納米管輔助紫杉醇化療口腔舌癌的增敏療效分析

牛 瑩，蔣林珊

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

納米管輔助紫杉醇化療口腔舌癌的增敏療效分析

牛 瑩，蔣林珊

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

旨在研究多壁碳納米管負載紫杉醇后對口腔舌癌SCC-15細胞的影響，探討多壁碳納米管負載紫杉醇后化療口腔舌癌的增敏療效作用。通過制備多壁碳納米管和多壁碳納米管-多烯紫杉醇載藥系統(tǒng)，分別與SCC-15口腔舌癌細胞共育，采用CCK-8檢測活性，Prestoblue檢測細胞增殖抑制率，免疫組化法檢測P53蛋白的表達，hoechst/PI雙染法檢測細胞凋亡，探討碳納米管對紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性是否提高，為臨床化療腫瘤提供了新方法。

多壁碳納米管；紫杉醇；多壁碳納米管-紫杉醇；SCC-15口腔舌癌細胞

0 引言

舌癌是人類最常見的腫瘤之一，臨床治療多以化療為主，剛開始治療效果好，但是一段時間后易復發(fā)，對人體健康危害嚴重。治療舌癌的化療藥中，以新型抗腫瘤藥物多烯紫杉醇最為有效，但多烯紫杉醇（Paclitaxel）水溶性差，口服生物利用度不高，多以靜脈注射進行治療，臨床注射劑應用時，其溶劑毒性較大，干擾藥效[1]。所以迫切需要研制生物利用度高、毒性低的多烯紫杉醇新劑型，以提高其臨床療效。多壁碳納米管為一種中間空心的管腔，有很大的比表面積，對多種藥物有較強的負載能力，和很好的細胞滲透能力，可運載化療藥物進入細胞或組織，在此過程中，并不影響藥物的性能，且對癌細胞有很好的抑制作用，對正常細胞不會產(chǎn)生明顯的毒副作用，從而達到更好地化療口腔舌癌的效果[2]。

為提高紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性，本研究以口腔舌癌SCC-15細胞系為模型，擬用抗腫瘤藥物多烯紫杉醇負載于碳納米管上，研發(fā)一種具有臨床應用前景的載藥納米復合植入劑，通過載藥碳納米管系統(tǒng)和單純紫杉醇進行腫瘤治療的體外實驗，運用細胞生物學和分子生物學等手段，采用細胞增殖和毒性檢測、細胞周期檢測等方法，檢測紫杉醇負載于碳納米管后對腫瘤化學治療的敏感性。為臨床化療腫瘤提供新方法。

1 多壁碳納米管的制備和純化

采用化學沉淀法制備多壁碳納米管（MWCNTS），用天平稱取250 mg MWCNTs加入到250 mL的濃H2SO4和濃 HNO3混合物(體積比=3:1)中，將樣品置于超聲清洗器中進行處理5 h，10000 r/min，20 min，經(jīng)微孔濾膜抽濾，用移液槍取超純水清洗至調(diào)整PH至7.0，置于80℃條件下待其干燥至恒重后，備用。

2 多壁碳納米管-多烯紫杉醇載藥系統(tǒng)的制備

取一定量的多烯紫杉醇，加入無水乙醇溶解，再加入一定量的 MWCNTs，在探頭超聲下，慢慢加入一定量的ddH2O清洗，10000 r/min，高速離心10 min，獲取MWCNTs-多烯紫杉醇溶液；吸出上清液，加入一定量的表面活性劑，在超聲中處理2 h，10000 r/min，離心 10 min，去除游離的多烯紫杉醇和未分散的MWCNTs，得到載藥MWCNTs-多烯紫杉醇溶液，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

3 細胞培養(yǎng)、檢測及結(jié)果

3.1 SCC-15細胞培養(yǎng)與傳代

將消化液（0.25%胰蛋白酶）從冰箱中取出，加熱使其融化；打開紫外燈照射超凈工作臺30 min，用75%酒精溶液擦凈；取對數(shù)生長的SCC-15細胞，吸出舊培養(yǎng)液，加入3 mLPBS緩沖液，充分震蕩；加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化5～10 min；在倒置顯微鏡下仔細觀察培養(yǎng)瓶，待培養(yǎng)瓶中的細胞腫脹或細胞增大后停止消化；取適量DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%小牛血清），輕輕吹洗培養(yǎng)瓶底層貼有細胞的部分，使細胞脫落并分散形成細胞懸液，1000 r/mim，離心5 min；吸出離心管的上清液，加入培養(yǎng)液（含10%小牛血清）2 mL，輕輕吹打使之成為均勻的細胞懸液，進行分裝；寫上細胞的種類和日期，做好標記。稍微擰松培養(yǎng)瓶蓋，置于 37℃，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細胞生長狀況；

3.2 細胞毒性檢測

本實驗將 MWCNTs-多烯紫杉醇溶液和單純紫杉醇溶液按不同濃度分6組。按照CCK-8法，6組的濃度分別2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL，作用數(shù)小時后，計算其對SCC-15細胞生長的抑制率表示其對 SCC-15細胞的毒性。取對數(shù)生長期的SCC-15 細胞按 6×103個/孔（200 μL）接種于 96 孔培養(yǎng)板中；將培養(yǎng)板放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后分別將藥物倍比稀釋，形成6個級別的濃度。每一濃度的化療藥物設(shè)6個平行孔，每個孔加入藥物20 μL，并設(shè)立陰性對照組（只加培養(yǎng)液，無細胞和藥物），陽性對照組（有細胞和培養(yǎng)液，無藥物），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入CCK-8溶液20 μL；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；最后用酶標儀檢測450 nm處的OD值，記錄實驗結(jié)果。

抑制率=（1-實驗組的OD值/對照組的OD值）×100%

設(shè)計不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇實驗組和單純紫杉醇實驗組進行對照實驗，作用24 h后，觀察兩種藥物對SCC-15細胞生長的抑制率，由此評價兩種藥物對細胞的毒性作用。結(jié)果見圖1，藥物濃度在 4 μg/mL以下時對 SCC-15細胞的抑制率較低（＜40%），且各濃度組之間無顯著差異（P＞0.05），隨著藥物濃度的增高，抑制率的差別逐漸增大。和單純紫杉醇藥物組相比，多壁碳納米管-紫杉醇藥物組的抑制率最高，與單純紫杉醇藥物組差別顯著（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇和單純紫杉醇對細胞生長的抑制作用

3.3 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對SCC-15細胞生長的抑制

本實驗分為多壁碳納米管-紫杉醇藥物組，紫杉醇藥物組，無藥對照組，每組設(shè) 6個復孔，采用Prestoblue法檢測。取對數(shù)生長期的SCC-15細胞按6×103（200 μL/孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換DMEN-F12培養(yǎng)液；向兩藥物組加入受試藥物各 200 μL，無藥對照組加入培養(yǎng)液 200 μL，充分混勻后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h；加入Prestoblue 5 μL，10min后用酶標儀檢測560 nm處的OD值。

細胞增殖抑制率=（1-實驗組的OD值/無藥對照組的OD值）×100%

多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇均能抑制口腔舌癌SCC-15細胞增殖，與無藥對照組相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表 1，多壁碳納米管-紫杉醇對SCC-15細胞的增值抑制率比紫杉醇高6%。

表1 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對SCC-15細胞增殖的抑制率

3.4 P53蛋白檢測

取以上各組細胞（無藥對照組、紫杉醇組、MWCNTs-紫杉醇組）經(jīng) 10000 r/mim,離心后取載玻片進行細胞涂片；向每張涂片加過氧化氫溶液2 mL，室溫下孵育20 min；用PBS洗3次，每次5 min；加非免疫動物血清50 μL，室溫下孵育10 mim，再用吸管吸取PBS沖洗1次；加入50 μL的P53抗體（一抗），4℃培養(yǎng)24 h；用吸管吸取PBS沖洗3次，每次5 min；吸取50 μL生物素標記的第二抗體，加到涂片上，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；加入鏈親和素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 mim；PBS沖洗3次，每次5 min；加入100 μL新鮮配制的的DAB溶液，置顯微鏡下觀察細胞；用自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹脂封固。

免疫組化法檢測P53蛋白的表達，由圖2、圖3所示，相對于無藥對照組圖4，單純紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組均抑制突變型P53蛋白的表達，多壁碳納米管-紫杉醇組更為明顯。

圖2 培養(yǎng)24h紫杉醇組細胞突變型p53蛋白的表達（sp*200）

圖3 培養(yǎng)24 h多壁碳納米管-紫杉醇組細胞突變型p53蛋白的表達（sp*200）

圖4 培養(yǎng)24 h無藥對照組細胞突變型p53蛋白的表達（sp*200）

3.5 細胞凋亡檢測

對數(shù)生長的 SCC-15細胞2×105/孔接種于 24孔培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中24 h后，分為三組，對照組1（空白組）和對照組2分別加入10 μg/mL的無血清培養(yǎng)液，單純的多烯紫杉醇溶液，實驗組加入MWCNTs-多烯紫杉醇，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h；加入PBS洗3遍；加入5 μg/mL的hoechst33342，避光染色 10 min；加入 15 μg/mL 的 PI，避光染色 10 min；用流式細胞儀檢測熒光。

結(jié)果判斷：正常細胞為低藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光,早期凋亡細胞為高藍光/低紅光，晚期凋亡細胞高藍光/紅光。

如表2所示，空白組可見細胞核呈均勻彌散的低藍色熒光，紅色熒光少見；單純紫杉醇組除可見到低藍色熒光以外，還可見少量高藍色和紅色熒光(晚期凋亡細胞)；多壁碳納米管-紫杉醇組可見高藍色熒光（早期凋亡細胞）和部分紅色熒光（晚期凋亡細胞），由此可知紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組與空白組比較，細胞凋亡數(shù)量多，而紫杉醇組晚期細胞凋亡數(shù)較少，多壁碳納米管-紫杉醇組晚期細胞凋亡數(shù)量多，說明多壁碳納米管-紫杉醇組比紫杉醇組具有更高的誘導SCC-15口腔舌癌細胞凋亡的作用。

表2 hoechst33342、PI雙染法檢測口腔舌癌細胞SCC-15細胞內(nèi)熒光（100×）

4 討論

紫杉醇是從紅豆杉中提取出來的化合物，在化療口腔舌癌方面療效較好，但是由于其水溶性差，口服生物利用度不高，多以靜脈注射進行治療，臨床注射劑應用時，其溶毒性較大，嚴重干擾了藥效，這就限制了紫杉醇靜脈注射化療腫瘤。所以，研制生物相容性好、利用度高及毒性低的多烯紫杉醇成為當前人們的關(guān)注的焦點。目前，國內(nèi)外多烯紫杉醇新劑型的探究熱點主要集中在靶向性和水溶性兩個方面，常用的且研究較為廣泛的有脂質(zhì)體、膠束、納米粒等，這些藥物能準確地到達腫瘤病灶，并緩慢的釋放。但是這些藥物也有很大的毒副反應，如過敏反應，對心、腎及神經(jīng)也有一定程度的毒副作用等[3]。且靶向性不強，粒徑大小不穩(wěn)定，因此，粒徑大小恒定、水溶性好、藥物釋放緩慢及靶向性好的 MWCNTs-Paclitaxel制劑成為研究當前的研究熱點[4,5]。

有研究者[6]將Paclitaxel吸附到了PLGA（聚合納米粒）上，在對該聚合納米粒進行表面修飾，由此降低細胞毒性。使多烯紫杉醇在正常組織的蓄積顯著減少，使腫瘤病灶的靶向性大大提高。Mu[7]采用萃取技術(shù)制備的PLGA納米微球，其平均粒徑為納米級，這種納米級的結(jié)構(gòu)能顯著減少對正常細胞的損害。張景勍等[8]通過蒸發(fā)法制備的紫杉醇制劑，在外加磁場的作用下，可以使Paclitaxel準確的到達腫瘤病灶，提高了靶向性。本研究用沉淀法制備 MWCNTs，并將其負載于 Paclitaxel上，形成 MWCNTs-Paclitaxel溶液。進行了一系列的體外檢測試驗，以達到提高Paclitaxel的靶向性和細胞抑制率，降低毒副作用的效果。在細胞毒性試驗中，我們將MWCNTs-Paclitaxel溶液和單純的 Paclitaxel溶液分別分為 6個濃度組（2.0～64.0 μg/mL），與SCC-15細胞共育數(shù)小時后，觀察其對細胞增殖的抑制率表示表示對口腔舌癌SCC-15細胞的毒性。結(jié)果表明，兩個藥物組均能抑制細胞的增殖，當藥物濃度在 4 μg/mL以下時，對SCC-15細胞的抑制率較低（＜40%），各濃度組之間無明顯差異（P＞0.05）,隨著藥物濃度增加，抑制率差別逐漸增大，和單純的多烯紫杉醇組相比，MWCNTs-Paclitaxel組的抑制率高，與單純Paclitaxel組差別顯著（P＜0.05）,表明低濃度的MWCNTs-Paclitaxel對腫瘤細胞的毒性小，高濃度的MWCNTs-Paclitaxel對腫瘤細胞的毒性大，且有劑量依賴性，由此可知，MWCNTs-Paclitaxel有很好的靶向性。在此之前，研究者Joshi M等[9]將甲氨蝶呤與C60富勒烯和MWCNTs進行偶聯(lián)，用MTT法進行細胞毒性檢測，研究表明該復合物在一定濃度下對腫瘤細胞有很強的毒性。然而，近年來，碳納米管的生物安全性同樣引起了人們的注意。Hu S等[10]將聚乙二醇修飾的MWCNTs注射到BALBA/c小鼠體內(nèi)，與單用MWCNTs相比，小鼠的免疫功能基本不受影響。高寧寧等[11]將功能化的MWCNTs進行小鼠腹腔注射，觀察其對小鼠巨噬細胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)修飾后的MWCNTs的生物相容性大大改善。為此，為了提高碳納米管的生物相容性，減少對正常組織的損害，今后的研究還應從多種角度，用不同的方法來研究其毒理作用。

紫杉醇作為重要的化療藥物，特異性作用于細胞的G2期和M期，從而阻斷細胞的增殖。MTT法和Prestoblue法是體外檢測細胞活性常用的方法，但是因為MTT還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物水溶性低，需要溶解后才能檢測，所以選用Prestoblue檢測 MWCNTs-Paclitaxel和單純Paclitaxel對口腔舌癌SCC-15細胞生長的抑制率，結(jié)果表明：在與SCC-15細胞共育72小時后，MWCNTs -Paclitaxel和單純Paclitaxel均能抑制SCC-15細胞的增殖，且與無藥對照組相比，都具有顯著地差異性。其中，MWCNTs-Paclitaxel藥物組對SCC-15細胞的增殖抑制率比單純Paclitaxel組高6%。付旭東[12]將NGR-SWCNTs-Paclitaxel納米制劑與MCF-7細胞共育72小時后，用MTT法檢測細胞增殖抑制率，并選用了不同的細胞株進行檢測，如SMMC-7721肝癌細胞、PC-3前列腺癌細胞、EC9706食管癌細胞等，結(jié)果表明以碳納米管為載體的制劑對腫瘤細胞增殖的抑制作用與多項研究結(jié)果一致[13,14]。除了細胞活性的檢測外，我們進行了P53蛋白的表達和細胞凋亡的檢測。

P53蛋白是一種抑癌基因，當受到刺激后可突變?yōu)榘┗?，因此失活的P53基因?qū)δ[瘤的形成非常重要，并對其發(fā)生和發(fā)展有很大的影響。P53蛋白的突變與很多人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程息息相關(guān)。Bosari等[15,16]采用免疫組化法抑制大腸癌P53蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)了大腸癌預后差的原因是由于P53基因蛋白過表達。本研究采用免疫組化法，將MWCNTs-Paclitaxel和單純的多烯紫杉醇與 SCC-15細胞共育，再在顯微鏡下觀察。由于P53蛋白突變后，其半衰期變短、構(gòu)象改變，所以可以被檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩組藥物均能抑制突變型 P53蛋白的表達，以MWCNTs-Paclitaxel更為明顯。早前，柴瀟瀟[17]研究發(fā)現(xiàn) Paclitaxel可以使癌細胞凋亡。本研究采用hoechst33342/PI雙染法檢測了細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MWCNTs-Paclitaxel和單純的 Paclitaxel都能誘導細胞凋亡，但是MWCNTs-Paclitaxel較單純的Paclitaxel具有更顯著的誘導細胞凋亡的作用。還有研究者[18]認為GDF3過表達可以促進Paclitaxel誘導細胞凋亡。今后，在分子水平上探討Paclitaxel誘導SCC-15細胞凋亡的機制將成為我們的研究重點。

5 結(jié)論

紫杉醇載藥的MWCNTs對SCC-15口腔舌癌細胞有明顯的細胞增殖抑制率，能顯著的抑制P53蛋白的表達以及更顯著地誘導細胞凋亡的作用。所以可以認為和單純的紫杉醇相比，碳納米管提高了紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性，碳納米管紫杉醇載藥系統(tǒng)治療腫瘤的療效顯著提高，為臨床化療腫瘤提供了新方法。

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Nanotubes Auxiliary Paclitaxel Chemotherapy Sensitization Effect Analysis of Oral Tongue Cancer

NIU Ying, JIANG Lin-shan
(College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China)

To study on multi-walled carbon nanotubes load after paclitaxel on SCC - 15 oral tongue cancer cell, the influence of load explore multi-walled carbon nanotubes paclitaxel chemotherapy after the sensitization effect of oral tongue cancer. Through the preparation of multi-walled carbon nanotubes and multi-walled carbon nanotubes -polyene taxol drug delivery system, respectively with SCC to 15 oral tongue cancer cells produced, tested by CCK-8 testing activity, Prestoblue detection cell proliferation inhibition rate, immunohistochemical method to detect the expression of P53 protein, hoechst/PI double staining to detect apoptosis, explore carbon nanotubes on taxol oral tongue cancer chemotherapy sensitivity is improved, which provides a new way for clinical tumor chemotherapy.

multi-walled carbon nanotubes; Paclitaxel; multi-walled carbon nanotubes-Paclitaxel; oral squamous cell carcinomaSCC-15 cells

R739.8

A

1008-2395(2017)03-0063-06

2017-05-22

?，摚?974-），女，講師，博士，研究方向：口腔醫(yī)學。