作者：余興龍，男，教授，博導(dǎo)，研究方向：畜禽疫病防治，E-mail: 1364263406@qq.com