微波輻射下以離子交聯(lián)法制備殼聚糖微粒

宋 林， 年中峰， 楊 頔， 蔣福宇， 劉學(xué)貴

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142; 2.東北制藥集團(tuán)股份有限公司， 遼寧 沈陽(yáng) 110026)

微波輻射下以離子交聯(lián)法制備殼聚糖微粒

宋 林1,2， 年中峰1， 楊 頔1， 蔣福宇1， 劉學(xué)貴1

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142; 2.東北制藥集團(tuán)股份有限公司， 遼寧 沈陽(yáng) 110026)

以殼聚糖作為載體材料，焦磷酸鈉(TSPP)作為交聯(lián)劑，在微波輻射下，采用離子交聯(lián)法制備殼聚糖微粒.考察制備工藝對(duì)微粒粒徑、形貌、分散度的影響.采用掃描電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和紅外光譜對(duì)微粒形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.結(jié)果表明微波輻射下制備殼聚糖微球的較佳工藝條件為：微波輻射下反應(yīng)溫度為60 ℃，交聯(lián)時(shí)間為5 min，正負(fù)離子的摩爾比為30∶1，轉(zhuǎn)速為400 r/min.

殼聚糖微球； 焦磷酸鈉； 微波輻射法； 離子交聯(lián)

甲殼素是一種純天然可再生的自然資源，在自然界中廣泛存在.殼聚糖是由甲殼素脫乙?；磻?yīng)得到的鏈狀聚氨基多糖(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖,是僅少于纖維素的自然界第二大多糖,殼聚糖已被證實(shí)具有mm好的生物相容性、生物可降解性、抗菌活性、無(wú)毒性和保濕性能[1].因具有這些理想的性能，殼聚糖可以加工制作成支架、納米粒、納米纖維、微球、珠狀體、薄膜等[2-7].殼聚糖也已被證實(shí)能提升不溶藥物和難容藥物的溶解性[8]，其帶正電性和良好的生物黏附性使其在黏膜表面負(fù)電荷條件下黏附性增加，藥物滯留時(shí)間延長(zhǎng)，且殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)—NH2，可與含雙官能團(tuán)的醛或酸酐藥物化學(xué)偶聯(lián)，使藥物大量分布于偶聯(lián)結(jié)構(gòu)內(nèi)緩慢釋放，用殼聚糖制備的微球作為藥物載體明顯優(yōu)于一般材料，近年來(lái)受到有關(guān)研究者的廣泛關(guān)注[9].因此，殼聚糖在制藥應(yīng)用方面具有很好的發(fā)展前景.

本文使用焦磷酸鈉作為交聯(lián)劑制備殼聚糖微粒，并用微波輻射法代替常規(guī)的水浴加熱法，這種在微波輻射下，焦磷酸鈉作為交聯(lián)劑制備殼聚糖微球的方法在國(guó)內(nèi)外研究中未見(jiàn)報(bào)道.本文以上述方法制備殼聚糖微粒，以微粒形貌為考察指標(biāo)，以轉(zhuǎn)速、交聯(lián)時(shí)間、溫度、交聯(lián)劑的正負(fù)離子摩爾比為影響因素，對(duì)微球的制備工藝進(jìn)行了考察.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，脫乙酰度為80.0 %～95.0 %，黏度為50～800 mPa·s，生化試劑；焦磷酸鈉、氫氧化鈉，分析純，天津市博迪化工有限公司；無(wú)水乙醇、異丙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；冰醋酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

激光粒度分布儀，BT-9300H，丹東市百特儀器有限公司；凍干機(jī)，德國(guó)LYOVAC GT2-S；掃描電鏡，SEM，SNE3200m，韓國(guó)SNE公司；紫外分光光度計(jì)，UV-3200PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司；紅外光譜儀，NEXUS470，美國(guó)熱電公司；pH計(jì)，PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.2 殼聚糖微粒的制備

稱取定量的殼聚糖固體溶于50～100 mL體積分?jǐn)?shù)為2 %～3 %的醋酸溶液中，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %～2 %的殼聚糖醋酸溶液，然后用循環(huán)水式真空泵抽濾除去殼聚糖中的雜質(zhì).在室溫下，向殼聚糖醋酸溶液中滴加NaOH 溶液(1.0 mol/L)，用pH 計(jì)調(diào)節(jié)殼聚糖溶液的pH 在4～7的范圍內(nèi)，并在固定的溫度(室溫～100 ℃)、正負(fù)電荷摩爾比(20∶1～60∶1)、交聯(lián)時(shí)間(5～25 min)、轉(zhuǎn)速(300～700 r/min)的條件下，在微波反應(yīng)器中設(shè)置好參數(shù)，將焦磷酸鈉溶液(0.5～0.8 g/L)滴加到制備好的殼聚糖醋酸溶液中，并得到殼聚糖微粒溶液.反應(yīng)結(jié)束后，將制備好的殼聚糖微粒溶液用臺(tái)式低速自動(dòng)離心機(jī)離心2～5 min(3 000～4 000 r/min)，倒去上層清液，然后用純凈水洗滌3～5次，最后將產(chǎn)物在-30～45 ℃的條件下冷凍干燥12～24 h，即得到殼聚糖空白微粒.

2 結(jié)果與討論

2.1 微球的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 紅外光譜分析

殼聚糖與焦磷酸鈉交聯(lián)殼聚糖微粒的紅外光譜如圖1所示，殼聚糖上氨基和羥基的吸收峰出現(xiàn)在3 425 cm-1處，微粒產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的峰出現(xiàn)在3 359 cm-1處且變窄，這是因?yàn)橐徊糠职被毁|(zhì)子化后與陰離子靜電吸附使吸收峰發(fā)生變化的結(jié)果.1 115 cm-1處和1 069 cm-1處是焦磷酸鈉—P==O 官能團(tuán)的吸收峰[11]，這表明交聯(lián)微粒中含有焦磷酸鈉,可證明微波輻射下以焦磷酸鈉為交聯(lián)劑成功地制備了殼聚糖微粒.

圖1 殼聚糖及殼聚糖微球的紅外光譜

2.1.2 殼聚糖微粒表面結(jié)構(gòu)的表征

如圖2所示，由圖2(a)可以看到交聯(lián)微粒，平均粒徑在7～12 μm，符合肺靶向7～15 μm粒徑范圍要求，微粒表面有明顯的層狀結(jié)構(gòu).通過(guò)圖2(b)可以看到微粒表面凹凸不平，比表面積較大，這有利于藥物的負(fù)載；表面層狀結(jié)構(gòu)明顯，結(jié)構(gòu)緊密，這有利于藥物的緩慢釋放.由圖2(c)、(d)可以看出微粒形較規(guī)則且分布均勻，黏連情況較少.

圖2 空白微粒的掃描電鏡圖

2.2 單因素考察殼聚糖微粒制備工藝

以殼聚糖微粒形狀、分布及平均粒徑作為考察指標(biāo)，分別對(duì)溫度、交聯(lián)時(shí)間、轉(zhuǎn)速、正負(fù)離子摩爾比(交聯(lián)劑的用量)4個(gè)因素進(jìn)行單因素考察，選取殼聚糖微粒制備工藝的適宜條件.

2.2.1 溫度對(duì)空白微粒平均粒徑及分布的影響

使用微波輻射法制備殼聚糖空白微球，固定正負(fù)電荷摩爾比(30∶1)、轉(zhuǎn)速(300 r/min)、滴定時(shí)間(15 min)、微波功率(1 360 W)，選取溫度分別為20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃，考察溫度對(duì)微粒平均粒徑及微粒分布的影響，結(jié)果如圖3所示.

圖3 溫度對(duì)殼聚糖微粒平均粒徑的影響

反應(yīng)溫度在20～40 ℃時(shí)，對(duì)空白微球的粒徑無(wú)明顯的影響；但反應(yīng)溫度由40 ℃上升到80 ℃時(shí)，空白微粒的平均粒徑隨溫度的升高而增大；當(dāng)反應(yīng)溫度上升到100 ℃時(shí)，空白微粒的平均粒徑有所減小.當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)90 ℃時(shí)，回流冷凝管里開(kāi)始有液體回流，但溫度上升到100 ℃時(shí)，反應(yīng)溶液出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象，并且有液體回流，反應(yīng)溶液沸騰時(shí)的震蕩，會(huì)將已形成的微粒打碎，從而使微粒的平均粒徑減小.

如圖4所示，(a)、(b)、(c)分別是反應(yīng)溫度為40 ℃、60 ℃、80 ℃所制備的殼聚糖微粒溶液在顯微鏡下放大400倍的圖像.

圖4 不同溫度制得的微粒

由圖4可以看出：反應(yīng)溫度40 ℃時(shí)，微粒形狀較好，整體分布比較均勻，但微粒粒徑較??；反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，微粒形狀為類球形，整體分布均勻，微粒平均粒徑大小符合肺靶向(7～15 μm)要求；反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，微粒大小均勻， 但微球大多粘連在一起，使整體分布不均勻，這也是反應(yīng)溫度80 ℃時(shí)，微粒平均粒徑較大的原因之一.另外焦磷酸鈉作為交聯(lián)劑，它的水溶液在70 ℃以下比較穩(wěn)定，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，焦磷酸鈉會(huì)水解成磷酸二氫鈉，可能對(duì)反應(yīng)造成影響.由上可知：反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，制備出的殼聚糖微粒球型較好，分布均勻，粒徑范圍較窄，平均粒徑在7～15 μm范圍內(nèi)的占62.8 %，比其他溫度下所占比例都高.因此，微波輻射下反應(yīng)的最佳溫度為60 ℃.

2.2.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)空白微粒平均粒徑及分布的影響

使用微波輻射法制備殼聚糖空白微粒，固定正負(fù)電荷摩爾比(30∶1)、轉(zhuǎn)速(300 r/min)、反應(yīng)溫度(60 ℃)、微波功率(1 360 W)，選取交聯(lián)時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，考察時(shí)間對(duì)微粒平均粒徑及微粒分布的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知：交聯(lián)時(shí)間為5～20 min 時(shí)的粒徑的大小相差不大.實(shí)驗(yàn)采用微波輻射法進(jìn)行加熱，其加熱方式是通過(guò)磁場(chǎng)的變化使被加熱的極性分子殼聚糖以及焦磷酸鈉分子做輪擺運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生類似摩擦的作用，這種方式無(wú)需介質(zhì)的傳導(dǎo)，加熱均勻，使物體本身成為加熱源，從而提高了加熱效率.前期實(shí)驗(yàn)中考察了交聯(lián)時(shí)間1～5 min對(duì)微球質(zhì)量的影響，結(jié)果表明交聯(lián)時(shí)間少于5 min時(shí)，由于交聯(lián)劑滴加速度過(guò)快，產(chǎn)生了過(guò)交聯(lián)現(xiàn)象，微球大量聚集在一起，微粒平均粒徑在25 μm左右，不符合預(yù)期要求.交聯(lián)時(shí)間為5 min時(shí)，殼聚糖與交聯(lián)劑焦磷酸鈉已經(jīng)完成離子交聯(lián)反應(yīng)，形成了殼聚糖微粒.滴定時(shí)間為10～20 min，空白微粒的平均粒徑較5 min時(shí)變化不大，在這反應(yīng)時(shí)間段粒徑曲線比較平穩(wěn)，說(shuō)明在該時(shí)間段反應(yīng)的時(shí)間對(duì)微球粒徑的影響不大.交聯(lián)時(shí)間為25 min時(shí)，微粒的平均粒徑有下降的趨勢(shì)，原因是由于反應(yīng)過(guò)程中攪拌的時(shí)間較長(zhǎng),會(huì)將已形成的空白微粒打碎，造成微粒的平均粒徑變小.

如圖6所示，(a)、(b)、(c)分別是交聯(lián)時(shí)間為5 min、10 min、15 min所制備的殼聚糖微粒溶液在顯微鏡下放大400倍的圖像.滴定時(shí)間為5 min時(shí)，已經(jīng)有微粒形成，微粒的形貌較好，整體分布較均勻.滴定時(shí)間為10 min及15 min時(shí)，微粒的形貌及分布狀態(tài)與交聯(lián)時(shí)間為5 min時(shí)差別不大.微波輻射法較水熱法對(duì)反應(yīng)的效率有很大的提高，反應(yīng)時(shí)間由20 min(水熱法)縮短到5 min(微波輻射法).由上可知：交聯(lián)時(shí)間為5 min制備出的殼聚糖微粒形貌較好，分布均勻，粒徑范圍較窄，粒徑在7～15 μm范圍內(nèi)的占54.42 %.因此，微波輻射下反應(yīng)的最佳交聯(lián)時(shí)間為5 min.

圖5 時(shí)間對(duì)殼聚糖微粒平均粒徑的影響

圖6 不同交聯(lián)時(shí)間制得的微粒

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)空白微粒平均粒徑及分布的影響

使用微波輻射法制備殼聚糖空白微球，固定正負(fù)電荷摩爾比(30∶1)、交聯(lián)時(shí)間(5 min)、反應(yīng)溫度(60 ℃)、微波功率(1 360 W)，選取轉(zhuǎn)數(shù)為300、400、500、600、700 r/min，考察轉(zhuǎn)速對(duì)微粒平均粒徑及微粒分布的影響，結(jié)果如圖7所示.

圖7 轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)殼聚糖微粒的平均粒徑的影響

由圖7可知：隨著轉(zhuǎn)速的增加，曲線有下降的趨勢(shì)，表明隨著轉(zhuǎn)速的增加，殼聚糖微粒的平均粒徑逐漸減小.轉(zhuǎn)速在300 r/min時(shí)微粒的平均粒徑最大，這是由于轉(zhuǎn)速較小微球發(fā)生部分集聚現(xiàn)象致微粒平均粒徑最大；當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)在400～600 r/min時(shí)曲線比較平穩(wěn)，表明在這個(gè)范圍內(nèi)轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)微粒的平均粒徑的影響不大；當(dāng)轉(zhuǎn)速為700 r/min時(shí)，微粒的平均粒徑最小，這是由于轉(zhuǎn)速過(guò)大會(huì)將殼聚糖微粒打碎，從而造成微粒平均粒徑下降.

如圖8所示，(a)、(b)、(c)分別為轉(zhuǎn)速為300、400、500 r/min時(shí)所制備的殼聚糖微粒溶液在顯微鏡下放大400倍的圖像.轉(zhuǎn)速為300 r/min 和400 r/min時(shí)，微粒形狀規(guī)整，整體分布均勻；轉(zhuǎn)速超過(guò)500 r/min時(shí)，微粒數(shù)量明顯減少，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速增加，有可能把剛形成的微粒打碎，致使微粒成粒量下降.由上可知：轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí),制備出的殼聚糖微粒形貌較好，分布均勻，粒徑范圍較窄，平均粒徑在7～15 μm范圍內(nèi)的占64.32 %，因此，微波輻射下反應(yīng)的最佳轉(zhuǎn)速為400 r/min.

圖8 不同轉(zhuǎn)速制得的微粒

2.2.4 正負(fù)離子的摩爾比對(duì)空白微粒的平均粒徑及球型分布的影響

使用微波輻射法制備殼聚糖空白微球，滴定時(shí)間為5 min，pH值為5.00，反應(yīng)溫度60 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，微波功率為1 360 W.選取正負(fù)電荷摩爾比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，考察正負(fù)離子的摩爾比對(duì)微粒平均粒徑及球型分布的影響，結(jié)果如圖9所示.由圖9可知：正負(fù)電荷摩爾比在20∶1～40∶1的范圍內(nèi)時(shí)，殼聚糖微粒的平均粒徑隨正負(fù)電荷摩爾比的增加而減?。徽?fù)電荷摩爾比范圍在40∶1～60∶1時(shí)，殼聚糖微粒的平均粒徑隨正負(fù)電荷摩爾比的增加而增加.當(dāng)正負(fù)電荷摩爾比在20∶1時(shí)，由于加入的交聯(lián)劑過(guò)量，發(fā)生過(guò)度交聯(lián)，使形成的微粒聚集在一起，所以平均粒徑較大.當(dāng)正負(fù)電荷摩爾比為40∶1 時(shí)，由于加入交聯(lián)劑的量下降，殼聚糖醋酸溶液的交聯(lián)度也隨著下降，殼聚糖分子鏈上成粒量下降，所以，微粒平均粒徑也隨著下降.當(dāng)正負(fù)電荷摩爾比為50∶1和60∶1 時(shí)，加入的交聯(lián)劑量進(jìn)一步減少，交聯(lián)度過(guò)低致使反應(yīng)溶液中未交聯(lián)的殼聚糖分子大量存在，這些殼聚糖會(huì)與溶液中的氫氧化鈉溶液發(fā)生反應(yīng)生成膠體，致使微粒平均粒徑變大.

圖9 正負(fù)電荷摩爾比對(duì)殼聚糖空白

如圖10所示，(a)、(b)、(c)為正負(fù)離子摩爾比分別為30∶1、40∶1、50∶1時(shí)所制備的殼聚糖微粒溶液在顯微鏡下放大400倍的圖像.正負(fù)離子摩爾比為30∶1時(shí)，微粒形狀規(guī)則，整體分布均勻，沒(méi)有聚集的情況出現(xiàn)；而當(dāng)電荷摩爾比為40∶1 及50∶1 時(shí)，微粒形貌較差并且大多數(shù)聚集在一起，這是由于交聯(lián)劑量不足，使一部分殼聚糖醋酸溶液未成微粒，在氫氧化鈉作用下形成膠體.由上可知，正負(fù)離子摩爾比為30∶1時(shí),制備出的殼聚糖微粒形貌較好，分布均勻，粒徑范圍較窄，粒徑在7～15 μm范圍內(nèi)的占100 %.因此,微波輻射下反應(yīng)的最佳正負(fù)離子摩爾比為30∶1.

圖10 不同正負(fù)離子摩爾比制得的微粒

3 結(jié) 論

微波輻射下，以離子交聯(lián)法制備殼聚糖微粒的方法簡(jiǎn)單可行，這種制備方法具有交聯(lián)時(shí)間短、微粒分布均勻的特點(diǎn).焦磷酸鈉作為交聯(lián)劑避免了傳統(tǒng)交聯(lián)劑，如戊二醛，對(duì)人體的損害.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出制備殼聚糖微球的最佳工藝條件：反應(yīng)溫度為60 ℃，交聯(lián)時(shí)間為5 min，轉(zhuǎn)速為400 r/min，正負(fù)電荷摩爾比為30∶1.通過(guò)該方法獲得的殼聚糖微粒作為制備治療肺靶向藥物載體(粒徑范圍7～15μm)，環(huán)保無(wú)毒，制備工藝簡(jiǎn)便，成本低廉.

[1] UPADHYAYA L,SINGH J,AGARWALC V,et al.Biomedical Applications of Carboxymethyl Chitosans[J].Carbohydrate Polymers,2013,91 (1):452-466.

[2] DUARTE A R C,MANO J F,REIS R L.Novel 3D Scaffolds of Chitosan-PLLA Blends for Tissue Engineering Applications:Preparation and Characterization[J].The Journal of Supercritical Fluids,2010,54(3):282-289.

[3] CSABA N,K?PING-H?GG?RD M,ALONSO M J.Ionically Crosslinked Chitosan/Tripolyphosphate Nanoparticles for Oligonucleotide and Plasmid DNA Delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2009,382 (1/2):205-214.

[4] HOMAYONI H,RAVANDI S A H,VALIZADEH M.Electrospinning of Chitosan Nanofibers:Processing Optimization[J].Carbohydrate Polymers,2009,77(3):656-661.

[5] LAMEIRO M H,LOPES A,MARTINS L O,et al.Incorporation of a Model Protein into Chitosan-bile Salt Microparticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2006,312 (1/2):119-130.

[6] GANDHI R M,KOUSALYA G N,VISWANATHAN N,et al.Sorption Behaviour of Copper on Chemically Modified Chitosan Beads from Aqueous Solution[J].Carbohydrate Polymers,2011,83(3):1082-1087.

[7] BEPPU M M,VIEIRA R S,AIMOLI C G,et al.Crosslinking of Chitosan Membranes Using Glutaraldehyde:Effect on Ion Permeability and Water Absorption [J].Journal of Membrane Science,2007,301 (1/2):126-130.

[8] SINHA V R,SINGLA A K,WADHAWAN,et al.Chitosan Microspheres as a Potential Carrier for Drugs[J].International Journal of Pharmaceutics,2004,274 (1/2):1-33.

[9] 李若慧，程艷玲.以殼聚糖為載體的藥物新劑型[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008,22 (3):30-34.

[10]SOSNIK A,GOTELLI G,ABRAHAM G A.Microwave-assisted Polymer Synthesis (MAPS) as a Tool in Biomaterials Science:How New and How Powerful[J].Progress in Polymer Science,2011,36 (8):1050-1078.

[11]IKEDA S,KUMAGAI H,SAKIYAMA T,et al.Method for Analyzing pH-sensitive Swelling of Amphoteric Hydrogels-Application to a Polyelectrolyte Complex Gel Prepared from Xanthan and Chitosan[J].Bioscience,Biotechnology and Biochemisty,1995,59 (8):1422-1427.

Prepared of Chitosan Microspheres by Ionic Crosslinking Method under Microwave Irradiation

SONG Lin1，2， NIAN Zhong-feng1， YANG Di1， JIANG Fu-yu1， LIU Xue-gui1

(1.Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142， China;2.Northeast Pharmaceutical Group, Shenyang 110026, China)

Chitosan microspheres were prepared via an ion cross-linking technique under microwave irradiation using chitosan as a drug carrier and sodium pyrophosphate as a cross linker reagent.The particle size,morphology and dispersity of microspheres were used to evaluate the influence of the prepared processes.The morphology and structure of the microspheres were characterized by scanning electron microscopy，light microscope and infrared spectrum.The optical conditions to prepare the chitosan microsphere were:60 ℃,cross linking time of 5 min,mole ratio of cation and anion was 30∶1,and a stirring speed 400 r/min.

chitosan microsphere; sodium pyrophosphate; microwave irradiation; ionic cross-linking

2014-11-28

宋林(1988-),男(滿族),遼寧東港人,碩士研究生在讀,主要從事藥學(xué)的研究.

劉學(xué)貴(1972-),男,山東安丘人,副教授,博士,主要從事無(wú)機(jī)礦物資源的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究.

2095-2198(2017)01-0029-07

10.3969/j.issn.2095-2198.2017.01.006

O636.1; R94

A