硒對氟致大鼠腎小管上皮細胞線粒體膜電位改變的拮抗作用

常 凱, 王 裕, 龐文彪, 高繼萍, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室, 太原 030001)

硒對氟致大鼠腎小管上皮細胞線粒體膜電位改變的拮抗作用

常 凱, 王 裕, 龐文彪, 高繼萍, 陳朝陽, 宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室, 太原 030001)

目的 探究硒對氟致大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞)線粒體膜電位改變的拮抗作用。方法 實驗共設4組: 染氟組(5 mg/L和20 mg/L的氟化鈉)、染硒組(0.0171 mg/L和0.0342 mg/L的亞硒酸鈉)、硒干預組(氟化鈉和亞硒酸鈉聯(lián)合干預)和對照組，按照分組干預NRK-52E細胞48 h。流式細胞儀檢測其線粒體膜電位，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化力(T-AOC)測試盒測定酶的活性。結果 與對照組比，隨著氟化鈉濃度的升高，染氟組NRK-52E細胞線粒體膜電位下降(P<0.05或P<0.01)且SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.05或P<0.01)。與染氟組相比，相對應的硒干預組線粒體膜電位升高(P<0.01)。與20 mg/L的染氟組比較，相對應硒干預組的SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高(P<0.05)。與0.0171 mg/L染硒組相比，相對應的硒干預組線粒體膜電位降低(P<0.01)且T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。5 mg/L加氟組與加硒組相比，線粒體膜電位顯著變化(P<0.01), 但SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均無顯著變化。20 mg/L加氟組與加硒組相比，線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)且SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均有顯著性差異(P<0.01)。結論 一定濃度的硒可以拮抗氟誘導大鼠腎小管上皮細胞線粒體膜電位下降，可能通過恢復抗氧化酶活性實現(xiàn)。

氟; 硒; 腎小管上皮細胞; 線粒體膜電位; 抗氧化酶

我國是地方性氟病較嚴重的國家之一，長期暴露于高氟可引起機體慢性氟中毒[1]。對慢性氟中毒的大鼠體內自由基含量檢測，結果表明損傷的主要原因是氟中毒時自由基含量上升[2-4]。自由基攻擊生物膜系統(tǒng)，會導致線粒體受損和生物膜脂質的過氧化[5]。線粒體的氧化損傷與慢性氟中毒關系密切[5]。線粒體結構和功能異常改變可能是因為慢性氟中毒而引起的氧化應激水平升高[3,6-9]。微量元素硒是維持生命活動所必須的，楊克敵等[10]早在1998年的研究已表明一定劑量的硒可拮抗氟中毒，這一結論被許多學者所支持[11-14]。Miao等[15]用不同濃度的含硒水飼喂大鼠表明，氟化鈉+硒組較氟化鈉組的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性高。本文將探究硒對氟致NRK-52E細胞線粒體膜電位改變是否具有拮抗作用。

本實驗以大鼠腎小管上皮細胞為載體, 以不同濃度的氟化鈉(NaF)(5 mg/L、20 mg/L)和亞硒酸鈉(Na2SeO3)(0.0 171 mg/L、0.0 342 mg/L)處理大鼠腎小管上皮細胞48 h, 然后對其線粒體膜電位和一類抗氧化酶系統(tǒng)包括: 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GSH-PX和總抗氧化力(T-AOC)[16,17]進行檢測，旨在探究硒對氟致NRK-52E細胞線粒體膜電位改變的作用，為抗氟藥物的開發(fā)和應用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系來源及培養(yǎng)

本實驗所用的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞)購自于中國科學院上海細胞庫[12]。將大鼠腎小管上皮細胞置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用含體積分數(shù)10%滅活胎牛血清，體積分數(shù)1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

胎牛血清(杭州四季青公司)，NaF分析純(天津市博迪化工有限責任公司)，Na2SeO3分析純(購自天津市化學試劑廠)，線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，冰醋酸、SOD、GSH-PX、CAT和T-AOC測定試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)。

1.3 細胞的分組及處理

NRK-52E細胞的具體分組情況見表1。大鼠腎小管上皮細胞細胞按1 × 105/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液3 mL。待細胞全部貼壁后，再用PBS洗滌2次，按照表1的分組方法進行給藥，處理48 h。

表1 實驗分組情況Table 1 Experimental group mg/L

1.4 線粒體膜電位的測定

NRK-52E細胞給藥處理48 h后, 用PBS洗滌2次(2 000 ×g、離心5 min), 收集細胞; 加入500 mL培養(yǎng)液和JC-1染色工作液, 顛倒混勻, 然后置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min; 孵育結束后, 600 ×g 4 ℃離心3～4 min, 沉淀細胞; 棄上清用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，600×g 4 ℃離心3～4 min; 250 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細胞，用流式細胞儀分析，記錄好實驗結果。

1.5 氧化應激指標的測定

按照表1的分組方法對NRK-52E細胞進行給藥，測定大鼠腎小管上皮細胞的應激指標，包括: SOD值、GSH-PX值、CAT值和T-AOC值。具體操作方法參見SOD測試盒、GSH-PX測試盒、CAT測試盒和T-AOC測定試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行分析處理，以均數(shù)±標準差()表示。方差齊的多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 線粒體膜電位

硒對氟誘導的NRK-52E細胞的線粒體膜電位的測定結果見表2和圖1。線粒體膜電位較高時，JC-1以聚合物形式存在于線粒體基質中, 發(fā)紅色熒光; 當線粒體膜電位較低時, 發(fā)出綠色熒光。5 mg/L加氟組與加硒組相比、20 mg/L加氟組與加硒組相比都具有顯著性差異(P<0.01)。與對照組相比，隨著NaF濃度的升高(從5 mg/L到20 mg/L)，JC-1綠色熒光比值上升，線粒體膜電位降低(P<0.05或P<0.01)。0.0171mg/L的加硒組與對照組相比, 其線粒體膜電位無顯著變化。硒干預組與對照組相比, 具有顯著性差異(P<0.01); 0.0171 mg/L的硒干預組與同劑量加硒組相比，具有顯著性差異(P<0.01);硒干預組與等劑量加氟組相比, 線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。這說明硒對氟致NRK-52E細胞線粒體膜電位的變化具有拮抗作用。

2.2 氧化應激指標

如表3所示，5 mg/L加氟組與加硒組相比, SOD、GSH-PX(除0.0171mg/L的加硒組)、CAT、T-AOC酶活性均無顯著變化; 20 mg/L加氟組與加硒組相比, 具有顯著性差異(P<0.01)。與對照組相比, 染氟組SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均降低(P<0.05或P<0.01)。與0.0171 mg/L加硒組相比, 相對應的硒干預組T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。與20 mg/L染氟組比較, 相對應的硒干預組SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高(P<0.05)。

表2 硒干預對氟化鈉誘導的腎小管上皮細胞線粒體膜電位的影響(± s, n=3)Table 2 Effect of selenium intervention on mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells induced by sodium fluoride (± s, n=3)

表2 硒干預對氟化鈉誘導的腎小管上皮細胞線粒體膜電位的影響(± s, n=3)Table 2 Effect of selenium intervention on mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells induced by sodium fluoride (± s, n=3)

注: 與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01; 各硒干預組與同劑量加氟組相比,##P<0.01; 各硒干預組與同劑量加硒組相比,aaP <0.01; 20 mg/L加氟組與加硒組相比,bbP<0.01; 5 mg/L加氟組與加硒組相比,ccP<0.01

組別 NaF/ Na2SeO3綠色熒光mg·L-1/mg·L-1比值/%對照加氟組加硒組硒干預組0 5 2 0 0 0 5 5 2 0 20 0 0 0 0.0171 0.0342 0.0171 0.0342 0.0171 0.0342 9.71±0.21 11.62±0.39*25.56±1.30**9.33±0.07bbcc15.61±0.15**bbcc15.65±0.14**##aa19.33±0.21**##aa17.94±0.22**##aa16.59±0.06**##

3 討論

線粒體是機體產(chǎn)生能量與儲存能量的主要場所, 由內外兩層膜包被[18]，線粒體的內膜存在跨膜的質子梯度電位差，跨膜電位外室為正電位, 內室為負電位, 內膜上的ATP合成酶利用跨膜電勢能可合成維持細胞正常功能所需的ATP[19]。線粒體膜電位對維持線粒體正常功能極為重要[20,21]，甚至影響細胞乃至整個機體的基本生理功能。膜電位改變可反映出多種與線粒體功能相關的變化，如: 線粒體蛋白復合體的結構變化、細胞色素C釋放和ATP的合成等。過量氟可致氧化代謝紊亂，從而引起細胞病理損傷甚至細胞的凋亡[22]。另外膜電位的下降被認為是細胞早期凋亡的標志性事件，更是細胞早期凋亡的不可逆事件[23]。本研究表明，隨著NaF濃度的升高，染氟組NRK-52E細胞線粒體膜電位下降(P<0.05或P<0.01)。與加硒組相比，同劑量的硒干預組線粒體膜電位降低(P<0.01), T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.01或P<0.05)。這提示了氟可誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位的改變。另外本研究還顯示，染氟組細胞內的SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P<0.05)。由此本文作者推測過量氟的攝入致細胞內氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致脂質過氧化作用增強，從而使機體有害的自由基不能及時清除，而線粒體膜由磷脂雙分子層構成，膜上的鈉鉀ATP酶易受自由基攻擊，這使得線粒體膜結構、功能受損和離子平衡紊亂，導致其膜電位發(fā)生改變。

圖1 硒干預對氟化鈉誘導腎小管上皮細胞線粒體膜電位的流式圖Figure 1 The mitochondrial membrane potential flow pattern of selenium intervention of NRK-52E cells induced by sodium fluoride

表3 硒對氟誘導大鼠腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中氧化應激指標的影響(x-± s, n=6)Table 3 Effect of selenium on oxidative stress in NRK-52E cells induced by fluoride (x-± s, n=6) U/mL

5 mg/L加氟組與加硒組相比線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)但SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均無顯著性差異。20 mg/L加氟組與對照組、加硒組相比, 線粒體膜電位具有顯著性差異(P<0.01)且SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均有顯著性差異(P<0.01)，表明20 mg/L的NaF已足夠對NRK-52E細胞造成損傷, 但氟對NRK-52E細胞造成損傷的最小劑量還需進一步研究。

硒元素具有抗氧化性[24,25]，是維持機體的正常生命活動所必需的元素。本研究顯示，與染氟組相比, 硒干預組線粒體膜電位升高(P<0.01), SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均升高，推測硒拮抗氟致線粒體膜電位變化的機理：硒可以拮抗NRK-52E細胞內的高濃度氟，促進尿氟的排泄，清除自由基，使抗氧化酶活性恢復并明顯抑制脂代謝紊亂和氟誘導的脂質過氧化，從而提高機體的抗氧化能力，對線粒體膜電位起到保護修復作用, 這一點在其它文獻中也有提及[26-30]。

綜上所述, 氟可以誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位下降，抗氧化酶(SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶)活性降低，一定濃度的硒對氟致NRK-52E細胞線粒體膜電位改變具有拮抗作用，可能是通過恢復抗氧化酶活性來實現(xiàn)的。

[1] 馬士成. 鋁對茶樹氟吸收、累積、分布特性的影響及其機理研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2012.

[2] 吳延莉, 徐小東, 曾貝貝, 等. 過量氟攝入對大鼠骨組織氧化應激的影響[J]. 中華地方病學雜志, 2015, 34(10):729-732.

[3] 秦雙立. Fis1和Mfn1表達及氧化應激在慢性氟中毒大鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷中的作用[D]. 貴陽: 貴陽醫(yī)學院, 2013:1-46.

[4] 苗可可. 氟暴露致體外培養(yǎng)PC12細胞損傷機理的研究[D]. 金華: 浙江師范大學, 2014:1-53.

[5] 秦雙立, 官志忠.線粒體損傷和氧化應激的關系[J]. 國外醫(yī)學: 醫(yī)學地理分冊, 2013, 34(3):197-201.

[6] 樓迪棟, 劉燕斐, 張凱琳, 等. 慢性氟中毒對大鼠大腦皮質神經(jīng)細胞活性氧水平和線粒體融合的影響[J]. 中國地方病學雜志, 2011, 30(3):256-260.

[7] Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induced oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling[J]. Free Radic Biol Med, 2015, 89:369-378.

[8] Mahaboob BP, Saumya SM. Suppression of mitochondrial oxidative phosphorylation and TCA enzymes in discrete brain regions of mice exposed to high fluoride: amelioration by Panax ginseng (Ginseng) and Lagerstroemia speciosa (Banaba) extracts [J]. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(3):453-464.

[9] Qin SL, Deng J, Lou DD, et al. The decreased expression of mitofusin-1 and increased fission-1 together with alterationsin mitochondrial morphology in the kidney of rats with chronic fluorosis may involve elevated oxidative stress [J]. J Trace Elem Med Biol, 2015, 29:263-268.

[10] 楊克敵, 陳軍, 王桂珍, 等. 不同濃度硒拮抗氟致腎脂質過氧化和微量元素影響的研究[J]. 衛(wèi)生研究, 1998, 27(3): 201-204.

[11] 段鵬, 陳晉, 楊波, 等. 硒拮抗氟致大鼠肝細胞氧化應激和DNA損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2013, 29(11):1626-1629.

[12] 馮佩. 硒對慢性氟中毒致血液抗氧化能力損傷影響機理的研究[D]. 金華: 浙江師范大學, 2012.

[13] 王桂芹. 硒和VitC對高氟所致氧化應激、DNA損傷及Bcl-2蛋白表達影響研究[D]. 廣州: 廣東藥學院, 2011.

[14] Qian W, Miao K, Li T, et al. Effect of selenium on fluorideinduced changes in synaptic plasticity in rat hippocampus. [J]. Biol Trace Elem Res, 2013, 155(2):253-260.

[15] Miao K, Zhang L, Yang S, et al. Intervention of selenium on apoptosis and Fas/FasL expressions in the liver of fluorideexposed rats.[J].Environ Toxicol Pharmacol, 2013, 36(3): 913-920.

[16] 田洪艷, 李質馨, 徐冶, 等. 蒺藜提取物對小鼠損傷睪丸氧化/抗氧化系統(tǒng)的影響[J].中國婦幼保健, 2015 (26):4551-4554.

[17] 王裕. 氟對大鼠腎小管上皮細胞的毒性作用及硒干預機制的研究[D]. 太原: 山西醫(yī)科大學, 2015.

[18] 范穎, 才麗平, 于彩娜, 等. 參附湯、芪附湯、姜附湯對阿霉素心臟毒性損傷大鼠線粒體途徑細胞凋亡的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(8):135-138．

[19] 房曉祎. 二氮嗪對窒息新生大鼠心肌線粒體保護作用機制研究[D]. 汕頭: 汕頭大學, 2011:1-78.

[20] 吳偉, 徐蔚. 線粒體通透性轉換孔結構和功能的研究進展[J]. 醫(yī)學信息, 2011, 24(3):1753-1754.

[21] 蘇米雅, 張家新. 哺乳動物細胞凋亡分子機理的研究進展[J].中國農(nóng)學通報, 2011, 27(17):1-5.

[22] Wang Z, Yang X, Yang S, et al. Sodium fluoride suppress proliferation and induce apoptosis through decreased insulin-like growth factor-I expression and oxidative stress in primary cultured mouse osteohlasts [J]. Arch Toxicol, 2011, 85(11):1407-1417.

[23] 朱啟偉, 王浩, 葉平, 等. 吡格列酮對缺氧/復氧后新生大鼠心肌細胞線粒體膜電位的影響[J]. 四川大學學報: 醫(yī)學版, 2011, 42(6):784-788.

[24] 陳劍杰, 曹謹玲, 羅永巨, 等. 納米硒對氟脅迫下鯉魚肝抗氧化功能及組織結構的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2013, 24 (10):2970-2976.

[25] 尉俊仁, 馮佩, 章子貴. 硒對慢性氟中毒致雄性大鼠生殖毒性的拮抗作用[J].浙江師范大學學報: 自然科學版, 2011, 34(1):86-90.

[26] 張兵, 張愛君. 硒與氟中毒[J]. 中國地方病防治雜志, 2008, 23(4):263-267.

[27] 祝文靜, 章子貴, 申秀英, 等. 氟中毒發(fā)病機制及硒的抗氟作用[J]. 中國地方病學雜志, 2009, 28(6):704-706.

[28] Feng P, Wei JR, Zhang ZG. Influence of selenium and fluoride on blood antioxidant capacity of rats[J]. Exp Toxicol Pathol, 2012, 64(6):565-568.

[29] 孫巖. 飲水型氟中毒致腎臟損傷的分子機制及硒的影響[D]. 金華: 浙江師范大學, 2016.

[30] 杜俊文, 吳韜, 張坤, 等. 氟中毒致血管損傷及動脈硬化的臨床研究[J]. 中國地方病防治雜志, 2016(3):289.

Antagonistic Effect of Selenium on Change of Mitochondrial Membrane Potential of NRK-52E Cells Induced by Sodium Fluoride

CHANG Kai, WANG Yu, PANG Wen-biao, GAO Ji-ping, CHEN Zhao-yang, SONG Guo-hua
(Shanxi Medical University, Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo study effects of fluoride on the change of mitochondrial membrane potential in rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E cells) .MethodsThe experiments were divided into 4 groups: the control group, the fluoride group, the selenium group and the selenium intervention group. NRK-52E cells were cultured with fluoride and selenium respectively in various concentration, and fluoride and selenium combination for 48 h. (5 mg/L or 20 mg/L NaF、0.0171 mg/L or 0.0342 mg/L Na2SeO3). The mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. The activity of enzymes and the content of free radicals were examined by relevant reagent kit, such as superoxide dismutase (SOD) reagent kit .ResultsCompared with the control group, the mitochondrial membrane potential decreased (P<0.05 or P<0.01) and SOD, total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GSH-PX) and catalase (CAT) enzyme activities decreased (P<0.05) with the increase of the concentration of sodium fluoride.The mitochondrial membrane potential of the selenium intervention group was increased (P<0.01) compared with that of the fluoride exposed group.Compared with the fluoride group of 20 mg/L, the relative selenium intervention group SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities were increased (P<0.01). Compared with the selenium group of 0.0171 mg/L, the relative selenium intervention group the mitochondrial membrane potential decreased (P<0.01) and SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT enzyme activities decreased (P<0.05 or P<0.01). 5 mg/L the fluoride group compared with the selenium group, the mitochondrial membrane potential changed significantly (P<0.01). But for SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities ,there were no significant changed. 20 mg/L the fluoride group compared with the selenium group, the mitochondrial membrane potential changed significantly (P<0.01). SOD, T-AOC, GSH-PX and CAT activities also changed significantly (P<0.01) .ConclusionThe certain concentration of selenium could induce the decrease of mitochondrial membrane potential in NRK-52E cells induced by fluoride, that may be achieved by restoring the activities of activities.

Sodium fluoride; Selenium; Rat renal tubular epithelial cells; Mitochondrial membrane potential; Antioxidant enzymes

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0179-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.002

2016-10-30

山西省實驗動物專項(2012k02); 山西醫(yī)科大學青年資金項目(02201429)

常 凱(1993-), 女, 碩士研究生, 主要研究方向: 人類疾病動物模型。E-mail: 932719380@qq.com

宋國華, 女, 教授。E-mail: ghsongg@hotmail.com