熒光素與β-環(huán)糊精的包合作用

黎泓波， 唐永瓊， 王素琴， 王 丹， 王興明

(1.功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330022；3.西南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

熒光素與β-環(huán)糊精的包合作用

黎泓波1,2*， 唐永瓊1,2， 王素琴1,2*， 王 丹3， 王興明3

(1.功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022；2.江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330022；3.西南科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

采用UV光譜法、熒光光譜法、雙倒數(shù)法，在pH=7.40的緩沖溶液中系統(tǒng)研究小分子熒光素與β-環(huán)糊精的包合作用.摩爾比法確定小分子熒光素與β-環(huán)糊精的包合比nβ-CD:nFL=1∶1，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=6.30×104L/(mol·cm).雙倒數(shù)法確定結(jié)合常數(shù)K?18℃=7.21×105L/mol. 熱力學(xué)分析方法計算得到:(1)ΔrHm?=7.93×104J/mol，ΔrHm?為正值，說明包合作用吸熱；(2)ΔrGm?291.15 K=-3.27×104J/mol，推測β-環(huán)糊精與熒光素的包合作用有自發(fā)進(jìn)行的可能；(3)ΔrSm?291.15 K=384.68 J/(mol·K)，由此可知，β-環(huán)糊精與熒光素的相互作用為熵所驅(qū)動.并用傅里葉變換紅外光譜儀和X射線衍射儀對包合物進(jìn)行了表征.圖6，表20.

熒光素；β-環(huán)糊精；包合物；包合作用

熒光素及其衍生物是一種重要的熒光探針材料[1]，由于兩個苯環(huán)通過氧橋鍵固定在一個平面上而使分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，激發(fā)光的照射能產(chǎn)生強烈的熒光，不但具有較高的消光系數(shù)[2]，也有較高的熒光量子產(chǎn)率，無毒，成本低等優(yōu)點.該類化合物作為熒光探針被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)或生命分析.但由于熒光素自身不含特異性的活性基團，有難固載，易洗脫，不耐溶劑，含量不均勻和熒光性質(zhì)不穩(wěn)定的缺點，不能滿足高要求的生物分析及活體成像研究.為此，國內(nèi)外許多研究者通過引入不同功能的化學(xué)基團對熒光素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或修飾，開發(fā)研制出許多含活性基的熒光素衍生物，極大豐富熒光素在科學(xué)研究中的意義.熒光素分子結(jié)構(gòu)見圖1.

β-環(huán)糊精具有疏水的內(nèi)腔和親水的表面，它可以與有機體、無機體、生物體等客體分子形成主-客體包合物或在其表面形成配位修飾體，能明顯改善客體分子的狀態(tài)、穩(wěn)定性、溶解度等理化特性[3-4].在醫(yī)藥方面，環(huán)糊精可促進(jìn)藥物穩(wěn)定性，增加藥物溶解度，提高藥物生物利用度，作為藥物緩釋劑[5-8].所以，研究熒光素與β-環(huán)糊精的包合作用，借助于環(huán)糊精的模擬酶功能對藥物包合，不僅有利于抗癌藥物的改良和篩選，也對開發(fā)新型生物傳感器[9-10]、超分子作用機理闡述[11-12]、能源[13]及抗癌藥物機理的深入研究等都具有重要意義[14-16].實驗?zāi)M人體生理環(huán)境，用β-環(huán)糊精包合一種常用的染料藥-熒光素，用UV-Vis、熒光光譜和雙倒數(shù)法研究了β-環(huán)糊精與熒光素的包合作用，并用傅里葉變換紅外光譜儀和X射線衍射儀對包合物進(jìn)行了表征，得到了包合比、包合常數(shù)以及熱力學(xué)函數(shù)等有價值信息.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

β-環(huán)糊精(β-CD，A.R，成都科龍化工試劑廠)；熒光素(A.R，成都科龍化工試劑廠) ，三羥甲基氨基甲烷(A.R，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，其它試劑均為分析純，水為二次重蒸水.

UNICO UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)；RF-540 熒光儀(日本島津)；Nicolet 380智能傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司)；D/max-RB X射線衍射儀(日本理學(xué)公司)；pHS-3B型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司)，AL204型電子分析天平(上海梅勒特-托利多儀器)，HH-601超級恒溫水浴(金壇金南儀器廠)，PHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 紫外光譜法

使用Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)為研究介質(zhì)，配制好待測溶液，靜置5 min.在1 cm比色皿中加入3.00 mL 熒光素溶液，以Tris-HCl緩沖溶液空白為參比，用β-CD溶液進(jìn)行滴定，掃描吸收光譜.滴定時每次加入體積為10 μL，可忽略體積效應(yīng).

1.2.2 熒光光譜法

各種溶液均用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液配制，搖勻，放置5 min.在1 cm比色皿中加入3.00 mL 熒光素溶液，以Tris-HCl緩沖溶液空白為參比，用β-CD溶液進(jìn)行滴定，滴定時每次加入體積為10 μL溶液，充分?jǐn)嚢?，使?CD和熒光素的濃度比值不斷增加，掃描發(fā)射光譜.忽略體積效應(yīng)的影響.

激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5 nm，熒光激發(fā)波長λex=411.7 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜法

環(huán)糊精具有環(huán)狀中空的特殊結(jié)構(gòu)，可以通過范德華力等將填充進(jìn)空洞的客體分子絡(luò)合成單分子包合物.因此環(huán)糊精與其它分子的包合屬于典型的主-客體分子識別過程(即指主體對客體選擇性結(jié)合并產(chǎn)生某種特定功效的過程)[17].

由β-CD-FL的紫外吸收光譜見圖2(a)，由圖可知，固定FL的濃度，隨著β-CD濃度增加，F(xiàn)L的吸收峰逐漸升高，表明FL客體所在的化學(xué)微環(huán)境隨著主體β-CD的加入而發(fā)生了變化，即由極性環(huán)境進(jìn)入到β-CD疏水空腔的非極性環(huán)境而形成了包合物，在包合過程中存在著能量的轉(zhuǎn)移.

固定FL的濃度，改變β-CD的濃度，在238 nm處測定吸光度，結(jié)果如圖2(b)所示.即實驗測得β-CD與FL的包合比[18]nβ-CD:nFL=1∶1.根據(jù)Beer定律[19]：A=εbc(A為β-CD-FL的吸光度；ε為β-CD-FL的摩爾吸光系數(shù)；c為β-CD-FL濃度；b為比色皿厚度).計算得到β-CD-FL的表觀摩爾吸光系數(shù)ε=6.30×104L/(mol·cm).

圖2 (a)β-CD-FL的紫外吸收光譜，(b)β-CD-FL的摩爾比法(238 nm)Fig.2 (a)Influence of β-CD to UV-Vis absorption spectra of fluorescein (pH7.40)(b) Molar ratio plots of β-CD andfluorescein (238 nm)cFL= 2.00×10-6 mol/L; cβ-CD= 6.00×10-5 mol/L(10 μL perscan, 0～20:0～200 μL)

2.2 熒光光譜

由圖3(a)可知，固定FL的濃度，隨著β-CD濃度增加，F(xiàn)L的熒光強度逐漸降低，表明β-CD與FL分子之間發(fā)生了明顯地相互作用[20]并形成了包合物.

固定FL的濃度，改變β-CD的濃度，在516 nm處測定熒光值，結(jié)果如圖3(b)所示.即實驗測得β-CD與FL的結(jié)合比[18]nβ-CD:nFL=1∶1.該熒光光譜實驗結(jié)果與紫外可見光譜一致.

圖3 (a)β-CD對FL的熒光光譜的影響，(b) β-CD-FL的摩爾比法(516 nm)Fig. 3 (a)The Flourescence spectra curve ofβ-CD tofluorescein (pH7.40)(b) Molar ratio plots ofβ-CD andfluorescein (516 nm) cFL= 2.00×10-6 mol/L; cβ-CD= 6.00×10-5 mol/L (10 μL per scan,0～20:0～200 μL)

2.3 雙倒數(shù)法結(jié)合紫外-可見光譜法測定包合常數(shù)

Cramer最早發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精能影響有機分子的UV-vis 光譜，并提出這種光譜變化是環(huán)糊精空腔內(nèi)的高電子密度誘導(dǎo)客體分子電子發(fā)生移動的結(jié)果.根據(jù)Benesi-Hildebrand觀點，如果β-CD與FL形成1∶1包合物，在[β-CD]>[FL]的情況下，F(xiàn)L吸收強度的變化值ΔA 同β-CD濃度的關(guān)系式為：

(1)

公式中A0，A分別為β-CD存在和不存在時溶液的吸光強度，α為常數(shù)，cβ-CD為β-CD的濃度，Kf是包合常數(shù).采用熱力學(xué)方法來分析β-CD與FL的包合作用，有助于我們進(jìn)一步理解它們的作用情況.分別在291.15 K和人體溫度310.15 K恒溫條件下研究β-CD與FL包合物的作用，并作了雙倒數(shù)圖4.如圖所示，良好的線性關(guān)系說明β-CD以1∶1的比例包合了熒光素.

計算得到包合常數(shù)Kf,18℃=7.21×105L/mol,Kf,37℃=5.36×106L/mol.再聯(lián)用公式：

lnK2?/K1?=-ΔrHm?(1/T2-1/T1)/R

(2)

ΔrGm?=-RTlnK?

(3)

ΔrGm?=ΔrHm?-TΔrSm?

(4)

圖4 雙倒數(shù)法Fig.4 Double reciprocal method(pH=7.40,18 ℃、37 ℃) cFL= 2.00×10-6 mol/L

計算得到ΔrHm?=7.93×104J/mol，ΔrHm?為正值，說明包合作用是吸熱過程，溫度適當(dāng)升高有利于包合作用的進(jìn)行；ΔrGm?291.15 K=-3.27×104J/mol，ΔrGm?310.15 K=-4.00×104J/mol推測β-CD與FL的包合作用有自發(fā)進(jìn)行的可能；ΔrSm?291.15 K=384.68 J/(mol·K)，ΔrSm?310.15 K=384.65 J/(mol·K)，由此可知，β-CD與FL的相互作用為熵所驅(qū)動.

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖5包合物的紅外吸收光譜與FL與β-CD物理混合物的紅外吸收光譜相比較，峰形變寬，峰強度下降，說明二者確實形成了包合物，不是簡單的物理混合.主體分子β-CD原有的O-H伸縮振動3 650～3 200 cm-1，在形成包合物后，峰強度降低，向高頻方向移動，可能是由于FL阻礙了β-CD內(nèi)氫鍵的形成；在1 642 cm-1處的C=O伸縮振動，由于與苯環(huán)發(fā)生共軛效應(yīng)加強，向低頻方向移動至1 592 cm-1；β-CD的C-O-C在1 150～1 060 cm-1伸縮振動向高波數(shù)方向移動.

圖5 樣品的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of samplesa.熒光素和β-環(huán)糊精包合物；b.熒光素和β-環(huán)糊精混合物

2.5 X射線粉末衍射圖譜分析

圖6為FL與β-環(huán)糊精的包合物以及混合物的XRD圖譜.從圖中可以看出最強峰的位置發(fā)生了改變，并且強度也改變了，包合物中出現(xiàn)了新的最強峰峰位和其它峰位，同時，強度發(fā)生了改變，因此FL與β-環(huán)糊精的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，生成了包合物.

圖6 樣品的X射線粉末衍射圖譜Fig.6 X-ray powder diffraction of samplesa.熒光素與β-環(huán)糊精的包合物 b.熒光素與β-環(huán)糊精的混合物

3 結(jié) 論

論文綜合運用了紫外光譜法、熒光光譜法、熱力學(xué)方法等，在生理pH 7.40環(huán)境下，研究了小分子熒光素與β-CD的包合作用.熒光素分子結(jié)構(gòu)較小，與β-CD能通過超分子作用力結(jié)合形成包合物，被包埋在β-CD空腔內(nèi)，熒光素與β-CD以1∶1摩爾比形成包合物，包合常數(shù)Kf,18℃=7.21×105L/mol.熱力學(xué)函數(shù)ΔrHm?=7.93×104J/mol,ΔrHm?為正值，說明包合作用為吸熱過程；ΔrGm?291.15 K=-3.27×104J/mol，推測β-CD與FL的包合作用有自發(fā)進(jìn)行的可能；ΔrSm?291.15 K=384.68 J/(mol·K)m，由此可知，β-CD與FL的相互作用為熵所驅(qū)動.研究β-CD與熒光素的包合作用，無論對已有抗癌藥物的改良還是新的抗癌藥物的研發(fā)都具有重要意義；還可以為進(jìn)一步研究生物受體選擇性結(jié)合底物提供依據(jù)，對抗癌藥物的研究與開發(fā)改良將具有一定的理論指導(dǎo)意義.

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Biography：LI Hong-bo,male,born in 1978,lecturer,docter,anti-tumor drug and biochemical analysis.

The Clathration between Fluorescein and β-cyclodextrin

LI Hong-bo1,2*, TANG Yong-qiong1,2, WANG Su-qin1,2*,WANG Dan3, WANG Xing-ming3

(1.Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule,Ministry of Education,Nanchang 330022,China;2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China;3.School of Materials Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

The clathration between the small-molecule fluorescence and β-cyclodextrin in physiological pH environment (pH7.40) was studied with UV spectra,fluorescence spectra and double reciprocal method.The result showed that fluorescence and β-cyclodextrin formed a inclusion complex with binding rationβ-CD:nFL=1∶1,and the molor absorptivity of ε=6.30×104L/(mol·cm)by molar ratio method.The binding constant ofK?18℃=7.21×105L/mol was confirmed by double reciprocal method.The followings were calculated by the thermodynamic analysis method:(1)ΔrHm?=7.93×104J/mol,in whichΔrHm?is positive,indicating an endothermic reaction; (2)ΔrGm?291.15K=-3.27×104J/mol,suggesting that the interaction of β-cyclodextrin withfluorescein spontaneously; (3)ΔrSm?291.15K=384.68 J/(mol·K),from which entropy worked as driven force in this action.β-cyclodextrin-fluorescein was synthesized and characterized by fourier transform infrared spectrometer and X-ray diffractometer.6figs.,20refs.

fluorescein,β-cyclodextrin,inclusion complex,clathration

2017-03-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：21565015，21663014)；江西省教育廳基金資助項目(編號：GJJ150363)；湖南大學(xué)化學(xué)生物與計量學(xué)國家重點實驗室開放基金(編號：Z2015022)；功能有機小分子教育部重點實驗室開放基金(編號：KLFS-KF-201425)

黎泓波(1978-)，男，江西高安人，講師，博士，研究方向：抗腫瘤藥物研究及生化分析. *通訊作者，E-mail:lihongbo112@126.com,wangsuqin163@163.com

10.3969/j.issn.2095-7300.2017.02-025

TB34；O613.7

A