炭疽芽胞桿菌A16D2株BA2380基因缺失突變株的構(gòu)建

賈書驊，陳楠，王東澍，王甜甜，馮爾玲，朱力，王恒樑，彭清忠，劉先凱

1. 吉首大學(xué)，吉首 416000； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071； 3. 沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034

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·論著·

炭疽芽胞桿菌A16D2株BA2380基因缺失突變株的構(gòu)建

賈書驊1,2,*，陳楠2,3,*，王東澍2，王甜甜2，馮爾玲2，朱力2，王恒樑2，彭清忠1，劉先凱2

1. 吉首大學(xué)，吉首 416000； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071； 3. 沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034

本課題組早期研究結(jié)果表明，炭疽芽胞桿菌BA2380蛋白可能與炭疽芽胞桿菌毒力有關(guān)，因而有必要對(duì)其功能進(jìn)行深入研究。選取炭疽芽胞桿菌A16D2株為出發(fā)菌株，以其BA2380基因?yàn)槟康娜笔Щ?，參照A16D2株基因組序列及質(zhì)粒pSET4s序列，利用軟件設(shè)計(jì)上下游同源臂及抗性基因引物，用本實(shí)驗(yàn)室改造的“Golden Gate”克隆方法將3個(gè)片段同時(shí)連入溫敏型穿梭載體pKMBK中(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的受體質(zhì)粒)，從而構(gòu)建基因打靶質(zhì)粒。將該基因打靶質(zhì)粒導(dǎo)入炭疽芽胞桿菌A16D2感受態(tài)細(xì)胞中，利用同源重組原理，篩選獲得炭疽芽胞桿菌A16D2BA2380基因缺失突變株，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果驗(yàn)證了本課題組構(gòu)建的“Golden Gate”克隆體系進(jìn)行多片段克隆的高效性，也為后續(xù)探索其基因功能奠定了基礎(chǔ)。

炭疽芽胞桿菌；Golden Gate克??；基因替換；同源重組

炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis，B.anthracis)是炭疽的病原體。其無(wú)鞭毛，有莢膜，屬革蘭陽(yáng)性菌。炭疽是由炭疽芽胞桿菌引起的人畜共患病，危害性極強(qiáng)，對(duì)人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。芽胞是炭疽芽胞桿菌傳播和感染的主要形式，其接觸皮膚傷口、消化道或呼吸道上皮后，引起感染并導(dǎo)致皮膚炭疽、腸道炭疽、肺炭疽等疾病[1-4]。2001年美國(guó)炭疽郵件事件的發(fā)生[5]，使人們認(rèn)識(shí)到如果將炭疽芽胞桿菌的芽胞用于生物恐怖襲擊會(huì)對(duì)社會(huì)穩(wěn)定構(gòu)成巨大威脅。此外，由于炭疽芽胞桿菌的芽胞具有制備方法簡(jiǎn)單、可長(zhǎng)時(shí)間保存、易于霧化形成氣溶膠、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前一些國(guó)家還將其作為生物武器來(lái)儲(chǔ)備[6]。因此，炭疽芽胞桿菌相關(guān)研究一直廣受關(guān)注。

本研究中的目標(biāo)蛋白BA2380是堿性絲氨酸蛋白酶。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，炭疽芽胞桿菌中的絲氨酸蛋白酶如htrA對(duì)其毒力的發(fā)揮必不可少。本課題組早期研究結(jié)果顯示，該蛋白在炭疽芽胞桿菌A16D2(pXO1+，pXO2-)中表達(dá)上調(diào)，在A16D1(pXO1-，pXO2+)和A16DD(pXO1-，pXO2-)菌株中表達(dá)下調(diào)，表明BA2380的表達(dá)受毒力大質(zhì)粒調(diào)控，可能與炭疽芽胞桿菌的毒力有關(guān)。本研究(嚴(yán)格按照生物安全規(guī)定操作)采用同源重組方法敲除炭疽芽胞桿菌A16D2(pXO1+，pXO2-)染色體上的BA2380基因，獲得帶抗性的缺失突變株A16D2ΔBA2380∷spc，不僅證明本課題組構(gòu)建的“Golden Gate”克隆體系在將多DNA片段克隆入一個(gè)載體中的簡(jiǎn)便性和高效性，還為BA2380后續(xù)的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，JM110感受態(tài)細(xì)胞為本室保存；炭疽芽胞桿菌A16D2為本室通過(guò)質(zhì)粒不相容原理構(gòu)建；pKMU7質(zhì)粒為本室構(gòu)建，其來(lái)源質(zhì)粒為pKSV7，是大腸埃希菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒，溫度敏感型，高拷貝，含有氨芐西林(ampicillin，Ap)抗性和氯霉素(chloramphenicol，Cm)抗性基因，為本室保存；pT-loxp∷spc質(zhì)粒，具有大觀霉素(spectinomycin，Spc)抗性。為能進(jìn)行以Ⅱs型限制性內(nèi)切酶BsaⅠ為基礎(chǔ)的“Golden Gate”克隆方法，將pKSV7質(zhì)粒中一個(gè)內(nèi)部BsaⅠ位點(diǎn)突變，從而獲得不含有BsaⅠ位點(diǎn)的pKSV7，命名為pKMU7(表1)。

1.2 主要試劑及引物

DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ購(gòu)自Fermentas公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒、T-easy試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Ap、Cm、Spc購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，溶菌酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，腦心浸液(brain heart infusion broth，BHI)購(gòu)自美國(guó)BD公司，同源重組酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司。引物合成(表2)和DNA測(cè)序由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)pT-loxp∷spc質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增spc序列的引物，根據(jù)炭疽芽胞桿菌A16D2株染色體上BA2380基因上下游序列，設(shè)計(jì)其上下游同源臂序列的引物(表2)。在UP-F/R、DN-F/R和Spc-F/R的兩端均含有BsaⅠ位點(diǎn)及設(shè)計(jì)好的4堿基突出接頭。

1.3 重組質(zhì)粒pK2380usd(pKMU7+BA2380UP+Spc+BA2380DOWN)的構(gòu)建

1.3.1 供體質(zhì)粒構(gòu)建 以pT-loxp∷spc質(zhì)粒為模板，以Spc-F和Spc-R為引物，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增spc；以A16D2基因組為模板，以UP-F/R和DN-F/R為引物，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增BA2380基因上下游同源臂(分別稱為UP片段和DOWN片段)。PCR條件如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系為50 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增的3個(gè)片段兩端均含有一個(gè)BsaⅠ位點(diǎn)。用PCR回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。純化回收的3個(gè)片段(UP、DOWN和Spc)，分別與T-easy載體相連，構(gòu)建3個(gè)重組質(zhì)粒(供體質(zhì)粒)，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建是否成功。將驗(yàn)證正確的重組載體分別命名為UP-T、DN-T和Spc-T。

1.3.2 受體質(zhì)粒構(gòu)建 受體質(zhì)粒pKMBK為本室構(gòu)建，過(guò)程簡(jiǎn)述如下。為能在炭疽芽胞桿菌中進(jìn)行基因替換操作，選用大腸埃希菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pKSV7為出發(fā)質(zhì)粒。首先對(duì)其全序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)BsaⅠ位點(diǎn)，為防止以后的酶切-連接體系中在此位點(diǎn)進(jìn)行酶切，用點(diǎn)突變?cè)噭┖惺乖撐稽c(diǎn)突變，獲得一個(gè)不含BsaⅠ位點(diǎn)的質(zhì)粒pKMU7。為使后期實(shí)驗(yàn)?zāi)苓M(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將一個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶的基因bgaB(受一個(gè)組成型啟動(dòng)子plcpB的調(diào)控)插入pKMU7多克隆位點(diǎn)中，在plcpB-bgaB的兩端插入BsaⅠ位點(diǎn)。這樣，在克隆體系中如果發(fā)生外源片段替換plcpB-bgaB，克隆會(huì)顯示白色，否則為藍(lán)色。為能進(jìn)行抗性篩選，需使受體質(zhì)粒與供體質(zhì)粒含有不同的抗性基因，本研究中使用的T-easy載體和pKMU7載體均為Ap抗性，因而將一個(gè)卡那霉素基因插入pKMU7中，成功構(gòu)建受體質(zhì)粒pKMBK。

表1 本研究相關(guān)質(zhì)粒和菌株

Tab.1 Strains and plasmids used in the experiment

StrainorplasmidRelevantgenotypeandcharacteristicsSourcepKSV7Shuttlevector,temperature-sensitive,AmprinE.coliandCmrinB.anthracis[8]pKMU7DerivedfrompKSV7bydestroyingaBsaⅠsiteinitThislabpMADShuttlevector,AprinE.coliandEmrinB.substilis,containingpclpB-bgaBfragment[9]pKD4ContainingkanamycinresistantgeneThislabpKMBKpclpB-bgaBfrompMADandkanamycinresistantgenefrompKD4wereclonedintandeminpKMU7ThislabUP-TTheupstreampartofthetargetgeneBA2380flankedwithBsaⅠenzymerec-ognitionsiteinsertionintoT-easyvectorThisworkDN-TThedownstreampartofthetargetgeneBA2380flankedwithBsaⅠenzymerecognitionsiteinsertionintoT-easyvectorThisworkSpc-TThespectinomycinresistancegeneflankedwithBsaⅠenzymerecognitionsiteinsertceintoT-easyvectorThisworkpK2380usdThethreeDNAfragmentsofUP-T,Spc-TandDN-TwereclonedintandemintotheacceptorvectorpKMBKusing“GoldenGate”cloningsystemThisworkpT-loxp∷spcThespectinomycingeneflankedwithloxpsitesinsertionintoT-easyvectorThislabDH5αF-,φ80d/lacZ⊿M15,⊿(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hs-dR17(r-k,m+k),phoA,supE44λ-,thi-1,gyrA96,relA1ThislabJM110psL(StrR),thr,leu,endA,thi-1,lacy,galK,galT,ara,tonA,tsx,dam-,dcm-,supE44(⊿lac-proAB),F'[traD36,proAB,lacIqlacZ⊿M15]ThislabA16D2DerivedfromA16byeliminatingthemega-plasmidpXO2usingplasmidincom-patibility;pXO1+;pXO2-Thislab

表2 本研究所用引物

Tab.2 The primers used in the experiment

PrimerSequence(5'→3')UP-FTTTGGTCTCATGACGAAGCTGGTTTAGGGAGTG(BsaⅠ)UP-RTTTGGTCTCACTCCGGTTAGGAACGTAATCAGTAGA(BsaⅠ)Spc-FTTTGGTCTCAGGAGCTAGTGTTCGTGAATACATG(BsaⅠ)Spc-RTTTGGTCTCACGATTATGCCGATAACTAG(BsaⅠ)DN-FTTTGGTCTCAATCGCAATACACAAATCCGCCAAA(BsaⅠ)DN-RTTTGGTCTCACCAAGATAGATGAGGGAACAATTCG(BsaⅠ)US-FGAGATATTAGCCACTTCCAAGUS-RGGTTCAGATACGACGACTASD-FTTATGGATTCGTCAGAGGAASD-RCGCTATAATATGAGGATGAGGIN-FGACTCCGAACGATCCATATIN-RAGCCGCAACAATAACAGApKSV7P2-FATGTGCTGCAAGGCGATTApKSV7P2-RCCCAGGCTTTACACTTTATG

1.3.3 采用“Golden Gate”克隆體系構(gòu)建重組打靶載體pK2380usd 采用“Golden Gate”克隆方法，用Ⅱs型限制性核酸內(nèi)切酶BsaⅠ和T4 DNA連接酶進(jìn)行目標(biāo)片段(UP、Spc、DOWN)與受體質(zhì)粒pKMBK的無(wú)縫連接，酶切-連接在同一個(gè)管中同步進(jìn)行。根據(jù)各質(zhì)粒濃度，得到20 μL的反應(yīng)體系：0.8 μL UP-T、0.8 μL Spc-T、0.7 μL DN-T、0.7 μL pKMBK、0.9 μLBsaⅠ、0.9 μLT4 DNA連接酶、2 μL CutSmart Buffer、2 μL ATP、11.2 μL H2O。此反應(yīng)全程于冰上操作。混合體系于37 ℃水浴30 min，然后50 ℃水浴5 min，最后80 ℃水浴5 min。取酶切-連接產(chǎn)物5 μL，加至40 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 輕柔混勻，冰浴30 min，42 ℃熱擊90 s，冰浴2 min，加入LB培養(yǎng)液1 mL，37 ℃振搖1 h，涂布在含卡那霉素(50 μg/mL)和X-Gal(40 μg/mL)的LB瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。選取白色菌落，用UP-F/R、DN-F/R和Spc-F/R 3對(duì)引物進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證3個(gè)片段UP、DOWN和Spc是否正確連接入受體質(zhì)粒pKMBK中。對(duì)PCR驗(yàn)證正確的克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)構(gòu)建成功，命名為pK2380usd。

1.4 打靶質(zhì)粒pK2380usd電轉(zhuǎn)化炭疽芽胞桿菌A16D2

將構(gòu)建成功的打靶質(zhì)粒(pK2380usd)首先轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM110中去甲基化，提取質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入A16D2(pXO1+，pXO2-)感受態(tài)細(xì)胞中(電轉(zhuǎn)條件為電壓6 kV/cm，電容25 μF，電阻500 Ω)；然后加入電轉(zhuǎn)復(fù)蘇液1 mL，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇3 h，涂于含Spc(300 μg/mL)的LB瓊脂平板上，30 ℃溫箱中過(guò)夜，挑取單克隆劃線培養(yǎng)；最后用pKSV7P2-F/R引物(其擴(kuò)增序列為pKSV7特有，A16D2基因組沒有)確定pK2380usd是否導(dǎo)入A16D2，鑒定正確的菌株命名為pK2380usd/A16D2。

1.5 突變株A16D2ΔBA2380∷spc的篩選

將pK2380usd/A16D2過(guò)夜培養(yǎng)菌液按1∶100轉(zhuǎn)接到5 mL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)42 ℃連續(xù)傳代5次，稀釋至10-3，涂至含有Spc(300 μg/mL)的LB瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。在平板上挑取單克隆，依次點(diǎn)含Cm(5 μg/mL)、Spc(300 μg/mL)的LB瓊脂平板，篩選僅在Spc板上而不在Cm板上生長(zhǎng)的克隆(SpcrCms)。將篩選到的陽(yáng)性克隆(SpcrCms)分別接種于含Cm和Spc的LB液體培養(yǎng)基，再次確認(rèn)克隆的SpcrCms表型。用1對(duì)內(nèi)部引物(IN-F/R)和2對(duì)外部引物(US-F/R、SD-F/R)驗(yàn)證BA2380是否敲除。內(nèi)部鑒定引物無(wú)擴(kuò)增條帶，而2對(duì)外部引物均有預(yù)期大小特異擴(kuò)增條帶的克隆為陽(yáng)性克隆，命名為A16D2ΔBA2380∷spc。

1.6 上清液中BA2380及保護(hù)性抗原(protective antigen, PA)和致死因子(lethal factor，LF)的表達(dá)

分別挑取A16D2和A16D2ΔBA2380∷spc單克隆，接種至含5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按1%轉(zhuǎn)接至含100 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)13 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期；上清液經(jīng)0.22 μm低蛋白結(jié)合濾器(Millipore)過(guò)濾，采用TCA法收取沉淀[10]。沉淀蛋白用含0.1%二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)(m/V)的8 mol/L尿素溶解后，取50 μL加入截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的超濾管中，13 000g離心。棄濾過(guò)液，加入含0.25%吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)(m/V)的8 mol/L尿素，避光靜置30 min。用50 mmol/L碳酸氫銨溶液洗去尿素(離心2～3次，棄濾過(guò)液，超濾管中留存體積約為20 mL)，加入10 ng/μL胰蛋白酶(modified，Roche)；酶解12 h后，使用新的離心收集管，離心收集濾過(guò)液即為供液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)/MS分析的肽段[11]。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用MaxQuant version 1.3.0.5進(jìn)行Lable-free定量分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 打靶質(zhì)粒pK2380usd的構(gòu)建

spc和BA2380 基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)

物經(jīng)1%瓊脂糖電泳顯示，擴(kuò)增片段大小為900 bp左右，與預(yù)期一致。3個(gè)供體質(zhì)粒UP-T、Spc-T和DN-T與受體質(zhì)粒pKMBK經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的“Golden Gate”克隆體系酶切-連接后，將產(chǎn)物涂布至含卡那霉素和X-Gal的LB瓊脂平板上，絕大多數(shù)克隆顯示白斑，只有很少的克隆顯示藍(lán)斑(圖1A)。挑選白斑，用UP-F/R、Spc-F/R和DN-F/R進(jìn)行菌落PCR，均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相同的特異條帶(圖1B)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，證明所構(gòu)建的打靶質(zhì)粒pK2380usd完全正確。

A: Culture was plated on LB X-Gal plates with kanamycin. White colonies have undergone the replacement ofpclpB-bgaBwith UP-Spc-DN DNA fragments. B: Identification of the recombinant pK2380usd with three pairs of primers UP-F/R, DN-F/R and Spc-F/R by PCR.

圖1 打靶質(zhì)粒pK2380usd的藍(lán)白斑篩選及PCR驗(yàn)證

Fig.1 Screening of the recombinant plasmid pK2380usd with blue-white cloning and PCR

2.2 A16D2ΔBA2380∷spc陽(yáng)性克隆的篩選和驗(yàn)證

將從JM110中提取的重組質(zhì)粒pK2380usd電擊轉(zhuǎn)化炭疽芽胞桿菌A16D2感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，并以炭疽芽胞桿菌A16D2基因組作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期一致，表明打靶質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入A16D2感受態(tài)細(xì)胞中。菌株被命名為pK2380usd/A16D2。

將pK2380usd/A16D2菌液接種至5 mL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)傳代5次，稀釋后涂布至含Spc的LB瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，在平板上挑取單克隆，經(jīng)Cm和Spc雙抗生素篩選，得到僅在Spc平板上而不在Cm平板上生長(zhǎng)的克隆(SpcrCms)(圖2A)。將篩選到的陽(yáng)性克隆(SpcrCms) 分別接種至含Cm和Spc的LB液體培養(yǎng)基，再次確認(rèn)克隆的SpcrCms表型。結(jié)果顯示，克隆在含Cm的LB培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，而在含Spc的LB培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)(圖2B)。分別用兩對(duì)外部引物(US-F/R、SD-F/R)和一對(duì)內(nèi)部引物(IN-F/R)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖3A)，并提取A16D2ΔBA2380∷spc基因組進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，兩對(duì)外部引物分別擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，內(nèi)部引物沒有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖3B)，與預(yù)期相符。對(duì)兩對(duì)外部引物擴(kuò)增出的 DNA 片段進(jìn)行測(cè)序， 結(jié)果表明所獲得的陽(yáng)性克隆已成功實(shí)現(xiàn)了重組，將獲得的克隆命名為A16D2ΔBA2380∷spc。

A: Transformants were screened at 30 ℃ on LB plate containing chloramphenicol or spectinomycin. All of the spectinomycin-resistant, chloramphenicol-sensitive colonies had the expected replacement of theBA2380 gene with spectinomycin resistance locus. B: Transformants were screened at 30 ℃ in LB broth containing chloramphenicol or spectinomycin. All of the spectinomycin-resistant, chloramphenicol-sensitive colonies had the expected replacement of theBA2380 gene with spectinomycin resistance locus.

圖2 雙抗生素(氯霉素和大觀霉素)篩選重組克隆

Fig.2 Screening of transformants at 30 ℃ on LB plate and in LB broth containing chloramphenicol or spectinomycin

對(duì)上清液中的BA2380蛋白用iBAQ(intensity-based absolute quantification)值進(jìn)行定量分析，野生株A16D2上清液中BA2380蛋白iBAQ值為19 800 000，且全序列范圍被多條肽段匹配(圖3C)， A16D2ΔBA2380∷spc的iBAQ值為0， 無(wú)匹配肽段(圖3D)。這證明BA2380在基因水平的缺失導(dǎo)致蛋白水平?jīng)]有表達(dá)。

A: The position of the primers on the chromosome. B: Identification of theBA2380 mutant strain by PCR with three pairs of primers. C: Peptide coverage of BA2380 in secretory proteome inB.anthracisA16D2. D: Label-free quantification of BA2380, PA and LF proteins between wild-type and mutant-type in secretory proteome (based on iBAQ values).

圖3BA2380缺失突變體鑒定結(jié)果

Fig.3 Identification of theBA2380 mutant strain

野生株A16D2上清液中LF蛋白的iBAQ值為265 760，而缺失株中iBAQ值為92 722，表達(dá)量明顯降低。野生株A16D2上清液中PA蛋白的iBAQ值為149 280，而缺失株中iBAQ值為63 858，表達(dá)量也有所下降(圖3D)。

3 討論

基因替換是研究基因功能的一個(gè)有效手段。在炭疽芽胞桿菌中，基因替換一般根據(jù)同源重組的原理進(jìn)行，將目標(biāo)基因上下游各一段DNA片段(一般為1 000 bp左右，稱為上、下游同源臂)與篩選標(biāo)記(一般為抗性基因)共同插入到溫敏型穿梭載體中，構(gòu)建同源打靶載體，然后將同源打靶載體導(dǎo)入炭疽芽胞桿菌中，使載體上的兩個(gè)同源臂分別與炭疽芽胞桿菌染色體上的同源片段發(fā)生兩次同源重組，使載體上的抗性基因替換炭疽芽胞桿菌染色體上的目標(biāo)基因，通過(guò)抗性篩選及PCR鑒定等方法最終確定基因替換的克隆。構(gòu)建同源重組打靶質(zhì)粒一般采用酶切、連接方法，使每個(gè)片段逐步連接和鑒定，非常耗時(shí)、耗力，有時(shí)也存在沒有合適位點(diǎn)使用的窘境。

Ⅱs型限制性內(nèi)切酶能在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)切割DNA片段，在5′端或3′端產(chǎn)生4堿基突出，這些突出可根據(jù)需要人為設(shè)計(jì)，理論上共有256種組合，扣除其中的16個(gè)回文序列，還有240種可供選擇。Engler等于2008年利用Ⅱs型限制性內(nèi)切酶的這些特性構(gòu)建了“Golden Gate”克隆方法[13]。該方法包括一個(gè)受體質(zhì)粒和多個(gè)供體質(zhì)粒，受體質(zhì)粒和每個(gè)供體質(zhì)粒插入片段的接頭都是設(shè)計(jì)好的，可實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接，且這種連接方法是將所有質(zhì)粒放在一個(gè)酶切-連接體系中，酶切與連接同時(shí)進(jìn)行。自“Golden Gate”克隆方法建立后，迅速應(yīng)用到多種細(xì)菌中，并被證明是一種非常高效的亞克隆方法[14-18]，但目前并未發(fā)現(xiàn)其在炭疽芽胞桿菌中應(yīng)用。本課題組參照Engler的“Golden Gate”克隆方法，構(gòu)建了能在炭疽芽胞桿菌中進(jìn)行基因替換的多DNA片段克隆方法。為能在炭疽芽胞桿菌中進(jìn)行基因替換的遺傳操作，選用溫敏型的大腸埃希菌-枯草芽胞桿菌穿梭載體pKSV7為骨架質(zhì)粒，構(gòu)建“Golden Gate”克隆體系中的受體質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行全序列分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)部BsaⅠ位點(diǎn)(本研究中將使用的一個(gè)Ⅱs內(nèi)切酶位點(diǎn))。為防止對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，本研究采用點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⒃撐稽c(diǎn)破壞；為能在后續(xù)篩選時(shí)使用藍(lán)白斑篩選，引入一個(gè)受組成型啟動(dòng)子調(diào)控的β-半乳糖苷酶基因，導(dǎo)入到骨架質(zhì)粒中。該基因兩端含有BsaⅠ位點(diǎn)，當(dāng)酶切-連接體系中供體質(zhì)粒攜帶的一系列片段按設(shè)計(jì)順序進(jìn)入受體質(zhì)粒后，將會(huì)替換β-半乳糖苷酶基因，使重組克隆顯示藍(lán)斑。為進(jìn)一步提高篩選效率，本研究在體系中引入抗性篩選標(biāo)記。在克隆體系中，供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒需含有不同的抗性基因才能進(jìn)行抗性篩選。本研究中的供體質(zhì)粒為T-easy載體，其非常易得，且PCR片段連接的操作步驟也非常簡(jiǎn)單。將所有目標(biāo)片段根據(jù)順序設(shè)計(jì)一套接頭(4堿基突出)，并在引物端加上BsaⅠ位點(diǎn)，將這些PCR片段直接連接入T-easy載體就完成了供體質(zhì)粒的構(gòu)建。但該載體含有Ap抗性，與供體質(zhì)粒相同。本實(shí)驗(yàn)室將一個(gè)卡那霉素抗性基因?qū)牍w質(zhì)粒，由此供本研究使用的“Golden Gate”克隆體系構(gòu)建成功。用此系統(tǒng)進(jìn)行多DNA片段克隆時(shí)，唯一需要做的就是將T-easy載體里的片段換成將要連接的片段，操作非常簡(jiǎn)單。

本實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果顯示，堿性絲氨酸蛋白酶BA2380可能具有兩方面的功能：與S層蛋白的降解及炭疽芽胞桿菌的毒力相關(guān)。基于此猜想，本研究采用以上構(gòu)建的“Golden Gate”克隆體系成功構(gòu)建了用于基因替換的打靶質(zhì)粒pK2380usd，這也驗(yàn)證了該克隆系統(tǒng)不僅操作簡(jiǎn)單，而且非常高效。然后，將打靶質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至炭疽芽胞桿菌A16D2中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該基因的替換。對(duì)上清液蛋白質(zhì)組進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌毒力大質(zhì)粒編碼的兩個(gè)重要毒力蛋白PA和LF在缺失BA2380的菌株中分泌量下降，因此BA2380可能與炭疽芽胞桿菌毒力相關(guān)。但在上清液蛋白質(zhì)組中沒有鑒定到另一重要毒力蛋白——水腫因子(edema factor，EF)，這可能是由于樣品制備條件并非毒力發(fā)揮的最佳條件，也可能是由于MS鑒定覆蓋率不足。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)BA2380缺失后的毒力蛋白分泌變化進(jìn)行深入研究。

[1] Hanna P. Anthrax pathogenesis and host response [J]. Curr Top Microbiol Immunol, 1998, 225: 13-35.

[2] Dixon TC, Meselson M, Guillemin J, Hanna PC. Anthrax [J]. N Engl J Med, 1999, 341(11): 815-826.

[3] Mock M, Fouet A. Anthrax [J]. Annu Rev Microbiol, 2001, 55: 647-671. doi:10.1146/annurev.micro.55.1.647.

[4] Koehler TM. Bacillus anthracis genetics and virulence gene regulation [J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2002, 271: 143-164.

[5] Bush LM, Abrams BH, Beall A, Johnson CC. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States [J]. N Engl J Med, 2001, 345(22): 1607-1610.

[6] Inglesby TV, O’Toole T, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, Friedlander AM, Gerberding J, Hauer J, Hughes J, McDade J, Osterholm MT, Parker G, Perl TM, Russell PK, Tonat K; Working Group on Civilian Biodefense. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management [J]. JAMA, 2002, 287(17): 2236-2252.

[7] Chitlaru T, Zaide G, Ehrlich S, Inbar I, Cohen O, Shafferman A. HtrA is a major virulence determinant of Bacillus anthracis [J]. Mol Microbiol, 2011, 81(6): 1542-1559.

[8] Smith K, Youngman P. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specific expression of the Bacillus subtilis spoIIM gene [J]. Biochimie, 1992, 74(7-8): 705-711.

[9] Arnaud M, Chastanet A, Débarbouillé M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(11): 6887-6891.

[10] 王玉飛, 曲勍, 喬鳳, 鐘志軍, 杜昕穎, 汪舟佳, 陳澤良, 黃留玉. 羊布魯氏菌的分泌蛋白質(zhì)組分析 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(8): 1150-1157.

[11] Gao Z, Wang Z, Zhang K, Li Y, Zhang T, Wang D, Liu X, Feng E, Chang L, Xu J, He S, Xu P, Zhu L, Wang H. Experimental validation of Bacillus anthracis A16R proteogenomics [J]. Sci Rep, 2015, 5: 14608. doi: 10.1038/srep14608.

[12] Schwanh?usser B, Busse D, Li N, Dittmar G, Schuchhardt J, Wolf J, Chen W, Selbach M. Global quantification of mammalian gene expression control [J]. Nature, 2011, 473(7347): 337-342.

[13] Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability [J]. PLoS One, 2008, 3(11): e3647.

[14] Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes [J]. PLoS One, 2009, 4(5): e5553.

[15] Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs [J]. PLoS One, 2011, 6(2): e16765.

[16] Emami S, Yee MC, Dinneny JR. A robust family of Golden Gate Agrobacterium vectors for plant synthetic biology [J]. Front Plant Sci, 2013, 4: 339. doi: 10.3389/fpls.2013.00339.

[17] Terfrüchte M, Joehnk B, Fajardo-Somera R, Braus GH, Riquelme M, Schipper K, Feldbrugge M. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi [J]. Fungal Genet Biol, 2014, 62: 1-10. doi: 10.1016/j.fgb.2013.10.012.

[18] Vad-Nielsen J, Lin L, Bolund L, Nielsen AL, Luo Y. Golden Gate Assembly of CRISPR gRNA expression array for simultaneously targeting multiple genes [J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(22): 4315-4325.

s. PENG Qingzhong, E-mail: qzpengjsu@163.com; LIU Xiankai, E-mail: liuxk007@163.com

Construction ofBA2380 deletion mutant ofBacillusanthracisstrain A16D2

JIA Shuhua1,2,*, CHEN Nan2,3,*，WANG Dongshu2, WANG Tiantian2, FENG Erling2, ZHU Li2, WANG Hengliang2, PENG Qingzhong1, LIU Xiankai2

1. Jishou University, Jishou 416000, China; 2. Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China; 3. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China

The early results of our laboratory showed that BA2380 protein may be related to the virulence ofBacillusanthracis(B.anthracis). The goal of this study is to knock out theBA2380 gene inB.anthracisA16D2 strain. The downstream and upstream sequences ofBA2380 and spectinomycin resistance gene (spc) were obtained with polymerase chain reaction (PCR) respectively and used in the construction of plasmid pK2380usd for gene replacement. pK2380usd was introduced intoB.anthracisA16D2 competent cells, and theBA2380 gene deletion was obtained by antibiotic screening and PCR identification. The results laid a foundation for the subsequent exploration of gene function.

Bacillusanthracis; “Golden Gate” cloning; Gene replacement; Homologous recombination

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271785、81601739)

彭清忠，劉先凱

2016-12-20)

*同為第一作者