育肥豬真桿菌的分離與鑒定

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036）

育肥豬真桿菌的分離與鑒定

張乃嘉，胡 楨，吳華鍵，李 郁*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036）

本試驗(yàn)系對(duì)自安徽某豬場(chǎng)發(fā)病育肥豬膿腫脾臟中分離的一株細(xì)菌，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)檢查，致病性和藥物敏感性試驗(yàn)，以及16SrRNA基因的擴(kuò)增和序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離菌為革蘭氏陽性短桿狀菌，在兔血瓊脂平板和牛血清胰蛋白胨大豆瓊脂平板有氧條件下生長(zhǎng)良好，可致小鼠死亡，對(duì)頭孢類抗生素和喹諾酮類抗菌藥敏感，16SrRNA基因序列與豬真桿菌屬細(xì)菌的同源性最高，在91.2%～99.4%之間，遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，與豬真桿菌屬細(xì)菌屬于同一分類群。結(jié)果表明，分離菌為豬真桿菌。

豬真桿菌；分離培養(yǎng)；生化反應(yīng)；16SrRNA；鑒定

棒狀桿菌屬(Corynebacterium)菌廣泛分布于自然界，多數(shù)為非病原菌，只有少數(shù)有病原性，能引起人和動(dòng)物的急性和慢性傳染病。由于棒狀桿菌的種類不同，各種動(dòng)物和人的臨診表現(xiàn)也不完全相同，但一般以某些組織和器官發(fā)生化膿或干酪樣的病理變化為特征。

豬棒狀桿菌病是由豬棒狀桿菌（Corynebacterium suis），現(xiàn)歸入真桿菌屬（Genus Eubacterium ）改稱豬真桿菌（Eubacterium suis）引起的疾病，主要引起豬的膀胱炎和腎盂腎炎，有的還引起豬的化膿性肺炎、支氣管炎、子宮內(nèi)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、仔豬臍炎、皮下膿腫和乳腺膿腫等。豬真桿菌病遍布于世界各國(guó)，一年四季均可發(fā)生，雖然發(fā)病率較低，只引起小規(guī)模和個(gè)別的豬發(fā)病，但病原菌卻可在任何豬群中存在、也可在豬體各部位廣泛存在。我國(guó)也有該病的發(fā)生，但相關(guān)的報(bào)道甚少。

2016年7月，安徽某豬場(chǎng)150～160日齡的育肥豬發(fā)病，臨診表現(xiàn)為腹部皮膚發(fā)紺，體溫高達(dá)41 ℃，有呼吸道癥狀，排黃色稀便，并伴有血尿癥，發(fā)病率為10%，病死率達(dá)30%。剖解后可見心臟出血，心內(nèi)膜潮紅，肺臟出血，脾臟腫大呈深褐色，肝臟有出血點(diǎn)，腎臟腫大呈暗紅色，被膜下有細(xì)小的黃白色化膿灶，腸壁出血，全身淋巴結(jié)腫大出血，膀胱壁增厚。通過對(duì)病原的分離鑒定和致病性試驗(yàn)，確定該豬場(chǎng)有豬真桿菌感染，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物，試驗(yàn)結(jié)果不僅為豬真桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查，而且為豬場(chǎng)防治豬真桿菌病菌提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

采自安徽某豬場(chǎng)病死育肥豬（150～160日齡）的內(nèi)臟器官。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)于紹興天恒生物科技有限公司，用于配制5%兔鮮血瓊脂平板、5%牛血清TSA平板和添加0.5%瓊脂的TSB半固體培養(yǎng)基；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、鼠李糖、半乳糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、棉籽糖、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、七葉苷、靛基質(zhì)、硝酸還原、VP-MR、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶生化發(fā)酵管、抗生素藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青有限公司；DNA Marker DL2000、2×Taq plus PCR MasterMix、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖均購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)18～22 g雌性昆明小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 細(xì)菌的分離純化

無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線接種于兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清），37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落性狀。挑取可疑菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)，并接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、EMB、MAC、TSA平板（不加血清）、TSB肉湯（加5%血清）和TSB肉湯（不加血清）中，進(jìn)行培養(yǎng)特性鑒定。取純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢，挑取單菌落垂直穿刺接種TSB半固體培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.5 生化鑒定

將分離純化的細(xì)菌接種到含5%小牛血清的TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，取菌液接種微量生化反應(yīng)管，于37 ℃培養(yǎng)24～96 h，觀察記錄結(jié)果。

1.6 致病性試驗(yàn)

將分離純化的細(xì)菌用TSB肉湯（加5%血清）增菌培養(yǎng)24 h，取0.5 mL腹腔注射小鼠5只為試驗(yàn)組，另取5只小鼠腹腔注射等量TSB（加5%血清）為對(duì)照組。在適宜條件下隔離飼養(yǎng)，觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。無菌采集對(duì)照組小鼠和病死小鼠肝臟、肺臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線接種兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清），于37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)菌分離，并將新分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序比對(duì)。

1.7 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌16SrRNA通用引物合成擴(kuò)增引物。上游引物P1﹕5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'；下游引物P 2﹕5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 500 bp。

表1 25株豬真桿菌參考菌株的名稱與來源

表2 分離菌的生化鑒定結(jié)果

將分離純化細(xì)菌按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：總體積25μL，包括12.5μL 2×Taq plus PCR MasterMix，上下游引物(20μmol/L)各1μL，5μL模板DNA，5.5μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃2 min，共35次循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在紫外燈下觀察，用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。切膠回收陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)定的序列結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站中BLAST界面，與其基因庫(kù)中所有序列進(jìn)行相似性比對(duì)，再應(yīng)用DNAStar軟件中的MegAlign程序與GenBank登錄的豬真桿菌屬中25個(gè)不同種的菌株（表1）的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.8 藥物敏感試驗(yàn)

選用臨床上常用的頭孢類（頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢噻肟）、氨基糖苷類（丁胺卡那、新霉素、卡那霉素、大觀霉素）、喹諾酮類（氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星）、青霉素類（氨芐西林、青霉素）、磺胺類（甲氧氨芐嘧啶、復(fù)方新諾明）和林可胺類（林可霉素）等21種抗生素藥物，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI/ NCCLS)2010版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離純化

在兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清）上，自病豬脾臟組織分離獲得一株細(xì)菌。

2.2 分離菌的培養(yǎng)特性

分離菌在兔血瓊脂平板和TSA平板（加5%血清）上形成滴露樣黃色細(xì)小菌落，光滑、圓潤(rùn)、半透明，不完全溶血；在加血清的TSB中培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)良好，呈均勻渾濁，無沉淀和菌膜形成；在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、不加血清的TSA和TSB、EMB、MAC上不生長(zhǎng)。顯示該分離菌的生長(zhǎng)需要血液或血清。

2.3 分離菌的形態(tài)特性

分離菌革蘭染色陽性，形態(tài)多樣，菌體直或微彎，大多為一端或兩端膨大的桿狀，單在或成柵狀或成叢排列，無芽胞，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。

2.4 分離菌的生化特性

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，此分離菌能發(fā)酵蔗糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖;不能發(fā)酵棉籽糖、蕈糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖;靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫、硝酸鹽還原、M R－VP試驗(yàn)為陰性、不能與尿素、馬尿酸、七葉苷發(fā)生反應(yīng);不能利用枸櫞酸鈉;接觸酶陰性。見表2。

2.5 分離菌的致病性鑒定

試驗(yàn)組小鼠在攻毒14 h左右開始出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩并伴有腹式呼吸的癥狀，其中4只小鼠于30 h內(nèi)死亡，1只存活；對(duì)照組小鼠均健活。剖檢小鼠分離細(xì)菌，對(duì)照組各內(nèi)臟器官均沒有細(xì)菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)組自肝臟組織中獲得細(xì)菌，經(jīng)PCR檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)，證實(shí)分離菌為試驗(yàn)攻毒菌。

2.6 16SrRNA基因的擴(kuò)增及基因同源性分析

以提取的分離菌基因組為模板，用16SrRNA上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出一條約1 500 bp的條帶，見圖1。

同源性分析結(jié)果顯示，分離菌與25株豬真桿菌參考菌株的同源性在91.2%～99.4%之間（表3），與C.amycolatum CIP103452同源性達(dá)99.4%；在建立的遺傳進(jìn)化樹中，分離株與25株豬真桿菌參考菌株位于同一大的分支上，其中與C.amycolatum CIP103452位于同一個(gè)小分支上，遺傳關(guān)系最為親密（圖2）；確定本次分離菌為豬真桿菌，并命名為FN株。

2.7 分離菌的藥物敏感性

圖1 分離菌株 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

表3 16SrRNA基因序列同源性分析%

圖2 基于16Sr R NA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

分離菌對(duì)丁胺卡那、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、恩諾沙星、頭孢噻肟等10種藥物敏感；對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、新霉素等3種藥物中度敏感；對(duì)卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、甲氧氨芐嘧啶、復(fù)方新諾明等其他8種藥物均耐藥。

3 討論

棒狀桿菌廣泛分布于動(dòng)物機(jī)體、環(huán)境、水體和食品等中，屬于條件致病性病原菌。報(bào)道顯示，多種醫(yī)學(xué)相關(guān)的棒狀桿菌都是人類皮膚常在菌群之一，其中部分棒狀桿菌具有廣泛的耐藥性，并且能引起嚴(yán)重的乃至致命性疾病，尤其對(duì)免疫抑制的病人危害更重。因此，對(duì)棒狀桿菌致病性的研究越來越引起廣泛關(guān)注[1]。豬棒狀桿菌即豬真桿菌是定殖于上呼吸道、生殖道的常在菌，約有80%健康豬正常帶菌，正常情況下并不會(huì)引起豬體發(fā)病，但在母豬生產(chǎn)時(shí)，由于胎兒的擠壓或人工助產(chǎn)則易導(dǎo)致生殖道黏膜損傷，定殖的豬真桿菌即可在受損黏膜處大量繁殖并分泌毒素從而引發(fā)炎癥。所以引起豬的真桿菌病主要集中在生殖道和呼吸道，由這些部位分離到真桿菌均有相關(guān)報(bào)道[1-3]，而從其他部位分離到豬真桿菌的則尚未見報(bào)道。此外當(dāng)機(jī)體抵抗力下降，或感染豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等免疫抑制性疾病病原，或黏膜損傷后，也容易繼發(fā)感染細(xì)菌。棒狀桿菌能引起犢牛、綿羊、波爾山羊、廣西黑山羊、豬、柴達(dá)木雙峰駝、林麝、鼠等多種動(dòng)物發(fā)病，導(dǎo)致發(fā)病動(dòng)物肺臟大面積肉變并形成化膿結(jié)節(jié)灶，肺門淋巴結(jié)水腫，脾臟表面有出血點(diǎn)，肝臟腫大，腎臟表面大量出血[4-7]。

本試驗(yàn)針對(duì)安徽某豬場(chǎng)150～160日齡育肥豬出現(xiàn)的病情，首先進(jìn)行發(fā)病情況的了解、臨診癥狀和病理變化的觀察，然后采取病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、相關(guān)病毒檢測(cè)，利用形態(tài)與染色、培養(yǎng)與生化特性、動(dòng)物致病性試驗(yàn)等常規(guī)病原菌鑒定方法，最終通過16SrRNA基因的擴(kuò)增及基因同源性分析，確定該發(fā)病育肥豬的病原菌為豬真桿菌，尤其值得關(guān)注的是病原分離菌源自脾臟組織。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法項(xiàng)目繁多且持續(xù)周期長(zhǎng)，常不能滿足獸醫(yī)臨床對(duì)疾病診斷和病原鑒定的快速需求，而PCR技術(shù)則因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)得到了廣泛應(yīng)用。16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中，其保守區(qū)能反映生物物種的親緣關(guān)系，可變區(qū)具有揭示生物物種的核酸序列特征。目前16SrRNA序列分析是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類學(xué)研究中較精確的一種技術(shù)，16SrRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。

篩選出丁胺卡那、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、恩諾沙星、頭孢噻肟等10種抗菌藥物，可作為本次育肥豬真桿菌感染的首選治療藥物，可見該分離菌主要對(duì)頭孢類和喹諾酮類敏感，這與已報(bào)道的廣西株（1999年）[2]、四川SCYAN1株（2010年）[5]、廣西GX-A株（2016年）[8]等的藥敏結(jié)果不完全一致，顯示出時(shí)間上和地域性差異。不同地區(qū)、不同養(yǎng)豬場(chǎng)，即使同一養(yǎng)豬場(chǎng)在不同的時(shí)間，其用藥方法都會(huì)存在一定的區(qū)別，從而導(dǎo)致豬真桿菌分離菌對(duì)藥物敏感性的不同。此外，已有報(bào)道，一些地區(qū)雖然根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選出多種高敏的抗豬真桿菌藥物，但對(duì)感染后期患豬的治療效果卻不佳，原因是豬真桿菌在感染部位形成了厚包囊，導(dǎo)致藥物不能進(jìn)入抑制或殺滅細(xì)菌。因此，對(duì)于豬真桿菌感染的防治，一是要早治療，二是要對(duì)尚未出現(xiàn)癥狀的豬群進(jìn)行藥物預(yù)防，才能達(dá)到有效的防治效果。通過病因確定、防治方案制定與實(shí)施，安徽某豬場(chǎng)育肥豬群的病情得到了有效控制并轉(zhuǎn)歸。

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2017-03-15）

國(guó)家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014GA710002)；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目(2013sxzx008)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(XJ2015093)；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)體系基金

張乃嘉(1991-), 女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究

*通信作者：E-mail：liyouer@163.com