超聲輔助美拉德反應(yīng)提高大豆蛋白凍融性質(zhì)

張澤宇 張?jiān)娪?于 潔 王喜波 江連洲 徐 日

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

超聲輔助美拉德反應(yīng)提高大豆蛋白凍融性質(zhì)

張澤宇 張?jiān)娪?于 潔 王喜波 江連洲 徐 日

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

為了提高大豆蛋白的凍融性質(zhì)，試驗(yàn)采用超聲輔助美拉德反應(yīng)的方法改性大豆蛋白，以改性產(chǎn)物的乳化性質(zhì)和乳析指數(shù)為考核指標(biāo)，研究大豆分離蛋白與葡聚糖(SPI∶D)質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、超聲功率、反應(yīng)時(shí)間對(duì)改性產(chǎn)物凍融性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，SPI∶D為2∶3、反應(yīng)溫度80 ℃、超聲功率500 W、反應(yīng)時(shí)間40 min時(shí)，改性產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性較好，SPI-D接枝物與對(duì)照SPI相比，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了39.89%和43.80%，經(jīng)1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)分別降低了57.76%、75.33%、96.20%，在1、2、3次凍融循環(huán)后乳液粒徑分別降低了34.04%、42.12%、126.9%。

超聲波 大豆分離蛋白 乳化性 乳析指數(shù) 粒徑

大豆蛋白因具有較高營養(yǎng)價(jià)值和良好的功能特性在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。大豆蛋白具有表面活性，在食品體系中常被用作乳化劑[1]。許多食品在生產(chǎn)加工及貯存過程中都要經(jīng)過冷凍-解凍處理，例如冰激淋、植物奶油、蛋黃醬等。蛋白質(zhì)作為乳化劑制備的乳液在進(jìn)行冷凍時(shí)，隨著溫度的降低，水相形成冰晶體，體積膨脹，介質(zhì)被濃縮，當(dāng)達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，產(chǎn)生沉淀。冰晶體的增多，間隙中的乳液粒子被擠壓形成聚結(jié)體，當(dāng)乳液融化時(shí)，很難恢復(fù)成原來的分散狀態(tài)，進(jìn)而表現(xiàn)出絮凝、聚結(jié)、乳析、奧氏熟化，最終導(dǎo)致油相水相分離，乳液凍融穩(wěn)定性較差[2-4]。

孫煒煒[5]利用干法糖基化反應(yīng)得到乳清分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，將其作為乳化劑制備的乳液經(jīng)過凍融循環(huán)處理后，粒徑無明顯增加，沒有出現(xiàn)脂肪上浮、絮凝、聚結(jié)等不穩(wěn)定現(xiàn)象。Xu等[6]采用乳清分離蛋白和葡聚糖通過干法制備接枝產(chǎn)物Ⅰ(80 ℃，2 h)和產(chǎn)物Ⅱ(60 ℃，5 d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖基化產(chǎn)物Ⅱ由于接枝程度高，比產(chǎn)物Ⅰ的凍融穩(wěn)定性好。孫洪蕊等[7-8]通過濕法糖基化得到的大豆分離蛋白-葡聚糖接枝物凍融前后乳化性顯著提高。竇超然等[9]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白與麥芽糊精濕法接枝物凍融后分層系數(shù)和出油率顯著降低。在前面學(xué)者研究的基礎(chǔ)上本試驗(yàn)采用超聲輔助美拉德反應(yīng)進(jìn)一步改善大豆蛋白的凍融性質(zhì)，加快反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時(shí)間。以乳化性和1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究制備高凍融穩(wěn)定性的大豆分離蛋白,以期為其在冷凍食品行業(yè)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉：哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.45%)：堿溶酸沉法自制；葡聚糖4萬：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆油：九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)：Biotopped公司。

1.2 主要儀器

ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機(jī)：德國Christ公司；XH-2008D超聲波合成萃取儀(探頭直徑：8 mm，超聲波頻率：25 kHz)：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；T18 Basic高速分散機(jī)：德國IKA公司；TU-1800紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀：英國Malvern公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲SPI-D的制備

將大豆分離蛋白與葡聚糖按一定比例(2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3)溶解于0.01 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，配成蛋白質(zhì)量濃度為40 mg/mL的溶液，室溫下攪拌2 h后置于4 ℃冰箱中過夜。取出平衡至室溫，取蛋白樣品溶液100 mL置于超聲反應(yīng)器中，預(yù)熱到超聲波合成萃取儀設(shè)定的溫度(70、75、80、85、90 ℃)，以一定功率(200、300、400、500、600 W)處理一定時(shí)間(20、30、40、50、60 min)，冰水浴冷卻5 min使反應(yīng)停止。反應(yīng)液在4 000 r/min下離心10 min，上清液即為超聲SPI-D接枝物，于蒸餾水中透析24 h，冷凍干燥制成凍干粉。

1.3.2 乳化性測(cè)定

將凍干蛋白樣品溶解于0.2 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。蛋白溶液與大豆油按體積比3∶1混合，11 000 r/min均質(zhì)1 min形成乳化液，分別在均質(zhì)后0和10 min時(shí)，在混合液底部取100 μL加入到10 mL 0.1% SDS溶液中，混合均勻于500 nm處測(cè)定吸光值[10]，以0.1% SDS溶液為空白。乳化活性(EAI)表示為：

式中：EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積/m2/g；T=2.303；N是稀釋倍數(shù)100；φ是體系中油相所占體積分?jǐn)?shù)0.25；C是蛋白質(zhì)的濃度/g/mL；L是比色池光徑1 cm。

乳化穩(wěn)定性(ESI)表示為：

式中：A0為0 min時(shí)的吸光值；A10為10 min時(shí)的吸光值；ΔT為時(shí)間差10 min。

1.3.3 乳液制備

將凍干蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL。蛋白溶液與大豆油按體積比9∶1混合，11 000 r/min均質(zhì)3 min形成粗乳液，再超聲處理6 min，形成微乳液[11-12]。

1.3.4 乳析指數(shù)測(cè)定

參考Taherian等[13]的方法，新鮮制備的乳液立即轉(zhuǎn)移到10 mL塑料管內(nèi)，在-18 ℃冷凍保存22 h，取出后20 ℃水浴解凍2 h，連續(xù)進(jìn)行3次凍融循環(huán)。用刻度尺測(cè)量底部乳清層高度和乳液總高度，按下式計(jì)算乳液1、2、3次凍融循環(huán)后的乳析指數(shù)。

式中：HS表示乳清層高度/cm；HT表示乳液總高度/cm。

1.3.5 粒徑測(cè)定

將乳液分散在1 000 mL去離子水中使遮光率超過10%，設(shè)定顆粒折射率為1.460，分散劑折射率為1.330，采用激光粒度分析儀測(cè)定0、1、2、3次凍融循環(huán)后乳液的體積平均粒徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI與葡聚糖的質(zhì)量比對(duì)超聲SPI-D凍融穩(wěn)定性的影響

在反應(yīng)溫度80 ℃，超聲功率400 W，反應(yīng)時(shí)間30 min下，研究不同SPI∶D質(zhì)量比對(duì)超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)的影響。

圖1 SPI:D質(zhì)量比對(duì)超聲SPI-D乳化性的影響

圖2 SPI:D質(zhì)量比對(duì)超聲SPI-D乳析指數(shù)的影響

由圖1可知，隨著葡聚糖添加量的增加，超聲SPI-D乳化性呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，乳化活性在1∶1時(shí)最大，乳化穩(wěn)定性在2∶3時(shí)最大，二者達(dá)到最大值后略有下降。SPI制備的乳液在凍融過程中脂肪球與連續(xù)相之間出現(xiàn)密度差，脂肪球上浮，發(fā)生乳析現(xiàn)象。從圖2可以看出，SPI乳液凍融循環(huán)后乳析指數(shù)急劇增大，而超聲SPI-D乳液在1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)有了很大程度的降低。隨著糖添加比例的增加乳析指數(shù)逐漸下降，在2∶3時(shí)最小，后來增加不明顯。在超聲波作用下大豆蛋白球狀分子展開，疏水基團(tuán)不斷暴露，糖分子與蛋白質(zhì)分子碰撞機(jī)會(huì)增多，糖鏈不斷接入到蛋白質(zhì)分子中，增加了蛋白質(zhì)的溶解性[14]，同時(shí)多糖還有增稠作用，增加乳液中未冷凍的水的量和水相的黏度，使油滴運(yùn)動(dòng)變慢，降低油滴聚結(jié)現(xiàn)象的發(fā)生[15]，因而改性產(chǎn)物凍融穩(wěn)定性和乳化性顯著增加。當(dāng)葡聚糖含量繼續(xù)增加，反應(yīng)體系黏度過大，分子流動(dòng)性差，不利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行[16]。綜合考慮其乳化性和乳析指數(shù)以及葡聚糖成本問題，選取SPI與葡聚糖的質(zhì)量比為2∶3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。孫洪蕊等[7]和竇超然等[9]優(yōu)化得到蛋白質(zhì)與葡聚糖質(zhì)量比分別為1∶3和1∶2，與之相比本試驗(yàn)糖的添加量減少了，降低了成本。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)超聲SPI-D凍融穩(wěn)定性的影響

在SPI∶D質(zhì)量比2∶3，超聲功率400 W，反應(yīng)時(shí)間30 min下，研究不同反應(yīng)溫度對(duì)超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)的影響。

從圖3中可以看出，超聲SPI-D的乳化穩(wěn)定性隨著溫度的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，在溫度為80 ℃時(shí)最大，超過該溫度后急劇下降。而在75～85 ℃間乳化活性增加不是很顯著，當(dāng)溫度增大到90 ℃時(shí)下降明顯。由圖4可知，在反應(yīng)溫度80 ℃

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)超聲SPI-D乳化性的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)超聲SPI-D乳析指數(shù)的影響

時(shí)乳析指數(shù)最低，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)其乳析指數(shù)又顯著增大。在一定范圍內(nèi)隨溫度升高，SPI分子結(jié)構(gòu)展開，柔韌性增加，與葡聚糖美拉德反應(yīng)速度加快，改性產(chǎn)物親水性增大從而導(dǎo)致乳化性和凍融穩(wěn)定性提高。當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到85 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，改性產(chǎn)物界面活性降低，同時(shí)也由于過多的糖鏈引入而失去油水平衡[17]，乳化性和凍融穩(wěn)定性下降，這與Wu等[18]得到的結(jié)果一致。綜合考慮乳化性和乳析指數(shù)，選取反應(yīng)溫度為80 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。孫洪蕊等[7]和竇超然等[9]最佳反應(yīng)溫度分別為95和90 ℃。與二者相比，本試驗(yàn)在超聲波輔助下糖基化反應(yīng)溫度降低到80 ℃。

2.3 超聲功率對(duì)超聲SPI-D凍融穩(wěn)定性的影響

在SPI∶D質(zhì)量比2∶3，反應(yīng)溫度80 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min下，研究不同超聲功率對(duì)超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)的影響。

由圖5可知，在200～500 W范圍內(nèi)隨著超聲功率的增加超聲SPI-D乳化性呈直線增加的趨勢(shì)，當(dāng)超過500 W后出現(xiàn)降低。圖6中乳析指數(shù)隨超聲功率的增大而逐漸減少。SPI乳化性和凍融穩(wěn)定性與大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)變化存在著密切關(guān)系。超聲的空化效應(yīng)和機(jī)械震蕩效應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)，釋放出小分子的亞基和肽[19]，SPI分子中的α-螺旋和β-折疊明顯減少，向無規(guī)則卷曲進(jìn)行轉(zhuǎn)變，SPI分子結(jié)構(gòu)越來越疏松，游離氨基含量不斷增加，蛋白分子與糖分子間相互碰撞次數(shù)增多，加快接枝反應(yīng)進(jìn)行[20]，接枝后蛋白質(zhì)快速吸附到油水界面，形成一層蛋白保護(hù)膜，使其可以降低冷凍時(shí)產(chǎn)生的冰晶體對(duì)乳液造成的破壞，減緩液滴相互聚集而發(fā)生乳析現(xiàn)象[21]，從而乳化性和凍融穩(wěn)定性有了很大程度的提高。當(dāng)功率達(dá)到600 W時(shí)，由于功率過高會(huì)使蛋白發(fā)生聚集，體系中不溶性組分顯著增多，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均降低，但乳析指數(shù)變化不大，500 W時(shí)超聲SPI-D乳液在油水界面形已形成穩(wěn)定的二相體系，進(jìn)一步增加功率對(duì)其凍融穩(wěn)定性影響不大。綜合考慮應(yīng)選取500 W進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 超聲功率對(duì)超聲SPI-D乳化性的影響

圖6 超聲功率對(duì)超聲SPI-D乳析指數(shù)的影響

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)超聲SPI-D凍融穩(wěn)定性的影響

在SPI∶D質(zhì)量比2∶3，反應(yīng)溫度80 ℃，超聲功率500 W下，研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)的影響。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)超聲SPI-D乳化性的影響

由圖7可知，對(duì)前面3個(gè)因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，反應(yīng)時(shí)間增加到40 min后，繼續(xù)延長時(shí)間改性產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性變化不明顯。在40 min時(shí)乳化活性最大，乳化穩(wěn)定性在50 min時(shí)最大。由圖8可知，超聲SPI-D制備的乳液凍融后乳析指數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間的延長先降低后升高，在40 min時(shí)乳析指數(shù)最小。綜合考慮選取40 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。孫煒煒[5]研究乳清分離蛋白與葡聚糖接枝物凍融穩(wěn)定性時(shí)，采用干法美拉德反應(yīng)，需要時(shí)間一周左右。孫洪蕊等[7]在濕法美拉德反應(yīng)提高大豆蛋白凍融前后乳化性中優(yōu)化出最佳時(shí)間4 h。竇超然等[9]研究大豆分離蛋白與麥芽糊精濕法糖基化反應(yīng)，以分層系數(shù)和出油率為指標(biāo)，最優(yōu)時(shí)間為3 h。本試驗(yàn)在超聲波輔助作用下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，大豆分離蛋白凍融穩(wěn)定性顯著提高，同時(shí)反應(yīng)時(shí)間縮短至40 min，提高了反應(yīng)效率。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)超聲SPI-D乳析指數(shù)的影響

2.5 單因素相關(guān)性分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用SPSS19.0軟件對(duì)4個(gè)因素與乳化活性、乳化穩(wěn)定性和乳析指數(shù)間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，為下一步優(yōu)化試驗(yàn)做準(zhǔn)備。相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)表示，用*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。由表1可知，對(duì)乳化活性影響較大的因素為超聲功率和反應(yīng)時(shí)間，而乳化穩(wěn)定性影響較大的為SPI∶D質(zhì)量比、超聲功率和反應(yīng)時(shí)間。超聲功率對(duì)乳析指數(shù)高度負(fù)相關(guān)，反應(yīng)溫度對(duì)其正相關(guān)。

表1 4個(gè)因素與指標(biāo)間相關(guān)性分析

2.6 不同樣品凍融穩(wěn)定性

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，較優(yōu)的試驗(yàn)組合條件為：SPI∶D質(zhì)量比2∶3、反應(yīng)溫度80 ℃、超聲功率500 W、反應(yīng)時(shí)間40 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)定SPI、SPI+D混合物(SPI與葡聚糖按質(zhì)量比2∶3混合溶于磷酸鹽緩沖液，再冷凍干燥制成凍干粉)2個(gè)對(duì)照組。乳化性和乳析指數(shù)結(jié)果如表2所示。粒度分布是影響乳析的主要因素，乳析指數(shù)與粒徑呈正相關(guān)，粒徑越大，上浮速度越快，乳析指數(shù)也越大[22]。不同樣品凍融循環(huán)后粒徑見表3。

加入葡聚糖后SPI乳化性略有提高，超聲SPI-D改性產(chǎn)物與SPI相比乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了39.89%、43.80%。2個(gè)對(duì)照組隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加乳析指數(shù)急劇增加，超聲SPI-D隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加乳析指數(shù)增幅不大，與SPI對(duì)照組相比在1、2、3次凍融循環(huán)后乳析指數(shù)分別降低了57.76%、75.33%、96.20%。制備的新鮮乳液粒徑大小順序?yàn)槌昐PI-D>SPI+D混合物>SPI。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，SPI、SPI+D混合物乳液的粒徑增加顯著，且SPI乳液的增加幅度大于SPI+D混合物，葡聚糖的加入在一定程度上減緩了粒徑的增加。而超聲SPI-D制備的乳液在經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)后，粒徑變化不明顯。與SPI對(duì)照組相比，超聲SPI-D在1、2、3次凍融循環(huán)后乳液粒徑分別降低了34.04%、42.12%、126.9%，和乳析指數(shù)結(jié)果一致。說明通過超聲波輔助大豆分離蛋白與葡聚糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)來提高其凍融穩(wěn)定性的方法是可行的。

表2 不同樣品乳化性和凍融循環(huán)后乳析指數(shù)

表3 不同樣品凍融循環(huán)后粒徑

3 結(jié)論

利用超聲波輔助美拉德反應(yīng)技術(shù)能有效提高大豆分離蛋白的凍融穩(wěn)定性，并縮短改性時(shí)間、提高改性效率、節(jié)省了能源、降低了成本，為冷凍食品專用大豆蛋白的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供新思路和技術(shù)依據(jù)。

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Improving Freeze-Thaw Stability of SPI by Uultrasonic-Glycosylation

Zhang Zeyu Zhang Shiyu Yu Jie Wang Xibo Jiang Lianzhou Xu Ri

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030)

In order to improve the freeze-thaw stability of soybean protein isolate, the soybean protein isolate was modified by ultrasonic assisted wet glycosylation, emulsifying properties and creaming index as evaluation indexes to study the mass ratio of SPI to dextran (SPI∶D), reaction temperature, ultrasonic power, reaction time on the freeze-thaw stability of glycosylation products. Results showed that under the condition of SPI∶D ratio 2∶3, reaction temperature 80 ℃, ultrasonic power 500 W, reaction time 40 min, the freeze-thaw stability of glycosylation products attained the optimal level. Compared with the control SPI, the emulsifying activity index and emulsifying stability index increased by 39.89% and 43.80%, the creaming index decreased by 57.76%, 75.33% and 75.33%, and the particle size of emulsions decreased by 34.04%, 42.12%, 126.9% after the first, second and third time of freeze-thaw cycle.

ultrasonic wave, soybean protein isolate, emulsifying properties, creaming index, particle size

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃(WB13C10201)，國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-04-PS25)，“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2014BAD22B01)

2015-12-30

張澤宇，男，1991年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

王喜波，男，1975年出生，副教授，糧食、油脂及植物蛋白工程

TS201.2

A

1003-0174(2017)06-0063-06