豬病毒性腹瀉的診斷和檢測(cè)技術(shù)研究

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510640）

診斷與檢測(cè)

豬病毒性腹瀉的診斷和檢測(cè)技術(shù)研究

蘇丹萍，王 飛，賀東生

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510640）

豬病毒性腹瀉類(lèi)疾病是豬場(chǎng)常見(jiàn)疾病，目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最大的一類(lèi)疾病之一。腹瀉一般有明顯的季節(jié)性，尤其在秋冬、冬春換季，天氣驟變時(shí)易發(fā)且流行速度快。主要通過(guò)消化道及呼吸道進(jìn)行感染，隨后誘發(fā)全群豬腹瀉。幾種病原混合感染比較常見(jiàn)，各年齡段的豬均可發(fā)病，發(fā)病后的死亡率與年齡密切相關(guān)，日齡越小，病程越短，死亡率越高，其對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。本文介紹該類(lèi)疾病的可能病因、鑒別診斷方法和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

病毒性腹瀉 ；鑒別診斷；檢測(cè)技術(shù)

豬病毒性腹瀉的病原目前主要有豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬丁型冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（RV）、豬博卡病毒（PBoV）等，均可導(dǎo)致豬發(fā)病，以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，仔豬的發(fā)病率和死亡率可高達(dá)50%～100%。另外豬的偽狂犬病毒（Pseudorabies，PRV）、圓環(huán)病毒、大腸桿菌和溫和型豬瘟病毒（classical swine fever，CSFV）也可以引起仔豬腹瀉，這需要我們逐一細(xì)致地分析病因，通過(guò)流行病學(xué)、臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行綜合診斷。

1 病毒性腹瀉的臨床診斷

從臨床診斷上看，PEDV、TGEV、PDCov、RV、PBoV的癥狀比較相似，難以區(qū)分。但是PRV和CSFV與另外幾種病毒性腹瀉存在一定的區(qū)別。

1.1 PEDV、TGEV、PDCov

這3種疾病的病原都屬于冠狀病毒科，病毒特性、病豬發(fā)病特點(diǎn)、臨床癥狀和病理變化非常相似：1至3日齡發(fā)病，一周內(nèi)病死或淘汰率可達(dá)到100%。乳豬和小豬嚴(yán)重腹瀉、水樣拉稀，部分豬有嘔吐，吃奶后發(fā)病更嚴(yán)重。部分中大豬和母豬嘔吐和腹瀉，但死亡率不高。病變一般只集中在胃腸道，胃腸黏膜菲薄、充血，腸系膜淋巴結(jié)充血。PDCov引發(fā)的病例不多，但是在國(guó)外和國(guó)內(nèi)都有單純由該病毒引起的腹瀉大暴發(fā)的病例報(bào)道。

1.2 豬偽狂犬病

感染偽狂犬病毒的發(fā)病豬會(huì)整窩發(fā)病和死亡，表現(xiàn)為突然發(fā)病，體溫上升達(dá)41 ℃以上，精神極度委頓，發(fā)抖，運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，痙攣，嘔吐，腹瀉。表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、腹瀉，一旦發(fā)病，1～2 d內(nèi)死亡。剖檢主要癥狀是腎臟布滿針尖樣出血點(diǎn)，其他肉眼病變不明顯。中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀明顯時(shí)，腦膜明顯充血，腦脊髓液量過(guò)多，肝、脾等實(shí)質(zhì)臟器?？梢?jiàn)灰白色壞死病灶，肺充血、水腫和壞死點(diǎn)。

1.3 溫和型豬瘟

感染溫和型豬瘟病毒的仔豬會(huì)先后出現(xiàn)以下癥狀：體溫升高達(dá)41 ℃，仔豬常伴有厭食、腹瀉，眼結(jié)膜潮紅發(fā)炎，皮膚發(fā)炎，共濟(jì)失調(diào)，甚至后軀麻痹，糞便由褐色變黃色，后期肛門(mén)失禁，糞便沿著后腿淌下，惡臭異常。病豬迅速消瘦，腹下部及耳根皮膚呈紫紅色淤血。病豬體溫保持在40 ℃左右，癥狀時(shí)輕時(shí)重，食欲時(shí)好時(shí)壞，糞便時(shí)干時(shí)稀。病程長(zhǎng)者皮膚出現(xiàn)淤血斑和壞死塊，以腹下部為常見(jiàn)。有時(shí)也出現(xiàn)紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病豬的皮膚一旦破損或扎針后，局部淌血不止，血液凝固不良，也是該病的特征之一。

圖1 暴發(fā)PED的病豬

圖2 豬病毒性腹瀉的現(xiàn)場(chǎng)剖檢

圖3 豬病毒性腹瀉的病變

溫和型豬瘟的病理變化主要特征性病變是胃黏膜大面積脫落、充血，腎臟不腫大，呈土黃色，可見(jiàn)大小不等的出血點(diǎn)，以針尖大小居多，脾臟腫大，色暗，表面散在有米粒大小的紫紅色突起，質(zhì)地較軟，邊緣有壞死灶，個(gè)別呈點(diǎn)狀出血，淋巴結(jié)腫脹、水腫或出血、重者出現(xiàn)化膿、壞死、潰瘍等病變，血液稀薄如水，流在地面上很少凝固，其他臟器病理變化不大。部分豬出現(xiàn)咽峽、軟腭處和扁桃腺有白色壞死點(diǎn)、出血或潰瘍，大腸回盲瓣可見(jiàn)鈕扣狀潰瘍。膽腫大，其邊緣出血，呈暗紅色。

2 病毒性腹瀉的生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

豬被PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PBoV感染后，都會(huì)出現(xiàn)嘔吐和水樣腹瀉，致使發(fā)病豬脫水、生長(zhǎng)不良、體重減輕，死淘率高達(dá) 90%以上。剖檢病變主要在小腸，可以發(fā)現(xiàn)腸壁變薄并且呈半透明狀，彈性不足，黏膜充血，腸管內(nèi)含大量液體，腸系膜淋巴結(jié)有水腫、充血等病變。胃內(nèi)充滿著白黃色的固體乳狀物，胃黏膜充血。排出的稀糞中會(huì)含有沒(méi)有完全消化的白黃色凝乳塊，具有腥臭氣味。

臨床上很難鑒別這幾種病毒病，所以鑒定需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒別診斷，通常有以下幾種檢測(cè)方法：

2.1 RT-PCR

PCR技術(shù)以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。根據(jù) Genbank中選定病毒的一個(gè)基因保守區(qū)域基因序列設(shè)計(jì)引物，合成特異引物，然后從感染病毒的糞便或腸道組織中提取總RNA，以此總RNA 為模板，用下游特異引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后在2個(gè)特異引物存在的情況下用Taq DNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，合成特異的雙鏈DNA 目的片段。對(duì)擴(kuò)增的DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)行測(cè)序分析，從而對(duì)患病動(dòng)物進(jìn)行確診。PCR能同時(shí)檢測(cè)大批量的樣品，并且能進(jìn)行活體檢測(cè)，適合于臨診診斷。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，融匯了傳統(tǒng)技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)及光譜技術(shù)高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)病毒設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針，采取含病毒多的發(fā)病豬的器官組織部位，建立Taqman實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)病毒的方法。不僅適合病毒的臨床樣品的早期檢測(cè)，也適用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制及疫苗制品的效價(jià)評(píng)估。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）診斷方法具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、高通量、無(wú)輻射、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，是當(dāng)前動(dòng)物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查等廣泛采用的免疫學(xué)診斷技術(shù)，可用于規(guī)?；i場(chǎng)大批樣品的抗體檢測(cè)?？乖簯?yīng)用推薦的毒株的病毒或相應(yīng)蛋白制備。用于制備抗原的細(xì)胞應(yīng)沒(méi)有任何其他腹瀉病毒感染?？寡澹河糜诟?jìng)爭(zhēng)或阻斷試驗(yàn)的多克隆抗血清可通過(guò)試驗(yàn)推薦的毒株來(lái)制備，單克隆抗體則可采用相應(yīng)的病毒免疫顯性蛋白直接法制備。間接法采用的抗豬免疫球蛋白試劑應(yīng)能檢測(cè)到豬IgG和IgM。根據(jù)ELISA 的基本原理，發(fā)展出了間接ELISA、Dot- ELISA、微波快速ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA 以及抗原捕獲ELISA。

2.4 免疫熒光法

采取病豬的腸道或其他組織，做成冷凍切片，進(jìn)行直接免疫熒光法檢測(cè)抗原。這個(gè)方法是活體診斷，可以迅速做出判斷?；蛘呃靡蜒兄频目共《镜鞍椎膯慰寺】贵w，采用間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了病原檢測(cè)，并與全病毒制備的抗血清進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)抗病毒蛋白單克隆抗體快速檢測(cè)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.5 免疫電鏡法

這幾種腹瀉冠狀病毒，形狀非常相似，在普通電鏡下無(wú)法區(qū)別，為此需用免疫電鏡法(IEM)。同時(shí)免疫電鏡在進(jìn)行臨床樣品或細(xì)胞培養(yǎng)樣品中病毒的血清學(xué)鑒定上顯示出了更大的優(yōu)勢(shì)。利用A蛋白和抗病毒的特異性血清包被電鏡網(wǎng)格而制作的固相免疫電鏡檢查法，能提高檢測(cè)的靈敏度，其效力至少提高100倍。此方法不單可用于發(fā)病時(shí)的診斷，也可以用于發(fā)病的潛伏期診斷。

2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一條具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程。近年來(lái)該法被廣泛應(yīng)用于病原體的檢測(cè)。LAMP檢測(cè)試劑盒不需要先進(jìn)的儀器，并且具有特異性強(qiáng)、敏感度高、檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便以及易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。不過(guò)LAMP也有缺點(diǎn)，就是因?yàn)殪`敏度高，一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能?chē)?yán)格分區(qū)，因此需要避免假陽(yáng)性的問(wèn)題。

3 總結(jié)

雖然當(dāng)前出現(xiàn)腹瀉癥狀的疾病種類(lèi)相對(duì)較多，但在全國(guó)范圍內(nèi)，以流行性腹瀉（PED）為主的病毒性腹瀉危害最為嚴(yán)重，且自2010年以來(lái)疫情持續(xù)不斷。各種病毒性腹瀉病的臨床癥狀和解剖病變十分相似，給臨床快速診斷帶來(lái)不少困難。為了及時(shí)對(duì)癥防控和治療，減少經(jīng)濟(jì)損失，需要及時(shí)正確采取病料送至實(shí)驗(yàn)室做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室確診。同時(shí)，在日常的豬場(chǎng)管理中，注意生物安全防控，控制產(chǎn)房的溫度和濕度，做好產(chǎn)房的全進(jìn)全出措施，并注重消毒空欄，切斷一切可能的傳染源，才能更好地控制該病。免疫防控時(shí)一定要選用高質(zhì)量的腹瀉疫苗，最好選用高抗原含量的變異株P(guān)ED+TGE疫苗。

2017-04-28）

賀東生，教授、博士生導(dǎo)師，傳染病研究方向。479905817@qq.com