益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料的研究與開(kāi)發(fā)

孫達(dá)鋒，張衛(wèi)明，張鋒倫，朱昌玲，沈嬌嬌(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料的研究與開(kāi)發(fā)

孫達(dá)鋒，張衛(wèi)明，張鋒倫，朱昌玲，沈嬌嬌
(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

選用銀杏果作為原料，通過(guò)植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵(其菌種比例為1∶1∶3)。主要研究銀杏汁的發(fā)酵液濃度，飲料體系穩(wěn)定方法以及發(fā)酵過(guò)程中的參數(shù)，如pH，溫度以及活菌數(shù)等。通過(guò)對(duì)益生菌發(fā)酵銀杏汁的感官及口感的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)銀杏果與水的比例為1∶10時(shí)最佳。為獲得體系穩(wěn)定的銀杏汁，加入中溫淀粉酶和中性蛋白酶水解。通過(guò)在不同溫度下使用乳酸菌發(fā)酵銀杏汁，得到最適宜銀杏汁發(fā)酵的溫度為40 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 h，乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的pH趨于穩(wěn)定，在3.47左右，初始活菌數(shù)為2×106cfu/mL，其最大活菌數(shù)為10 h時(shí)達(dá)到，為4.7×107cfu/mL，得到香味濃郁，質(zhì)地細(xì)膩，酸味適中以及顏色乳黃的益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料產(chǎn)品。

銀杏果；益生菌；發(fā)酵；生產(chǎn)工藝

銀杏果是銀杏科銀杏屬植物的果實(shí)。其營(yíng)養(yǎng)豐富，據(jù)報(bào)道含淀粉62.4%，蛋白11.3%，脂肪2.6%，蔗糖5.2%，還原糖1.1%，核蛋白0.26%，礦物質(zhì)3.0%，粗纖維1.2%[1]。銀杏果不僅富含銀杏酸、銀杏酚、銀杏醇、銀杏黃素、銀杏黃酮、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵、鎂、鉀、胡蘿卜素、維生素等，還含有內(nèi)酯、膽固醇、聚戊醇等有效成分[2]。銀杏果中含有的銀杏黃酮具有清除自由基的功能，延緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能夠舒張血管平滑肌，改善心腦等器官循環(huán)。白果酸還能抑制一些皮膚真菌和結(jié)核桿菌[3]。并且銀杏果中的白果酚具有降壓作用。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，銀杏具有美容功能[4]。據(jù)《本草綱目》和《本草再新》記載，銀杏可食可入藥。食則補(bǔ)心養(yǎng)氣，益腎潤(rùn)肺，澀精固元，延年益壽；入藥可止咳平喘[5]。因此銀杏果不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還有較高藥用價(jià)值。我國(guó)具有豐富的銀杏資源，對(duì)于銀杏的開(kāi)發(fā)利用也有了很大的發(fā)展。近年來(lái)不僅有白果糕點(diǎn)，銀杏月餅的制備，還有白果罐頭，銀杏汁，銀杏果茶的生產(chǎn)。銀杏果富含碳水化合物，可以作為優(yōu)質(zhì)的釀酒原料[5]。另外還發(fā)展出以銀杏汁為原料，與銀耳，紅棗等配成的銀杏蛋白露和銀杏棗汁等[6]。

益生菌對(duì)人體具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。其生長(zhǎng)于人體腸道及生殖系統(tǒng)內(nèi)，有助于維持人體健康以及改善人體微生態(tài)的平衡，是對(duì)人體有益的一類微生物[7]。如雙歧桿菌，嗜熱鏈球菌，植物乳桿菌等。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，益生菌對(duì)人體具有一系列的作用。益生菌可以改善和促進(jìn)人體腸道健康，增強(qiáng)人體的免疫力，緩解乳糖不耐受患者的癥狀，降低人體內(nèi)的膽固醇，幫助人體產(chǎn)生所需的維生素，從而增強(qiáng)人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用以及降低各種疾病的發(fā)病率，如腫瘤，肝損傷，結(jié)腸癌等[8]。據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，目前益生菌70%用于乳制品的生產(chǎn)中，如酸奶，奶酪，干酪，乳酸菌飲料以及冰淇淋等。但一部分人對(duì)于奶制品中的乳糖具有不耐受性，在飲用奶制品后會(huì)出現(xiàn)腹痛，腹瀉等情況。目前人們也開(kāi)始尋求益生菌的其他發(fā)酵載體，如蔬菜，水果以及谷物等。還發(fā)展出發(fā)酵型泡菜，發(fā)酵型肉制品和醫(yī)藥保健品等。如日本的一種酪酸梭菌活菌制劑，因?qū)δc道疾病的療效優(yōu)于很多制劑，很快躍居我國(guó)消化科用藥第五位[9]。以及通過(guò)嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧、大腸桿菌發(fā)酵的德國(guó)藥物制劑Omniflora等[10]。

由于銀杏果中的營(yíng)養(yǎng)成分多樣，含有豐富的淀粉，蛋白質(zhì)和糖類等，在加入益生菌發(fā)酵后，其可以充分利用銀杏果中的物質(zhì)，轉(zhuǎn)化為更利于人體吸收的成分。一方面補(bǔ)給了人體所需的益生菌數(shù)，維持人體微生物群的平衡，另一方面銀杏果所具有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也有利于人體健康。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)益生菌發(fā)酵銀杏果這方面的研究也并不完善。因此，本研究對(duì)銀杏果新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏果：市購(gòu)。

菌種：植物乳桿菌(1株)，保加利亞乳桿菌(1株)，嗜熱鏈球菌(3株)(益菌加)。

培養(yǎng)基：MRS(Man Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基

蛋白胨 10.0 g

牛肉粉 5.0 g

酵母粉 4.0 g

葡萄糖 20.0 g

吐溫80 1.0 mL

K2HPO4·7H2O 2.0 g

醋酸鈉·3H2O 5.0 g

檸檬酸三銨 2.0 g

MgSO4·7H2O 0.2 g

MnSO4·4H2O 0.05 g

瓊脂粉 15.0 g

將上述成分加入到1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，調(diào)至到pH6.2左右，分裝后于121 ℃高壓滅菌15～20 min。

儀器：YQ-3型海鷗牌勻漿機(jī)(江蘇省江陰縣祝塘儀器廠)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴器(金壇市江南儀器廠)；JJ-1大功率攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)；20PR-52D離心機(jī)(日立工機(jī)株式會(huì)社)；pHS-25型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；SPX-70BⅢ生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SW-CJ-1F超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Olympus BH-2顯微鏡(奧林巴斯光學(xué)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 銀杏汁制備流程

銀杏果去殼、銀杏果煮沸、去皮、制漿、勻漿、煮沸滅菌、酶解、高溫滅酶、過(guò)濾或離心、冷卻、發(fā)酵。

1.2.2 銀杏汁的發(fā)酵

將制備得到的銀杏漿汁，放入三角瓶中，加入1%的乳酸菌于水浴鍋中密閉發(fā)酵，即200 mL銀杏汁，加入0.2 g的乳酸菌制劑。

1.2.3 發(fā)酵過(guò)程中不同溫度下pH的測(cè)定

在不同溫度下(30，35，40，45，50 ℃)于不同時(shí)間下(0，2，4，6，8 h)，用pH計(jì)測(cè)定乳酸菌發(fā)酵銀杏汁飲料的pH值。

1.2.4 最適溫度下不同時(shí)間pH的變化

在最適溫度下，于水浴鍋中發(fā)酵，測(cè)定(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)下銀杏汁的pH值。

1.2.5 最適條件下發(fā)酵銀杏汁中活菌數(shù)的檢測(cè)

將最適條件下發(fā)酵的銀杏汁，于(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)取樣，在超凈工作臺(tái)中，取1 mL樣品到離心管中，用1 mL移液槍取900 μL無(wú)菌水于另一滅菌過(guò)的離心管中，后加入100 μL樣品，以此方法，逐漸10倍稀釋。根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選取2～3個(gè)稀釋度，進(jìn)行涂板。每個(gè)稀釋度吸取100 μL稀釋液分別置于MRs平板中，使用L型玻棒進(jìn)行涂布。后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)后計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。隨機(jī)挑取5個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，并做過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。鏡檢時(shí)看到的是革蘭氏陽(yáng)性(被染成紫色)無(wú)芽孢球菌或桿菌。同時(shí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性無(wú)芽孢桿菌或球菌可判定為乳酸菌[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀杏汁中加水量對(duì)乳酸菌發(fā)酵銀杏汁飲料的影響

銀杏果與水的添加比例的不同，會(huì)對(duì)銀杏汁飲料的穩(wěn)定性，口感，質(zhì)感以及色澤產(chǎn)生很大的影響[12]。表1是關(guān)于水的添加量不同導(dǎo)致的銀杏汁的區(qū)別。

表1 不同加水量的銀杏汁的區(qū)別

因此，較適合于益生菌發(fā)酵銀杏飲料的銀杏果與水的比例為1∶10。

2.2 均質(zhì)對(duì)銀杏汁飲料澄清度的影響

均質(zhì)可以使銀杏漿汁中的銀杏顆粒降至顯微水平，使其中不溶性的大顆粒物質(zhì)的粒度減少，從而減少各個(gè)組分的沉降系數(shù)[13]，獲得更為穩(wěn)定的銀杏汁液。進(jìn)而解決銀杏果在榨汁后出現(xiàn)的顆粒過(guò)大，沉淀渾濁和分層的現(xiàn)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)均質(zhì)勻漿后的銀杏汁要明顯澄清，在加熱后其糊化分層現(xiàn)象明顯減弱。

2.3 淀粉酶對(duì)澄清型銀杏汁飲料的影響

由于銀杏中的淀粉含量高達(dá)62.4%，在加熱糊化以及發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的沉淀，嚴(yán)重影響了銀杏汁的口味，形態(tài)和外觀品質(zhì)。因此在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)加入1%的中溫淀粉酶于75 ℃下反應(yīng)2 h后，其澄清度會(huì)稍有改善，并且在加入益生菌后，它在發(fā)酵過(guò)程中的沉淀會(huì)減少，靜置穩(wěn)定性顯著提高。

2.4 蛋白酶對(duì)澄清型銀杏汁飲料的影響

經(jīng)過(guò)淀粉酶水解過(guò)后的銀杏汁在乳酸菌的發(fā)酵下，于6 h后依然會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，澄清度下降。根據(jù)分析，由于銀杏果中含有的11%的蛋白質(zhì)，在乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的過(guò)程中，產(chǎn)生大量的乳酸，pH值下降，使得銀杏果漿汁中的蛋白質(zhì)變性，析出，產(chǎn)生絮狀沉淀，嚴(yán)重影響了銀杏汁的發(fā)酵后的質(zhì)地和口感。通過(guò)加入銀杏果量(去殼去皮)1%的中性蛋白酶于50 ℃水浴鍋中酶解3～6 h，并過(guò)濾后發(fā)現(xiàn)銀杏汁稍顯澄清。在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中并未出現(xiàn)沉淀分層現(xiàn)象。甚至直到20 h后，也未出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，靜置穩(wěn)定性良好。這是由于中性蛋白酶在中性條件下可以迅速的分解蛋白質(zhì)類物質(zhì)。從而使得益生菌發(fā)酵的銀杏汁飲料的澄清度增加。

2.5 不同溫度下乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的pH變化

在一系列溫度梯度下(30，35，40，45，50 ℃)發(fā)酵銀杏汁，每隔2 h用pH計(jì)測(cè)定其pH值。

圖1 不同溫度下乳酸菌發(fā)酵銀杏果汁過(guò)程中pH隨時(shí)間的變化

由圖1可見(jiàn)，銀杏汁發(fā)酵之前，其pH值處于中性，約為6.4左右。在加入植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌以后，其pH值在2 h內(nèi)并未發(fā)生明顯變化，大致位于6.2，這是由于乳酸菌處于生長(zhǎng)遲緩期。菌種需適應(yīng)其環(huán)境，乳酸生成較少。從圖還可以看出，在不同的溫度下，乳酸菌發(fā)酵銀杏汁時(shí)的產(chǎn)酸能力不同。在溫度為40 ℃時(shí)，銀杏汁的pH值能夠最快到達(dá)3.53。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的產(chǎn)酸能力次之，在8 h時(shí)可以達(dá)到3.85。溫度為45 ℃時(shí)，其產(chǎn)酸能力和在35 ℃下大體一致，8 h后的最終pH值為4.15。圖1中還可以看出，當(dāng)溫度為30 ℃或50 ℃時(shí)，溫度太低或太高并不利于乳酸菌的生長(zhǎng)，因此乳酸生成的速度很慢，在8 h后pH的變化仍不明顯，分別為4.47和5.43。因此，可以看出，乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的最適溫度為40 ℃，在此溫度下，其產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。

2.6 在最適溫度下益生菌發(fā)酵銀杏汁的pH變化

圖2是在最適溫度，即40 ℃下，乳酸菌發(fā)酵銀杏汁的pH隨時(shí)間的變化曲線。由圖可見(jiàn)，在0～2 h內(nèi)，pH的變化并不明顯，由最初的6.47降至6.23。隨著時(shí)間的變化，乳酸菌逐漸適應(yīng)銀杏汁的環(huán)境后，利用銀杏汁中的營(yíng)養(yǎng)快速發(fā)酵，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，乳酸快速生成，銀杏汁的pH值顯著降低，自2～8 h，其pH值由6.23降至3.53。而8 h以后，乳酸菌的發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，銀杏汁發(fā)酵液中的pH值降低速度緩慢，由10 h的3.47到12 h的3.23。由于乳酸的不斷生成，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)代謝，最終pH值趨于穩(wěn)定，在15 h和20 h時(shí)均為3.07。

圖2 乳酸菌發(fā)酵銀杏果汁過(guò)程中pH隨時(shí)間的變化

2.7 最適溫度下益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料的活菌數(shù)隨時(shí)間的變化

在最適溫度下，即40 ℃水浴鍋中，用乳酸菌發(fā)酵銀杏汁飲料，分別在(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)時(shí)取樣，進(jìn)行涂板培養(yǎng)，于48 h后計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，并染色，鏡檢。

圖3 銀杏汁發(fā)酵中活菌數(shù)的變化

細(xì)菌的生長(zhǎng)周期分為遲緩期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期和衰退期。由圖3可見(jiàn)，在0～2 h時(shí)銀杏汁中的乳酸菌處于遲緩期，其菌群數(shù)由2×106cfu/mL增長(zhǎng)到3×106cfu/mL，由于其中的乳酸菌剛剛適應(yīng)銀杏汁中的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，其需要一個(gè)短暫的適應(yīng)過(guò)程，有些菌種因?qū)ν庠诃h(huán)境敏感，無(wú)法適應(yīng)，而造成死亡。遲緩期的乳酸菌菌群數(shù)曲線平坦，菌落繁殖很少。處于遲緩期的細(xì)胞代謝活躍，體積增大，從介質(zhì)中能快速吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、ATP和其他細(xì)胞成分等[14]。2～8 h時(shí)，銀杏汁中發(fā)酵的乳酸菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，期間，細(xì)胞快速分裂，這一期細(xì)胞數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增加，代時(shí)最短，細(xì)胞合成核糖體及蛋白質(zhì)增多。當(dāng)然這不僅與菌種有關(guān)，也與其環(huán)境，如溫度，pH和培養(yǎng)基成分等相關(guān)。8～12h時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。菌群數(shù)由8 h的4.2×107cfu/mL生長(zhǎng)到10 h的4.7×107cfu/mL，到達(dá)12 h時(shí)，乳酸菌菌落數(shù)維持在3.9×107cfu/mL。此時(shí)，新生的細(xì)胞數(shù)目與死亡的細(xì)胞數(shù)目相等，總菌落數(shù)達(dá)到最大值，活菌數(shù)保持恒定。銀杏汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗，無(wú)法滿足乳酸菌的生長(zhǎng)需要。而處于穩(wěn)定期的細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞的死亡率逐漸增加，最終群體中獲得細(xì)胞數(shù)目將以對(duì)數(shù)速率急劇下降，即為死亡期。為圖3中的12～20 h時(shí)，活菌數(shù)最終降低為15 h的1×107cfu/mL和20 h時(shí)的4×106cfu/mL。

3 結(jié) 論

(1)得到口感最佳，質(zhì)地細(xì)膩，色澤明亮的銀杏汁飲料，最適宜乳酸菌發(fā)酵的銀杏果與水的比例為1∶10。

(2)因銀杏果含有大量淀粉和不少蛋白質(zhì)，若直接制漿發(fā)酵，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵中產(chǎn)生沉淀分層，澄清度下降。為獲得穩(wěn)定性良好，澄清度較高的銀杏汁，需通過(guò)均質(zhì)，中溫淀粉酶水解，中性蛋白酶水解和離心過(guò)濾的方法。

(3)選用的乳酸菌為植物乳桿菌，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，菌種比例為1∶1∶3時(shí)，最適宜發(fā)酵的溫度為40 ℃，最適宜上述菌種發(fā)酵銀杏汁的時(shí)間為10 h，這時(shí)，銀杏汁的pH為3.47，而在后續(xù)的發(fā)酵中，即直到20 h時(shí)pH降低到3.00，其并不適合乳酸菌的生長(zhǎng)。而且10 h時(shí)，發(fā)酵的銀杏汁中的乳酸菌，其達(dá)到最高菌群數(shù)，即4.7×107cfu/mL，得到香味濃郁，質(zhì)地細(xì)膩，酸味適中以及顏色乳黃的益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料產(chǎn)品。

(4)后續(xù)的研究中，還需研究食品添加劑的添加對(duì)銀杏汁飲料口味的影響，還有在冷藏條件下，益生菌發(fā)酵銀杏汁飲料貯藏穩(wěn)定性的變化以及益生菌發(fā)酵過(guò)后的銀杏汁中成分的變化。

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Research and Development of Probiotic FermentedGinkgobilobaJuice Beverage

Sun Dafeng，Zhang Weiming，Zhang Fenglun，Zhu Changling，Shen Jiaojiao
(Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042，China)

Ginkgobilobawas chosen as the raw material，and fermented byLactobacillusplantarum，LactobacillusbulgaricusandStreptococcusthermophilus(the ratio of the strain was 1∶1∶3).The research aimed to study the concentration of the fermentation broth，the stability of the beverage system and the parameters in the fermentation process，such as pH，temperature and the number of viable bacteria.Through the detection of the sense and taste of the fermented juice of probiotics，it was found that the ratio ofGinkgobilobato water was 1∶10.In order to obtain the stability of ginkgo juice，add medium temperature amylase and neutral protease to hydrolize. At different temperatures by using lactic acid bacteria fermented ginkgo juice，get the most suitable ginkgo juice fermentation temperature is 40 ℃ and the fermentation time 10 h，lactic acid bacteria fermented ginkgo juice pH stabilized at around 3.47，the initial number of live bacteria is 2×106cfu/mL，the maximum number of live bacteria occurred at 10 h，4.7×107cfu/mL，get a rich flavor，delicate texture，acidity and yellow probiotic fermented ginkgo juice beverage product.

Ginkgobiloba；probiotics；fermentation；production technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.017

2016-11-12

孫達(dá)鋒(1977—)，男，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物。E-mail：sdafeng@163.com

TS275.4

A

1006-9690(2017)03-0078-05